陳大芳，李 平，唐明宗，申金容，張云淞，曾 金

（貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州 貴陽 550018）

在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，公豬精液品質(zhì)的優(yōu)劣是人工授精技術的關鍵，影響到母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，直接關系到豬場的經(jīng)濟效益[1]。進行精液品質(zhì)的檢測，可為精液稀釋、保存和利用提供依據(jù)，準確判定精液的品質(zhì)優(yōu)劣，也是檢驗公豬生殖器官機能、公豬飼養(yǎng)管理、采精操作技術等效果的衡量，對養(yǎng)豬生產(chǎn)具有重要意義。本試驗擬從影響受精力相關程度較大的指標如精子密度、稀釋后精子活力、每劑量直線前進運動精子數(shù)、精子畸形率等進行不同品種的豬精液品質(zhì)檢測結果比較，擬為判定不同品種豬的精液質(zhì)量提供一定數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

種公豬精液來源于貴州省境內(nèi)的1個種公豬站及9個種豬生產(chǎn)企業(yè)，共采集10批次47頭精液樣品（原精液及常溫精液）做為試驗對象，各豬場的稀釋液均為購買不同品牌長效稀釋劑進行配制，品種為引進品種（大白、長白、杜洛克）及地方品種（柯樂豬）。分別采集大白豬15頭、長白豬15頭、杜洛克豬12頭、柯樂豬5頭等共4個品種精液進行檢測。

1.2 試驗時間及地點

2020年5—9月，貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心承接部檢種畜禽質(zhì)量安全監(jiān)督檢查工作任務，針對貴州境內(nèi)省9個地州市部分種公豬站及種豬生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的種公豬精液進行抽檢，共抽檢了10批次，每次抽檢1個豬場，每個豬場抽檢3～5頭種公豬原精液及常溫精液樣品，裝入16～18 ℃恒溫保存箱，嚴格按照運輸要求，帶回貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心精液檢測室進行檢測。

1.3 檢測設備

精子質(zhì)量分析系統(tǒng)（AndroVision Minitube/德國）、精子密度儀（SDM6-Minitube/德國）、正直顯微鏡（CX41-奧林巴斯/日本）、恒溫保存箱、恒溫預熱板、血球計數(shù)板、載玻片、蓋玻片、移液槍、比色杯等。

1.4 檢測方法

按照國家標準GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術規(guī)范》[2]和GB 23238—2009《種豬常溫精液》[3]中的方法進行檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Excel表格處理，分析采用SPSS軟件，檢測數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 檢測指標

2.1 精子密度

采用精子密度儀（米尼圖Minitube SDM6）直接檢測。1）每周使用前進入實用程序中先進行“暗度較正”，再用一個容量為4 mL的比色皿加入4 mL 0.9%氯化鈉溶液做“零度較正”，取出較正空白比色皿。2）另取空比色皿一個，用移液器加入3.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，再加入70 μL的原精精液樣本，順勢沖吸槍頭幾次徹底排空槍頭中的精液。3）在觸摸屏上選擇測量模式設置儀器參數(shù)，輸入樣品的ID號、精液量、精液活力進行自動分析，按確認“模式”輸出結果并記錄。

2.2 精子活力

取兩個劑量的常溫精液輕輕搖動均勻，分別用移液器吸取精液約25 μL置于載玻片上并加蓋玻片，在37 ℃條件下，用顯微鏡（200～400倍）觀察精子活力。每個樣片觀察3個視野，并觀察不同液層內(nèi)的精子運動狀態(tài)，進行全面評定。

計算公式如下：

式中：M為活力；n1為第一視野活力；n2為第二視野活力；n3為第三視野活力。

2.3 每劑量直線前進運動精子數(shù)

用移液槍吸取50 μL樣品，使用3.0%氯化鈉（NaCl）溶液0.95 mL與其混勻。將備好的血球計數(shù)板用蓋玻片將計數(shù)室蓋好，用移液槍吸取稀釋精液打入蓋玻片邊緣，使精液自行流入到計數(shù)室中，均勻充滿，不允許有氣泡或厚度過大，在400倍顯微鏡下觀察計數(shù)。

（1）每劑量中精子數(shù)=5個中方格精子數(shù)×100萬×劑量值。

（2）每劑量中直線前進運動的精子數(shù)計算：

式中：C為每劑量中前進運動精子數(shù)，單位為個；s為每劑量中精子數(shù)，單位為個；m為活力，單位%。

2.4 精子畸形率

采用伊紅或姬姆薩染色法。1）抹片：用移液器吸取1滴解凍后精液滴于載玻片一端，用另一張載玻片的一邊與樣品呈35°夾角，將精液樣品均勻地涂抹于載玻片上，然后自然風干約5 min，每個樣品制備2～3個抹片；2）固定：在風干的抹片上滴1.0～2.0 mL中性福爾馬林固定液，固定15 min后用清水緩緩沖去固定液，然后自然風干或吹干；3）染色：將固定好后的抹片反扣在帶有平槽的有機玻璃槽面上，將染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5 h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢；4）鏡檢：將制備好的抹片在顯微鏡（400～600倍）下觀察，每個抹片觀察200個以上的精子（分左、右兩個區(qū)），取兩片的平均值，兩片畸形率的差值不得大于6。

精子畸形率的計算：

式中：A為精子畸形率，單位%；A1為畸形精子數(shù)，單位為個；S為精子總數(shù)，單位為個。

3 結果與分析

3.1 精子密度比較分析

按照GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術規(guī)范》[1]要求，分別對大白、長白、杜洛克、柯樂豬種豬的原精液進行檢測，檢測頭份及結果見表1。由表1可知，精子密度順序為杜洛克＞長白＞大白＞柯樂豬。杜洛克較高，長白、大白差異不大，柯樂豬略低于其他3個品種。

表1 精子密度檢測結果

3.2 7 h精子活力、72 h精子活力比較分析

采樣時記錄好每頭豬采精時間，按G B 23238—2009《種豬常溫精液》[2]要求，將采集的大白、長白、杜洛克、柯樂豬原精液稀釋成常溫精液放置于16～18 ℃恒溫保存箱保存，分別于保存后7 h、72 h后進行活力檢測，各品種的豬精子活力有一定差異但差異不大。檢測頭份及結果見表2。由表2可知，1）7 h精子活力：順序為柯樂豬＞長白＞大白＞杜洛克；2）72 h精子活力：順序為柯樂豬＞長白＞大白＞杜洛克。結果表明保存72 h后的精子活力與7 h精子活力成正相關，降低幅度為長白降低18.3個百分點、大白降低18.8個百分點、柯樂豬降低18.9個百分點、杜洛克降低21.9個百分點，72 h精子平均活力≥60%，但此時各品種的標準差偏大，表明各品種精液品質(zhì)因保存時間的增長活力差異明顯。

表2 7 h精子活力、72 h精子活力檢測結果

3.3 每劑量直線前進運動精子數(shù)比較分析

按GB 23238—2009《種豬常溫精液》[2]要求，分別對大白、長白、杜洛克、柯樂豬種豬的常溫精液進行檢測，檢測頭份及結果見表3。由表3可知，每劑量中直線前進運動精子數(shù)為杜洛克＞大白＞柯樂豬＞長白，本項指標的檢測結果沒有可比性，因此項指標的檢測與稀釋比例及精子活力有密切關系，密度大則直線前進運動精子數(shù)高。

表3 每劑量直線前進運動精子數(shù)檢測結果

3.4 精子畸形率比較分析

分別對大白、長白、杜洛克、柯樂豬種豬的常溫精液進行檢測，檢測頭份及結果見表4。由表4可知，精子畸形率為大白＞杜洛克＞長白＞柯樂豬，引進品種豬大白、長白、杜洛克精子畸形率無明顯差異，地方品種柯樂豬的畸形率明顯低于引進品種大白、長白、杜洛克豬。

表4 精子畸形率檢測結果

4 討論

本試驗采用在貴州省境內(nèi)飼養(yǎng)的大白、長白、杜洛克、柯樂豬4個品種豬，分別對精子密度、精子活力、每劑量直線前進運動精子數(shù)、精子畸形率等指標進行檢測結果對比。結果表明，1）精子密度：引進品種大白、長白、杜洛克豬差異不大，地方品種柯樂豬略低于大白、長白、杜洛克引進品種，這可能與引進品種來源于養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達國家，與他們重視育種工作長期選育有關。2）精子活力：大白、長白、杜洛克、柯樂豬4個品種的差異不大，保存3 d后能達到輸配要求活力≥60%。地方品種柯樂豬精子活力優(yōu)于引進品種大白、長白、杜洛克。不同品種公豬的精子活力會因品種、年齡、季節(jié)、營養(yǎng)水平、飼養(yǎng)管理等因素有所差異，并且這種差異是客觀存在的[4]。3）每劑量直線前進運動精子數(shù)：此項指標的檢測結果與原精液的稀釋比例及精子活力有密切關系，本項檢測結果沒有可比性，稀釋比例越小則密度大，直線前進運動的精子數(shù)則高。4）精子畸形率：大白＞杜洛克＞長白＞柯樂豬，引進品種豬大白、長白、杜洛克精子畸形率無明顯差異，地方品種柯樂豬的畸形率明顯低于大白、長白、杜洛克引進品種。本次研究中地方品種的畸形率明顯低于引進品種，建議發(fā)揮地方品種柯樂豬畸形率低的優(yōu)勢，加強本地品種豬優(yōu)勢性狀的選育工作，培育自有品牌。

影響精液品質(zhì)的因素很多，如種公豬的營養(yǎng)狀況、身體是否有疾病、是否注射疫苗等這些因素都會影響到原精液的品質(zhì)；而采精技術、精液處理、稀釋液、保存溫度、實驗室環(huán)境及技術人員操作水平等將會影響到所制作的常溫精液的質(zhì)量[5]。不論是在國內(nèi)還是在國外，不同品種豬的精液品質(zhì)在某些方面存在著客觀上的差異是必然的，因為各地動物的營養(yǎng)、生理、環(huán)境等方面不可能完全相同，對動物的生精機能產(chǎn)生的影響就自然不會完全一致[6]。本試驗以貴州省境內(nèi)飼養(yǎng)的引進品種和地方品種進行研究，由于樣本來源于不同的豬場，各豬場的飼養(yǎng)管理水平不同，同時因樣本量不大，此研究為專業(yè)技術人員在檢測精液品質(zhì)質(zhì)量時提供參考。