白念珠菌生物膜相關(guān)基因?qū)δ退幮缘挠绊?/h1>
2021-04-12 13:29郭曉宇李小靜
中國真菌學(xué)雜志 2021年6期
郭曉宇 李小靜
(1.河北工程大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，邯鄲 056002；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，邯鄲 056002)
念珠菌屬于人體正常生物菌群，可寄居于人的口腔、皮膚、陰道等部位。當(dāng)宿主免疫功能缺陷及致病菌毒力增強(qiáng)，白念珠菌可能引起淺部或深部真菌感染。生物膜形成能力是白念珠菌一種重要的致病毒力因子。成熟生物膜具有超強(qiáng)黏附力和復(fù)雜的自身結(jié)構(gòu)，可黏附于植入式的醫(yī)療器械上，阻止了抗菌藥物的滲透，逃避機(jī)體的免疫殺傷作用，促進(jìn)生物膜再生成，不僅為真菌的持續(xù)感染提供條件，同時在真菌耐藥性中發(fā)揮重要作用，這為真菌感染治療帶來重大挑戰(zhàn)。目前對于白念珠菌生物膜研究更為細(xì)致，通過對生物膜結(jié)構(gòu)合成相關(guān)基因調(diào)控和耐藥性發(fā)揮的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納，可對真菌生物膜致病、耐藥機(jī)制有更進(jìn)一步的認(rèn)識。
1 生物膜的組成結(jié)構(gòu)
真菌生物被膜(biofilm)是由細(xì)胞外基質(zhì)包裹著的，含有孢子、菌絲和假菌絲3種細(xì)胞形態(tài)的高度致密三維網(wǎng)狀系統(tǒng)，利于細(xì)胞與介質(zhì)間相互黏著。其形成過程大致分4個階段：早期酵母細(xì)胞以芽孢的形式黏附形成單層結(jié)構(gòu)；中期在胞外聚合物作用下，浮游真菌細(xì)胞黏合形成基底層；成熟期細(xì)胞外基質(zhì)的不斷積累將真菌3種形態(tài)細(xì)胞完全包裹，最終發(fā)育為成熟的生物膜[1]。最后一步，成熟的生物膜發(fā)生解離，酵母細(xì)胞脫落釋放，表現(xiàn)出更高的黏附力，游離并附著于周圍物體表面進(jìn)而形成新的生物膜[2]。生物膜結(jié)構(gòu)中含有的核酸、金屬離子、脂質(zhì)等物質(zhì)相互作用，使生物膜細(xì)胞間連接更加緊密。黏附、生長、成熟、釋放、再生，這是一個連續(xù)不斷的過程。
2 生物膜形成相關(guān)基因及耐藥性
白念珠菌的生物膜形成過程錯綜復(fù)雜，黏附及菌絲的延伸、胞外基質(zhì)產(chǎn)生，以及成熟后生物膜的物質(zhì)代謝、膜泵作用等環(huán)節(jié)均需多種基因調(diào)控參與完成。這些基因調(diào)控同時可能導(dǎo)致生物膜耐藥性產(chǎn)生。
2.1 黏附和菌絲合成基因及耐藥
白念珠菌生物膜形成的早期，為酵母細(xì)胞附著于機(jī)體黏膜或某些植入式器械上，此時黏附蛋白的高表達(dá)在真菌生物膜黏附過程中發(fā)揮重要作用。目前主要的黏附蛋白Als家族、Hwp1、Eap1、Rbt1、Ywp1是增加細(xì)胞間黏附，促進(jìn)生物膜的形成不可或缺的[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Bcr1、Snf5、Ace2 、Rob1、Tec1、Ndt80均存在于控制生物膜黏附作用的轉(zhuǎn)錄通路中，通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)，正向促進(jìn)黏附過程，對生物被膜形成發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]；小部分負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Rfx2、Sfp1、Zcf32抑制Als、Hwp家族表達(dá)，以及轉(zhuǎn)錄因子Gal4對生物膜新陳代謝的調(diào)節(jié)，均影響細(xì)胞間黏附，調(diào)節(jié)生物膜的形成[10-12]。此外，MAPK和cAMP-PKA兩條重要信號通路在黏附過程中發(fā)揮調(diào)控作用。MAPK通路中轉(zhuǎn)錄因子Brg1通過影響Hog1介導(dǎo)的Tor1激酶，抑制黏附基因ALS1、ALS3和HWP1表達(dá)[8]； cAMP-PKA通路中的靶轉(zhuǎn)錄因子Efg1在生物膜生長后期誘導(dǎo)ALS1表達(dá)[9]，促進(jìn)白念珠菌生物膜黏附作用。
菌絲態(tài)可逃避吞噬，有更強(qiáng)的毒力和適應(yīng)力，對于維持生物膜完整性和耐藥性發(fā)揮不容小覷。菌絲的延伸易受到調(diào)節(jié)基因BCR1、EFG1、CPH1、HGC1、FLO8、UME6的正向作用，以及TUP1、NRG1和RFG1的負(fù)性調(diào)節(jié)[10,15-17]。信號通路MAPK和Ras1-cAMP-PKA在白念珠菌菌絲生成過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。MAPK家族的Mkc1和Cek1激活轉(zhuǎn)錄因子Cph1，Ras1激活cAMP-PKA通路中Cyr1后誘導(dǎo)Efg1磷酸化，二者均在正向調(diào)控生物膜中菌絲態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，利于真菌生物膜的形成[13]。C.albicans同源基因DFG5和DCW1在生物膜形成中，通過調(diào)節(jié)Hog1 MAPK信號機(jī)制，從而促進(jìn)菌絲形成，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性[14]。此外，真菌細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換與黏附作用密不可分。Bcr1調(diào)節(jié)ALS3和HWP1的過度表達(dá)，Efg1調(diào)控下游ALS1表達(dá)，既可調(diào)控細(xì)胞間的黏附作用，同時誘導(dǎo)菌絲發(fā)育而促進(jìn)真菌生物膜的形成[19]。
在微生物生物膜對抗菌藥物的耐藥性研究中，微生物的耐藥性與生物膜的黏附和菌絲形成能力有關(guān)，說明可能誘導(dǎo)黏附素和菌絲生成的基因均可對生物膜的耐藥現(xiàn)象有一定影響。例如，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑KF506和環(huán)孢素A(CsA)通過誘導(dǎo)ALS3和HWP1的低表達(dá)，抑制生物膜的黏附和菌絲的生成，臨床上可協(xié)同氟康唑發(fā)揮抗真菌作用[18]，提示黏附因子和菌絲生成調(diào)控基因的過度表達(dá)可能為真菌生物膜重要的耐藥機(jī)制。聞軼旸等[20]研究發(fā)現(xiàn)，HOG1基因缺陷株對氟康唑更為敏感，表明Hog-MAPK信號通路中部分基因和蛋白表達(dá)的降低可能使耐藥性發(fā)生改變。此外，Hsp90也可影響?zhàn)じ降鞍谆虮磉_(dá)和MAPK和Ras1-cAMP-PKA通路，作用于菌絲形成過程，維持細(xì)胞壁的完整性，從而發(fā)揮對常規(guī)抗真菌藥的耐藥性[21]。
2.2 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成基因及耐藥
細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、DNA組成的混合結(jié)構(gòu)，可為生物膜細(xì)胞生長提供結(jié)構(gòu)框架和保護(hù)作用。ECM通過輔助真菌細(xì)胞對抗宿主免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞間黏附，以及發(fā)揮屏障作用阻止或延遲藥物滲入，在白念珠菌的耐藥性中發(fā)揮顯著作用。FKS1、BGL2、PHR1/2、XOG1在生物膜ECM中編碼β-1,3-葡聚糖合成關(guān)鍵酶，SKN1和KRE1參與合成β-1、6-葡聚糖，SRB1編碼甘露聚糖合成關(guān)鍵酶，這些基因特異性表達(dá)多糖合成關(guān)鍵酶，調(diào)控白念珠菌生物膜ECM中多糖的產(chǎn)生和分泌[22-25]，對ECM成熟、維持生物膜結(jié)構(gòu)完整性和輔助生物膜耐藥性發(fā)揮均起到重要作用。在ECM形成過程中，轉(zhuǎn)錄因子Zap1具有十分重要的作用。Zap1可負(fù)向調(diào)節(jié)胞外可溶性β-1,3-葡聚糖分泌，調(diào)控生物膜生成代謝過程，是調(diào)節(jié)體內(nèi)生物膜ECM生成的重要成分[23]。分子伴侶Hsp90也被發(fā)現(xiàn)是產(chǎn)生基質(zhì)葡聚糖所必需因子之一[28]。除分泌多糖外，細(xì)胞外基質(zhì)DNA(eDNA)也是生物膜形成的重要因素之一。eDNA誘導(dǎo)ECM生成并貫穿生物膜生長所有階段，破壞eDNA將影響生物膜的骨架結(jié)構(gòu)，反之，添加外源性eDNA可促進(jìn)增厚生物膜ECM的形成[24]。
ECM在抗真菌藥物的耐藥發(fā)揮中，主要通過胞外β-葡聚糖合成的關(guān)鍵酶與唑類抗真菌藥結(jié)合，阻止藥物滲入生物膜內(nèi)部，而不能到達(dá)靶點發(fā)揮藥物活性作用。參與此過程的主要為Fks1和Srb1通路[22,25]，誘導(dǎo)多糖關(guān)鍵酶合成參與構(gòu)成ECM耐藥。此外，fks1和/或fks2基因點突變，也可導(dǎo)致真菌對棘白菌素類抗真菌藥敏感性下降[45]。在生物膜形成中晚期，SKN1和KRE1表達(dá)上調(diào)，可誘導(dǎo)真菌生物膜對兩性霉素B耐受[26]。轉(zhuǎn)錄因子Zap1通過負(fù)調(diào)控于多糖生成過程中的葡糖淀粉酶(Gca1和Gca2)和乙醇脫氫酶(Adh5、Csh1和Ifd6)參與基質(zhì)形成和耐藥性的發(fā)揮，但并不影響Fks1調(diào)控通路[23]。細(xì)胞外基質(zhì)DNA(eDNA)是生物膜產(chǎn)生耐藥性的重要因素之一。
2.3 細(xì)胞膜甾醇代謝相關(guān)基因及耐藥
在白念珠菌的細(xì)胞膜脂質(zhì)成分中，游離甾醇與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流動性密切相關(guān)。以麥角甾醇作用為主，通過影響麥角甾醇在細(xì)胞膜中含量和合成過程，調(diào)控生物膜耐藥性?；駿RG1-27表達(dá)調(diào)控麥角甾醇合成途徑中關(guān)鍵酶，調(diào)控生物膜中麥角甾醇的含量。
ERG11編碼的麥角甾醇生物合成中靶酶羊毛甾醇14α-去甲基酶(CYP51)，促進(jìn)其合成維持細(xì)胞膜的功能。CYP51是唑類抗真菌藥物的結(jié)合靶點，藥物可通過抑制酶活性，減少麥角甾醇合成而發(fā)揮抗真菌作用[27]。一些研究分離的白念珠菌耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)ERG11和編碼C4甲基甾醇氧化酶的ERG25基因過度表達(dá)，產(chǎn)生大量的麥角甾醇合成關(guān)鍵酶，使唑類藥物無法完全阻止酶在合成路徑中發(fā)揮作用，導(dǎo)致白念珠菌獲得耐藥[29]，其中，ERG11過表達(dá)可能與其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Upc2特定位置點突變誘導(dǎo)有關(guān)[27]。其他尚有研究的耐藥相關(guān)基因ERG3、ERG4、ERG5、ERG6等過度表達(dá)，升高細(xì)胞膜上甾醇含量，多表現(xiàn)與唑類藥物相關(guān)耐藥性[41-42,29]。還有一些轉(zhuǎn)錄因子如Ndt80p、Efg1，均可調(diào)節(jié)ERG基因的表達(dá)，使菌株降低對抗真菌藥物的敏感性，誘導(dǎo)耐藥發(fā)生[39]。此外，隨著生物膜逐漸成熟，麥角甾醇含量逐漸降低，影響細(xì)胞膜通透性使藥物難以進(jìn)入，也可促進(jìn)耐藥性發(fā)揮[30]。
2.4 藥物外排泵合成基因及耐藥
真菌生物膜上的外排泵是參與細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運的膜蛋白，主要將對細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)排出胞外。當(dāng)膜泵發(fā)揮外排藥物作用時，即表現(xiàn)為抗真菌藥物耐藥性。外排泵蛋白據(jù)其功能可分為兩大類：一類是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(ABC)，是細(xì)胞膜上的外排機(jī)能泵，白念珠菌的耐藥抵抗(CDR)基因編碼的轉(zhuǎn)運蛋白屬于此類；另一類是易化載體蛋白超家族(MFS)，多重耐藥(MDR)基因編碼蛋白屬于此類。ABC和MFS的高表達(dá)，可引起多種抗真菌藥物的交叉耐藥。
在膜泵耐藥的耐藥機(jī)制中，轉(zhuǎn)錄因子Mrr1和Tac1分別誘導(dǎo)下游MDR1和CDR1/CDR2基因過度表達(dá)，使外排泵活性增強(qiáng)，增加機(jī)體耐藥性[31-32]。CDR1、CDR2表達(dá)上調(diào)促進(jìn)藥物外排，MDR1表達(dá)外排藥物同時降低細(xì)胞膜通透性，二者聯(lián)合作用降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度[33]。這三種基因表達(dá)增強(qiáng)是白念珠菌生物膜對唑類藥物耐藥的重要機(jī)制，其中CDR1對于耐藥性的貢獻(xiàn)大于其他二者[34]。Hsp90在耐藥菌株中，可通過調(diào)節(jié)CDR1的高表達(dá)，發(fā)揮耐藥性[21]。此外，轉(zhuǎn)錄因子Ndt80，有助于CDR1表達(dá)上調(diào)，還可結(jié)合于CDR2和MDR1啟動子，在耐藥轉(zhuǎn)錄機(jī)制中發(fā)揮作用[35]。若外排泵基因表達(dá)受抑制，念珠菌對唑類藥物的易感性可增加4～16倍[36]。在真菌生物膜形成晚期，外排泵缺失可能會導(dǎo)致耐藥性的降低。但研究發(fā)現(xiàn)CDR1、CDR2、MDR1早期表達(dá)參與唑類耐藥過程，成熟期敲除全部耐藥基因后，仍具有與早期相同的耐藥性，考慮隨著生物膜自身成熟耐藥性也在逐漸增加[30]。
2.5 滯留細(xì)胞合成基因及耐藥
真菌生物膜內(nèi)部有一種處于休眠狀態(tài)的滯留細(xì)胞，可視為酵母細(xì)胞的亞型，參與構(gòu)成生物膜的高度抗藥性。當(dāng)生物膜被抗真菌藥物攻擊后，仍可留存極少滯留細(xì)胞，結(jié)合浮游酵母細(xì)胞，重新生成持續(xù)的生物亞群，致抗真菌藥物失效和疾病復(fù)發(fā)，被認(rèn)為是真菌生物膜耐藥的重要機(jī)制。一些研究表明，滯留細(xì)胞多存在于生物膜黏附的早期階段，黏附因子HWP1、ALS3在白念珠菌滯留細(xì)胞形成過程中表達(dá)上調(diào)[37-38]。滯留細(xì)胞的存活階段與碳代謝過程密不可分，其中碳的主要來源為葡萄糖。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90可抑制滯留細(xì)胞中糖代謝過程，減少糖利用，為生物膜細(xì)胞再生儲存能量。此外，Hsp90還可減少Ras1-cAMP- PKA通路激活，抑制凋亡反應(yīng)，為生物膜的生成提供條件[40]。
滯留細(xì)胞中被檢測出存在CDR、KRE1和SKN1基因過度表達(dá)，提示滯留細(xì)胞可能誘導(dǎo)藥物外排泵的生成以及促進(jìn)ECM增厚，導(dǎo)致生物膜耐藥性增加[23,43]。Hsp90也可在滯留細(xì)胞耐藥中發(fā)揮作用。高水平的Hsp90可反應(yīng)出對兩性霉素B的耐藥性[44]。但由于滯留細(xì)胞數(shù)量極少，且不易被發(fā)現(xiàn)，目前與其相關(guān)的耐藥機(jī)制研究并不太多。
3 小結(jié)與展望
白念珠菌生物膜形成由復(fù)雜的、多種調(diào)控因素共同參與。在生物膜形成早期黏附作用首先發(fā)揮作用，而后酵母細(xì)胞逐漸向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化，膜內(nèi)脂質(zhì)的代謝和膜泵的作用，以及ECM的產(chǎn)生和滯留細(xì)胞存在，對生物膜耐藥性的增強(qiáng)均有著舉足輕重的作用。各個特征中基因不僅調(diào)控生物膜形成，同時也在影響生物膜耐藥性的發(fā)揮。更深入地了解白念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制，對于研發(fā)新的且更容易識別耐藥性的方法和研發(fā)針對生物膜生成和耐藥調(diào)控基因具有靶點作用的新型治療干預(yù)措施非常關(guān)鍵。希望將來能夠開發(fā)出針對白念珠菌生物膜形成和調(diào)控相關(guān)基因的理想靶點，為頑固性的白念珠菌感染治療提供根除的希望。
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念珠菌屬于人體正常生物菌群，可寄居于人的口腔、皮膚、陰道等部位。當(dāng)宿主免疫功能缺陷及致病菌毒力增強(qiáng)，白念珠菌可能引起淺部或深部真菌感染。生物膜形成能力是白念珠菌一種重要的致病毒力因子。成熟生物膜具有超強(qiáng)黏附力和復(fù)雜的自身結(jié)構(gòu)，可黏附于植入式的醫(yī)療器械上，阻止了抗菌藥物的滲透，逃避機(jī)體的免疫殺傷作用，促進(jìn)生物膜再生成，不僅為真菌的持續(xù)感染提供條件，同時在真菌耐藥性中發(fā)揮重要作用，這為真菌感染治療帶來重大挑戰(zhàn)。目前對于白念珠菌生物膜研究更為細(xì)致，通過對生物膜結(jié)構(gòu)合成相關(guān)基因調(diào)控和耐藥性發(fā)揮的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納，可對真菌生物膜致病、耐藥機(jī)制有更進(jìn)一步的認(rèn)識。
1 生物膜的組成結(jié)構(gòu)
真菌生物被膜(biofilm)是由細(xì)胞外基質(zhì)包裹著的，含有孢子、菌絲和假菌絲3種細(xì)胞形態(tài)的高度致密三維網(wǎng)狀系統(tǒng)，利于細(xì)胞與介質(zhì)間相互黏著。其形成過程大致分4個階段：早期酵母細(xì)胞以芽孢的形式黏附形成單層結(jié)構(gòu)；中期在胞外聚合物作用下，浮游真菌細(xì)胞黏合形成基底層；成熟期細(xì)胞外基質(zhì)的不斷積累將真菌3種形態(tài)細(xì)胞完全包裹，最終發(fā)育為成熟的生物膜[1]。最后一步，成熟的生物膜發(fā)生解離，酵母細(xì)胞脫落釋放，表現(xiàn)出更高的黏附力，游離并附著于周圍物體表面進(jìn)而形成新的生物膜[2]。生物膜結(jié)構(gòu)中含有的核酸、金屬離子、脂質(zhì)等物質(zhì)相互作用，使生物膜細(xì)胞間連接更加緊密。黏附、生長、成熟、釋放、再生，這是一個連續(xù)不斷的過程。
2 生物膜形成相關(guān)基因及耐藥性
白念珠菌的生物膜形成過程錯綜復(fù)雜，黏附及菌絲的延伸、胞外基質(zhì)產(chǎn)生，以及成熟后生物膜的物質(zhì)代謝、膜泵作用等環(huán)節(jié)均需多種基因調(diào)控參與完成。這些基因調(diào)控同時可能導(dǎo)致生物膜耐藥性產(chǎn)生。
2.1 黏附和菌絲合成基因及耐藥
白念珠菌生物膜形成的早期，為酵母細(xì)胞附著于機(jī)體黏膜或某些植入式器械上，此時黏附蛋白的高表達(dá)在真菌生物膜黏附過程中發(fā)揮重要作用。目前主要的黏附蛋白Als家族、Hwp1、Eap1、Rbt1、Ywp1是增加細(xì)胞間黏附，促進(jìn)生物膜的形成不可或缺的[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Bcr1、Snf5、Ace2 、Rob1、Tec1、Ndt80均存在于控制生物膜黏附作用的轉(zhuǎn)錄通路中，通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)，正向促進(jìn)黏附過程，對生物被膜形成發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]；小部分負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Rfx2、Sfp1、Zcf32抑制Als、Hwp家族表達(dá)，以及轉(zhuǎn)錄因子Gal4對生物膜新陳代謝的調(diào)節(jié)，均影響細(xì)胞間黏附，調(diào)節(jié)生物膜的形成[10-12]。此外，MAPK和cAMP-PKA兩條重要信號通路在黏附過程中發(fā)揮調(diào)控作用。MAPK通路中轉(zhuǎn)錄因子Brg1通過影響Hog1介導(dǎo)的Tor1激酶，抑制黏附基因ALS1、ALS3和HWP1表達(dá)[8]； cAMP-PKA通路中的靶轉(zhuǎn)錄因子Efg1在生物膜生長后期誘導(dǎo)ALS1表達(dá)[9]，促進(jìn)白念珠菌生物膜黏附作用。
菌絲態(tài)可逃避吞噬，有更強(qiáng)的毒力和適應(yīng)力，對于維持生物膜完整性和耐藥性發(fā)揮不容小覷。菌絲的延伸易受到調(diào)節(jié)基因BCR1、EFG1、CPH1、HGC1、FLO8、UME6的正向作用，以及TUP1、NRG1和RFG1的負(fù)性調(diào)節(jié)[10,15-17]。信號通路MAPK和Ras1-cAMP-PKA在白念珠菌菌絲生成過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。MAPK家族的Mkc1和Cek1激活轉(zhuǎn)錄因子Cph1，Ras1激活cAMP-PKA通路中Cyr1后誘導(dǎo)Efg1磷酸化，二者均在正向調(diào)控生物膜中菌絲態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，利于真菌生物膜的形成[13]。C.albicans同源基因DFG5和DCW1在生物膜形成中，通過調(diào)節(jié)Hog1 MAPK信號機(jī)制，從而促進(jìn)菌絲形成，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性[14]。此外，真菌細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換與黏附作用密不可分。Bcr1調(diào)節(jié)ALS3和HWP1的過度表達(dá)，Efg1調(diào)控下游ALS1表達(dá)，既可調(diào)控細(xì)胞間的黏附作用，同時誘導(dǎo)菌絲發(fā)育而促進(jìn)真菌生物膜的形成[19]。
在微生物生物膜對抗菌藥物的耐藥性研究中，微生物的耐藥性與生物膜的黏附和菌絲形成能力有關(guān)，說明可能誘導(dǎo)黏附素和菌絲生成的基因均可對生物膜的耐藥現(xiàn)象有一定影響。例如，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑KF506和環(huán)孢素A(CsA)通過誘導(dǎo)ALS3和HWP1的低表達(dá)，抑制生物膜的黏附和菌絲的生成，臨床上可協(xié)同氟康唑發(fā)揮抗真菌作用[18]，提示黏附因子和菌絲生成調(diào)控基因的過度表達(dá)可能為真菌生物膜重要的耐藥機(jī)制。聞軼旸等[20]研究發(fā)現(xiàn)，HOG1基因缺陷株對氟康唑更為敏感，表明Hog-MAPK信號通路中部分基因和蛋白表達(dá)的降低可能使耐藥性發(fā)生改變。此外，Hsp90也可影響?zhàn)じ降鞍谆虮磉_(dá)和MAPK和Ras1-cAMP-PKA通路，作用于菌絲形成過程，維持細(xì)胞壁的完整性，從而發(fā)揮對常規(guī)抗真菌藥的耐藥性[21]。
2.2 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成基因及耐藥
細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、DNA組成的混合結(jié)構(gòu)，可為生物膜細(xì)胞生長提供結(jié)構(gòu)框架和保護(hù)作用。ECM通過輔助真菌細(xì)胞對抗宿主免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞間黏附，以及發(fā)揮屏障作用阻止或延遲藥物滲入，在白念珠菌的耐藥性中發(fā)揮顯著作用。FKS1、BGL2、PHR1/2、XOG1在生物膜ECM中編碼β-1,3-葡聚糖合成關(guān)鍵酶，SKN1和KRE1參與合成β-1、6-葡聚糖，SRB1編碼甘露聚糖合成關(guān)鍵酶，這些基因特異性表達(dá)多糖合成關(guān)鍵酶，調(diào)控白念珠菌生物膜ECM中多糖的產(chǎn)生和分泌[22-25]，對ECM成熟、維持生物膜結(jié)構(gòu)完整性和輔助生物膜耐藥性發(fā)揮均起到重要作用。在ECM形成過程中，轉(zhuǎn)錄因子Zap1具有十分重要的作用。Zap1可負(fù)向調(diào)節(jié)胞外可溶性β-1,3-葡聚糖分泌，調(diào)控生物膜生成代謝過程，是調(diào)節(jié)體內(nèi)生物膜ECM生成的重要成分[23]。分子伴侶Hsp90也被發(fā)現(xiàn)是產(chǎn)生基質(zhì)葡聚糖所必需因子之一[28]。除分泌多糖外，細(xì)胞外基質(zhì)DNA(eDNA)也是生物膜形成的重要因素之一。eDNA誘導(dǎo)ECM生成并貫穿生物膜生長所有階段，破壞eDNA將影響生物膜的骨架結(jié)構(gòu)，反之，添加外源性eDNA可促進(jìn)增厚生物膜ECM的形成[24]。
ECM在抗真菌藥物的耐藥發(fā)揮中，主要通過胞外β-葡聚糖合成的關(guān)鍵酶與唑類抗真菌藥結(jié)合，阻止藥物滲入生物膜內(nèi)部，而不能到達(dá)靶點發(fā)揮藥物活性作用。參與此過程的主要為Fks1和Srb1通路[22,25]，誘導(dǎo)多糖關(guān)鍵酶合成參與構(gòu)成ECM耐藥。此外，fks1和/或fks2基因點突變，也可導(dǎo)致真菌對棘白菌素類抗真菌藥敏感性下降[45]。在生物膜形成中晚期，SKN1和KRE1表達(dá)上調(diào)，可誘導(dǎo)真菌生物膜對兩性霉素B耐受[26]。轉(zhuǎn)錄因子Zap1通過負(fù)調(diào)控于多糖生成過程中的葡糖淀粉酶(Gca1和Gca2)和乙醇脫氫酶(Adh5、Csh1和Ifd6)參與基質(zhì)形成和耐藥性的發(fā)揮，但并不影響Fks1調(diào)控通路[23]。細(xì)胞外基質(zhì)DNA(eDNA)是生物膜產(chǎn)生耐藥性的重要因素之一。
2.3 細(xì)胞膜甾醇代謝相關(guān)基因及耐藥
在白念珠菌的細(xì)胞膜脂質(zhì)成分中，游離甾醇與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流動性密切相關(guān)。以麥角甾醇作用為主，通過影響麥角甾醇在細(xì)胞膜中含量和合成過程，調(diào)控生物膜耐藥性?；駿RG1-27表達(dá)調(diào)控麥角甾醇合成途徑中關(guān)鍵酶，調(diào)控生物膜中麥角甾醇的含量。
ERG11編碼的麥角甾醇生物合成中靶酶羊毛甾醇14α-去甲基酶(CYP51)，促進(jìn)其合成維持細(xì)胞膜的功能。CYP51是唑類抗真菌藥物的結(jié)合靶點，藥物可通過抑制酶活性，減少麥角甾醇合成而發(fā)揮抗真菌作用[27]。一些研究分離的白念珠菌耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)ERG11和編碼C4甲基甾醇氧化酶的ERG25基因過度表達(dá)，產(chǎn)生大量的麥角甾醇合成關(guān)鍵酶，使唑類藥物無法完全阻止酶在合成路徑中發(fā)揮作用，導(dǎo)致白念珠菌獲得耐藥[29]，其中，ERG11過表達(dá)可能與其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Upc2特定位置點突變誘導(dǎo)有關(guān)[27]。其他尚有研究的耐藥相關(guān)基因ERG3、ERG4、ERG5、ERG6等過度表達(dá)，升高細(xì)胞膜上甾醇含量，多表現(xiàn)與唑類藥物相關(guān)耐藥性[41-42,29]。還有一些轉(zhuǎn)錄因子如Ndt80p、Efg1，均可調(diào)節(jié)ERG基因的表達(dá)，使菌株降低對抗真菌藥物的敏感性，誘導(dǎo)耐藥發(fā)生[39]。此外，隨著生物膜逐漸成熟，麥角甾醇含量逐漸降低，影響細(xì)胞膜通透性使藥物難以進(jìn)入，也可促進(jìn)耐藥性發(fā)揮[30]。
2.4 藥物外排泵合成基因及耐藥
真菌生物膜上的外排泵是參與細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運的膜蛋白，主要將對細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)排出胞外。當(dāng)膜泵發(fā)揮外排藥物作用時，即表現(xiàn)為抗真菌藥物耐藥性。外排泵蛋白據(jù)其功能可分為兩大類：一類是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(ABC)，是細(xì)胞膜上的外排機(jī)能泵，白念珠菌的耐藥抵抗(CDR)基因編碼的轉(zhuǎn)運蛋白屬于此類；另一類是易化載體蛋白超家族(MFS)，多重耐藥(MDR)基因編碼蛋白屬于此類。ABC和MFS的高表達(dá)，可引起多種抗真菌藥物的交叉耐藥。
在膜泵耐藥的耐藥機(jī)制中，轉(zhuǎn)錄因子Mrr1和Tac1分別誘導(dǎo)下游MDR1和CDR1/CDR2基因過度表達(dá)，使外排泵活性增強(qiáng)，增加機(jī)體耐藥性[31-32]。CDR1、CDR2表達(dá)上調(diào)促進(jìn)藥物外排，MDR1表達(dá)外排藥物同時降低細(xì)胞膜通透性，二者聯(lián)合作用降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度[33]。這三種基因表達(dá)增強(qiáng)是白念珠菌生物膜對唑類藥物耐藥的重要機(jī)制，其中CDR1對于耐藥性的貢獻(xiàn)大于其他二者[34]。Hsp90在耐藥菌株中，可通過調(diào)節(jié)CDR1的高表達(dá)，發(fā)揮耐藥性[21]。此外，轉(zhuǎn)錄因子Ndt80，有助于CDR1表達(dá)上調(diào)，還可結(jié)合于CDR2和MDR1啟動子，在耐藥轉(zhuǎn)錄機(jī)制中發(fā)揮作用[35]。若外排泵基因表達(dá)受抑制，念珠菌對唑類藥物的易感性可增加4～16倍[36]。在真菌生物膜形成晚期，外排泵缺失可能會導(dǎo)致耐藥性的降低。但研究發(fā)現(xiàn)CDR1、CDR2、MDR1早期表達(dá)參與唑類耐藥過程，成熟期敲除全部耐藥基因后，仍具有與早期相同的耐藥性，考慮隨著生物膜自身成熟耐藥性也在逐漸增加[30]。
2.5 滯留細(xì)胞合成基因及耐藥
真菌生物膜內(nèi)部有一種處于休眠狀態(tài)的滯留細(xì)胞，可視為酵母細(xì)胞的亞型，參與構(gòu)成生物膜的高度抗藥性。當(dāng)生物膜被抗真菌藥物攻擊后，仍可留存極少滯留細(xì)胞，結(jié)合浮游酵母細(xì)胞，重新生成持續(xù)的生物亞群，致抗真菌藥物失效和疾病復(fù)發(fā)，被認(rèn)為是真菌生物膜耐藥的重要機(jī)制。一些研究表明，滯留細(xì)胞多存在于生物膜黏附的早期階段，黏附因子HWP1、ALS3在白念珠菌滯留細(xì)胞形成過程中表達(dá)上調(diào)[37-38]。滯留細(xì)胞的存活階段與碳代謝過程密不可分，其中碳的主要來源為葡萄糖。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90可抑制滯留細(xì)胞中糖代謝過程，減少糖利用，為生物膜細(xì)胞再生儲存能量。此外，Hsp90還可減少Ras1-cAMP- PKA通路激活，抑制凋亡反應(yīng)，為生物膜的生成提供條件[40]。
滯留細(xì)胞中被檢測出存在CDR、KRE1和SKN1基因過度表達(dá)，提示滯留細(xì)胞可能誘導(dǎo)藥物外排泵的生成以及促進(jìn)ECM增厚，導(dǎo)致生物膜耐藥性增加[23,43]。Hsp90也可在滯留細(xì)胞耐藥中發(fā)揮作用。高水平的Hsp90可反應(yīng)出對兩性霉素B的耐藥性[44]。但由于滯留細(xì)胞數(shù)量極少，且不易被發(fā)現(xiàn)，目前與其相關(guān)的耐藥機(jī)制研究并不太多。
3 小結(jié)與展望
白念珠菌生物膜形成由復(fù)雜的、多種調(diào)控因素共同參與。在生物膜形成早期黏附作用首先發(fā)揮作用，而后酵母細(xì)胞逐漸向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化，膜內(nèi)脂質(zhì)的代謝和膜泵的作用，以及ECM的產(chǎn)生和滯留細(xì)胞存在，對生物膜耐藥性的增強(qiáng)均有著舉足輕重的作用。各個特征中基因不僅調(diào)控生物膜形成，同時也在影響生物膜耐藥性的發(fā)揮。更深入地了解白念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制，對于研發(fā)新的且更容易識別耐藥性的方法和研發(fā)針對生物膜生成和耐藥調(diào)控基因具有靶點作用的新型治療干預(yù)措施非常關(guān)鍵。希望將來能夠開發(fā)出針對白念珠菌生物膜形成和調(diào)控相關(guān)基因的理想靶點，為頑固性的白念珠菌感染治療提供根除的希望。
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