康燁 王瑞娜 閻瀾

(1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科, 沈陽(yáng) 110016; 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)軍特藥研究中心， 上海 200433)

真菌感染在過去的幾十年間增長(zhǎng)迅速，其主要原因是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步(器官移植和化療)和HIV感染全球流行等原因造成易感染免疫受損人群增加[1]。目前可用的抗真菌藥物主要分為唑類、多烯類、棘白菌素類、丙烯胺類和氟胞嘧啶類。這些抗真菌藥物通常以麥角甾醇生物合成途徑、真菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或真菌DNA/RNA為靶點(diǎn)[2]。問題是，這些抗真菌藥物在毒性、活性譜、安全性和藥代動(dòng)力學(xué)特性方面存在各種缺點(diǎn)[3]。此外，隨著這些抗真菌藥物的長(zhǎng)期大規(guī)模應(yīng)用，耐藥率也有了顯著的提高[4]。因此，尋找新的抗真菌藥物，制定新的策略來對(duì)抗真菌感染是至關(guān)重要的。本文就真菌特異性或高選擇性靶點(diǎn)及相關(guān)化合物，按照不同作用機(jī)制做一綜述。

1 真菌細(xì)胞壁合成

真菌細(xì)胞壁是一個(gè)高度變化的結(jié)構(gòu)，主要參與多種形態(tài)發(fā)生過程、細(xì)胞生長(zhǎng)、胞質(zhì)分裂和特殊類型真菌細(xì)胞發(fā)育[5]。真菌感染過程中，細(xì)胞壁是病原體與宿主建立聯(lián)系，產(chǎn)生致病性和毒力的重要因素[6]。

糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白廣泛存在于真菌細(xì)胞壁上，在真菌與宿主細(xì)胞的黏附中起著重要作用。肌醇?；D(zhuǎn)移酶(Gwt1)催化GPI錨定蛋白生物合成途徑的早期步驟，是manogepix(MGX,PX001A)的作用靶點(diǎn)[7]，該酶與最接近的哺乳動(dòng)物直系同源物顯示出低同源性(<30%氨基酸序列同一性)[8]。抑制Gwt1可阻止甘露糖蛋白的正確定位[9]，損害真菌細(xì)胞壁完整性，抑制生物膜產(chǎn)生及菌絲形成，造成嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷[10]。manogepix(APX001A)可抑制真菌Gwt1但對(duì)人類Gwt1同源物Pig-W沒有作用[11]，這表明該化合物對(duì)真菌細(xì)胞具有選擇性。fosmanogepix(APX001)是manogepix的前體藥，在I期臨床研究中，其口服或靜脈給藥均有良好的耐受性[12]，目前正在進(jìn)行侵襲性念珠菌病的II期臨床試驗(yàn)。manogepix對(duì)念珠菌屬和曲霉菌的體外活性研究表明，這種新的抗真菌化合物對(duì)白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等均具有較低的最低抑菌濃度(MIC)，對(duì)新生隱球菌也具有較高活性[1]。Gebremariam等[14]在構(gòu)建中性粒細(xì)胞減少性鼠毛霉病模型中發(fā)現(xiàn)，給予藥物fosmanogepix(104mg/kg)組的小鼠，其組織清除率及存活率與使用藥物艾沙康唑硫酸酯(ISA)相當(dāng)，該結(jié)果為fosmanogepix成為抗毛霉病的治療藥物提供了進(jìn)一步支持。

2 線粒體功能抑制

線粒體是真核細(xì)胞的動(dòng)力源，通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化作用產(chǎn)生大部分細(xì)胞ATP庫(kù)。線粒體在能量代謝中的作用包括氨基酸和磷脂的合成，磷脂與呼吸一起控制衰老、毒力和抗真菌藥物耐藥性等過程[15]。盡管真菌和人類的線粒體基因組具有高度相似性，但真菌特異性蛋白(如酵母Nuo1和Nuo2)有望成為選擇性抗真菌制劑的開發(fā)目標(biāo)[16]。

2.1 活性氧

氧化損傷內(nèi)源性活性氧(ROS)是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，主要在線粒體中產(chǎn)生[17]。ROS的過量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的損傷[18-19]。從紫蘇及香茅屬植物中提取的抗真菌天然單萜類紫蘇醛、香茅醛可以引起白念珠菌中ROS的積累，從而導(dǎo)致白念珠菌細(xì)胞壞死，線粒體功能障礙和DNA損傷[20]。熱穩(wěn)定抗真菌因子HSAF(heat-stable antifungal factor)是產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有大環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，可通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生促使白念珠菌凋亡[21]。

2.2 T-2307

芳基胺T-2307，體外對(duì)念珠菌、曲霉和隱球菌具有殺菌活性，可預(yù)防小鼠的播散性感染[22]，該化合物由真菌細(xì)胞通過高親和力的精胺和亞精胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取，可抑制整個(gè)酵母細(xì)胞和分離的酵母細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈復(fù)合物III和IV，破壞線粒體膜電位[23]，但對(duì)大鼠肝線粒體功能幾乎沒有影響[24]，這是選擇性破壞酵母線粒體功能和抗真菌活性的關(guān)鍵[25]。T-2307對(duì)念珠菌有很強(qiáng)的體內(nèi)、外活性，包括耐唑類和棘白菌素類的念珠菌屬、新生隱球菌等[26]。T-2307的體外活性遠(yuǎn)優(yōu)于氟康唑、伏立康唑、米卡芬凈和兩性霉素B；對(duì)曲霉菌屬的體外活性與米卡芬凈和伏立康唑的活性相當(dāng)[27]。

3 代謝途徑

3.1 乙醛酸循環(huán)

乙醛酸循環(huán)是對(duì)三羧酸循環(huán)(TCA)的一種修改，它允許使用兩種碳源，繞過TCA循環(huán)的CO2生成步驟，使碳被保留為糖異生的底物。該循環(huán)對(duì)攝取和利用不可發(fā)酵的碳源(如乙醇、脂肪酸)至關(guān)重要，使真菌細(xì)胞能夠適應(yīng)并在宿主營(yíng)養(yǎng)條件有限的情況下生存[28]。

異檸檬酸裂解酶(ICL)和麥芽酸合成酶是乙醛酸循環(huán)中涉及的關(guān)鍵酶，其中ICL是真菌產(chǎn)生毒力的必需酶[29]，不存在于人類基因組中，為針對(duì)這一代謝途徑的新型抗真菌藥物的設(shè)計(jì)開辟了新的前景。ICL抑制劑對(duì)不同種類真菌具有高活性并對(duì)白念珠菌在巨噬細(xì)胞吞噬后的存活至關(guān)重要。宿主感染期間，病原微生物如煙曲霉、白念珠菌等可引起乙醛酸循環(huán)上調(diào)[30]。

3.2 鈣調(diào)磷酸酶

真菌對(duì)棘白菌素類耐藥性的產(chǎn)生，除FKS基因突變外，真菌細(xì)胞內(nèi)的多種途徑應(yīng)激反應(yīng)被激活也是主要原因之一，包括蛋白激酶C(PKC)、鈣調(diào)磷酸酶和分子伴侶Hsp90介導(dǎo)的細(xì)胞壁完整性信號(hào)的激活，這對(duì)真菌適應(yīng)棘白菌素類環(huán)境并引發(fā)代償機(jī)制，如幾丁質(zhì)合成酶的上調(diào)至關(guān)重要[31-32]。

鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定、細(xì)胞周期、形態(tài)轉(zhuǎn)變、交配和胞質(zhì)分裂[33]。抑制鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)傳導(dǎo)是一種新策略，既能減弱真菌毒力，又能提高現(xiàn)有抗真菌藥物的有效性，同時(shí)抑制真菌的耐藥性[34]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑FK506(他克莫司)對(duì)多種致病真菌具有活性。FK506由于具有較強(qiáng)的免疫抑制活性，不能作為抗真菌化合物使用，但已開發(fā)出幾種具有較低細(xì)胞毒性和免疫抑制活性的FK506類似物(9D-、9DP-、31OD-、9D31OD-FK506)。除9DP-FK506外，這些類似物對(duì)煙曲霉、白念珠菌和新生隱球菌都顯示出有效的抗真菌活性，而31OD-和9D31OD-FK506也與氟康唑具有協(xié)同作用。在系統(tǒng)性隱球菌病小鼠模型中，9D31OD-FK506與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用顯著延長(zhǎng)了受感染小鼠的存活時(shí)間[35]。此外，Juvvadi等[36]用乙酰肼取代FK506的C22羰基，開發(fā)出一種FK506類似物APX879，該化合物在侵襲性真菌感染的小鼠模型中，表現(xiàn)出較低的免疫抑制和廣譜抗真菌活性。

3.3 熱休克蛋白Hsp90

Hsp90是一種重要的、高度保守的分子伴侶，可促進(jìn)蛋白核糖核酸折疊、組裝和成熟。Hsp90抑制劑與唑類和棘白菌素類藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)白念珠菌的抗真菌活性具有潛在的協(xié)同作用[37]。Hsp90通過其關(guān)鍵的下游效應(yīng)器—鈣調(diào)磷酸酶和MKC1激酶調(diào)節(jié)唑類耐藥[38]。白念珠菌Hsp90功能受損導(dǎo)致生物膜對(duì)唑類耐藥性消失，此外，Hsp90表達(dá)減少導(dǎo)致基質(zhì)葡聚糖水平顯著降低[39]。目前，Hsp90抑制劑因其對(duì)宿主的毒性作用，不能作為抗真菌藥物使用，但Whitesell等[40]通過對(duì)白念珠菌Hsp90的核苷酸結(jié)合域(NBD)的研究，合成了對(duì)真菌Hsp90—NBD具有選擇性的抑制劑，這為Hsp90抑制劑成為低細(xì)胞毒性的抗真菌藥物提供了可行性。

4 表觀遺傳抑制

表觀遺傳是指在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)，包括DNA甲基化、RNA干擾、組蛋白質(zhì)修飾、染色質(zhì)改型。Torres-Garcia等[41]研究發(fā)現(xiàn)，真菌細(xì)胞可以通過改變DNA的包裝方式即表觀遺傳變化，而非DNA序列來產(chǎn)生抗藥性。

4.1 組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶/脫乙?；?/h3>

真菌蛋白質(zhì)乙酰化是通過在賴氨酸殘基的Nε-氨基中加入乙?；?，消除該氨基酸的正電荷而發(fā)生的。這種修飾可通過影響蛋白質(zhì)的催化活性、與其他蛋白質(zhì)相互作用的能力或其亞細(xì)胞定位而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變[42]。目前鑒定出乙酰化程度最高的蛋白質(zhì)組來自紅色毛癬菌(23.3%)、解脂耶氏酵母(22.1%)、釀酒酵母(19.6%)、新生隱球菌(19.60%)和煙曲霉(23.90%)[43-45]。在釀酒酵母和解脂耶氏酵母這兩種非致病真菌中，大多數(shù)乙酰化蛋白分別參與葡萄糖/氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)[45]，而白念珠菌中乙?；牡鞍撞粌H參與糖酵解和氧化磷酸化，還與組蛋白乙?；嘘P(guān)，包括與白念珠菌毒力相關(guān)的H3K56ac[46]。對(duì)新生隱球菌、煙曲霉和白念珠菌的研究顯示，40%的致病性相關(guān)因子被乙酰化，表明它們的功能可能受到組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶的影響[43]。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶家族分為三類：GNAT(與Gcn5相關(guān)的N-乙?；D(zhuǎn)移酶)，MYST(MOZ，Ybf2 / Sas3，Sas2，Tip60)和p300 / CBP(300 kDa蛋白和CREB結(jié)合蛋白)，其中MYST家族僅存在于真核細(xì)胞，p300 / CBP為后生動(dòng)物所特有[47]。Rtt109是真菌特異性的組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶[46]。

組蛋白脫乙?；?histone deacetylases, HDACs)是一種去除核心組蛋白賴氨酸殘基的酶，它控制基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)并對(duì)一些非組蛋白(如Hsp90)具有調(diào)控作用[48]。MGCD290是一種抑制真菌HDACs2的新型抗真菌藥物[49]，該藥物以組蛋白脫乙?；?HDACs)為靶點(diǎn)，抑制其對(duì)蛋白的脫乙酰作用，這些蛋白對(duì)真菌病原體毒力、耐藥性和形態(tài)轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)(通常使轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)下調(diào))起關(guān)鍵作用[50]。MGCD290與其他抗真菌藥物如唑類、棘白菌素類具有協(xié)同作用[51]。在抗突變菌株中，MGCD290可降低MICs，恢復(fù)真菌對(duì)藥物的敏感性[52]。

4.2 溴結(jié)構(gòu)域(BD)

溴結(jié)構(gòu)域和末端外結(jié)構(gòu)域(BET)家族蛋白是與染色質(zhì)相關(guān)的因子，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)重塑[53-54]。BET蛋白通過其兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域(BD：BD1和BD2)與染色質(zhì)結(jié)合，從而識(shí)別特定的乙?；M蛋白[55]。研究表明，小分子抑制劑，如JQ1、I-BET和I-BET762，不僅對(duì)BET BDs具有高親和力，而且具有高特異性[56]。這使得BET家族蛋白成為癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥等主要疾病的重要治療靶點(diǎn)[55]，以此來開發(fā)可通過抑制乙酰化染色質(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的抑制劑[57]。釀酒酵母的BET蛋白Bdf1是一種全面轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)500多個(gè)基因，Bdf1的破壞導(dǎo)致嚴(yán)重的形態(tài)變化和生長(zhǎng)缺陷。Mietton等[53]研究顯示，BDF1對(duì)白念珠菌是至關(guān)重要的，其突變體表現(xiàn)出體外活力的喪失以及體內(nèi)毒力降低。小分子抑制劑(如二苯并噻嗪酮、咪唑吡啶)可以選擇性地靶向白念珠菌Bdf1中的BD1和BD2，而不會(huì)損害人的BET-BD功能。這些發(fā)現(xiàn)為 Bdf1 BDs抑制劑作為一類新型抗真菌藥物奠定了基礎(chǔ)。

5 毒力相關(guān)因子

5.1 鐵元素

鐵是多種蛋白質(zhì)不可或缺的輔助因子，是真菌細(xì)胞呼吸和DNA合成等多種代謝過程的先決條件，是重要的毒力因子。真菌細(xì)胞在鐵含量足夠高時(shí)，定植和擴(kuò)散更加明顯[58]。

VL-2397(ASP2397)是從桃色頂孢霉菌中分離出的環(huán)六肽，在結(jié)構(gòu)上與低分子量鐵載體鐵鉻相似[59]。Nakamura等[60]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加0.03 mmol/L的鐵可使煙曲霉的VL-2397 MIC從1增加到2 mg/L，而添加鐵螯合劑BPS可將VL-2397的MIC從1降低到0.06 mg/L；這一結(jié)果表明，VL-2397的活性受鐵的有效性影響。盡管其特定的細(xì)胞靶點(diǎn)尚不清楚，但它是由人類細(xì)胞中不存在的鐵載體蛋白(Sit1)轉(zhuǎn)運(yùn)至真菌細(xì)胞，特別是煙曲霉，繼而觸發(fā)一種有效和快速的抗真菌作用，缺乏Sit1的煙曲霉細(xì)胞對(duì)VL-2397表現(xiàn)出抗性。此外，活細(xì)胞成像表明VL-2397可導(dǎo)致菌絲延長(zhǎng)停止[61]，且與現(xiàn)有藥物相比，它顯示出快速的抑制作用(在最初的2～4 h內(nèi))和有效的體外抗菌絲伸長(zhǎng)的殺菌活性[62]。

5.2 白念珠菌毒素

一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞溶解性肽毒素，念珠菌溶血素(candidalysin)，由ECE1基因(該基因是菌絲形成后表達(dá)最多的基因之一)編碼，是白念珠菌重要的毒力因子，它通過破壞宿主的免疫細(xì)胞膜來對(duì)抗巨噬細(xì)胞的抗菌活性；同時(shí)，candidalysin刺激活化蛋白1(AP-1)的轉(zhuǎn)錄因子C-FOS(通過P38有絲分裂活化蛋白激酶MAPK)和MAPK磷酸酶MKP1(通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2[ERK1/2]-MAPK)，觸發(fā)和調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子反應(yīng)[63]。在致病過程中，candidalysin通過鉀外排觸發(fā)NLRP3炎癥依賴性caspase-1激活，并作為宿主巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞非炎癥依賴性細(xì)胞溶解的主要促進(jìn)劑[64]。這些研究表明candidalysin既作為毒力因子促進(jìn)真菌的免疫逃逸，又可作為無毒力因子助力抗真菌的免疫應(yīng)答[65]。

5.3 群體感應(yīng)分子

群體感應(yīng)分子法尼醇對(duì)生物膜的形成至關(guān)重要，當(dāng)法尼醇積累到一定閾值水平，可阻礙白念珠菌酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變，抑制生物膜形成。此外，外源性法尼醇也可通過抑制翻譯來限制釀酒酵母的生長(zhǎng)及白念珠菌的菌絲形成[66]。Kovavs等[67]已證實(shí)，法尼醇可增強(qiáng)棘白素類對(duì)假絲酵母念珠菌生物膜的活性。除形態(tài)轉(zhuǎn)化，法尼醇還影響酵母其他生化途徑，如通過積聚活性氧來破壞基本細(xì)胞的麥角甾醇生物合成或觸發(fā)凋亡途徑[68]。

6 總結(jié)與展望

過去十年，真菌病原體的感染率與耐藥性不斷增加，但抗真菌治療藥物的進(jìn)展有限，大多數(shù)最近批準(zhǔn)或正在開發(fā)的藥物是由唑類和棘白菌素的衍生物組成，致使臨床抗真菌治療仍然受到阻礙。本文所述的抗真菌藥物靶點(diǎn)及化合物，特別是一些真菌特異性的蛋白、途徑及小分子抑制劑，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)出低毒性、良好的藥理學(xué)特性和更廣泛的活性譜。對(duì)它們進(jìn)一步的深入研究有望加速新型抗真菌藥物的更新，為臨床提供更多的選擇。