段美娜，覃 亮，龍 婧，林 娜，趙 輝

（1.廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院//2.南方海洋科學(xué)與工程 廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江）南海資源大數(shù)據(jù)中心,廣東 湛江 524088）

重金屬污染物一般是指Hg、Cd、Pb、Cr、Cu、Zn和類金屬As等生物毒性顯著的重金屬[1]。重金屬污染物難降解且難溶于水，但對(duì)生物體的脂肪組織具有較高親和力，可以在生物體內(nèi)富集并通過食物鏈逐級(jí)傳遞，進(jìn)而危害人體健康[2]。近年來，隨著我國(guó)海洋經(jīng)濟(jì)以及近岸城市化、工業(yè)化的發(fā)展，各種含重金屬的工業(yè)廢水、生活污水排入海洋，致使海洋環(huán)境中有毒重金屬元素含量越來越高[3]。浮游植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)、物質(zhì)循環(huán)和信息傳遞等方面起著十分重要的作用[4]。同時(shí)，浮游植物是海洋重金屬污染的第一層受體，也是最先受到重金屬影響的海洋生物種群之一。因此全面了解重金屬污染對(duì)海洋浮游植物的毒性效應(yīng)及機(jī)制十分必要。

重金屬的生物毒性因重金屬種類[5]、元素存在形態(tài)[1]和浮游植物種類[6]而有所不同。重金屬如Cd、Hg和As等，對(duì)浮游植物而言屬于非必需元素，低濃度的此類重金屬即具有生長(zhǎng)發(fā)育毒性效應(yīng)[7-11]。Cd是具有“三致性”危害（致癌、致畸、致突變）的有毒污染物之一，已被聯(lián)合國(guó)組織確定為優(yōu)先檢測(cè)的環(huán)境污染物。人類活動(dòng)諸如垃圾焚燒、金屬和合金制造、電鍍、采礦、冶煉和焊接工藝等將Cd釋放到水環(huán)境中。Cd可以沿著海洋食物鏈傳遞、富集濃縮，最終進(jìn)入人體，對(duì)人體內(nèi)臟器官、血液循環(huán)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生損傷。重金屬如Cu、Zn和Mn等，是浮游植物維持正常生命活動(dòng)所必需的微量元素[7]，它們對(duì)浮游植物具有低劑量刺激、高劑量抑制的毒物興奮效應(yīng)，即當(dāng)此類重金屬的含量高出某一閾值時(shí)才會(huì)對(duì)浮游植物產(chǎn)生毒性影響[8-9]。Cu是一種常見的重金屬，銅鋅礦的開采和冶煉、金屬加工、機(jī)械制造、鋼鐵生產(chǎn)等都是海洋環(huán)境中Cu污染的來源。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，我國(guó)近海河口環(huán)境Cu污染水平在過去幾十年中呈逐漸上升趨勢(shì)[2-3]。近海海域Cd和Cu污染問題已成為海洋生態(tài)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

海洋環(huán)境中滲透壓、鹽類和碳源與淡水環(huán)境相比具有巨大差異，因而海洋浮游植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的機(jī)制極有可能與淡水浮游植物不同。全面了解重金屬對(duì)海洋浮游植物的毒性及其作用機(jī)制，對(duì)于預(yù)測(cè)生物群落變動(dòng)趨勢(shì)和改善海洋生態(tài)環(huán)境有十分重要的意義。

本研究通過分析非必需元素Cd和必需元素Cu對(duì)海洋浮游植物的毒性效應(yīng)及機(jī)制，以期為今后開展重金屬對(duì)海洋浮游植物毒害機(jī)理的深入研究提供依據(jù)。

1 Cd的毒性效應(yīng)及機(jī)制

1.1 Cd的毒性效應(yīng)

Cd的性質(zhì)穩(wěn)定且不易降解，易在生物體內(nèi)蓄積，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道Cd對(duì)海洋浮游植物的生理生化過程毒性效應(yīng)[12]，例如生長(zhǎng)抑制效應(yīng)[11,13-29]、光合器官的損傷效應(yīng)[5,11,15,24-25,27,30]、氧化應(yīng)激效 應(yīng)[5,13-15,17-18,22,30]、色素降解效應(yīng)[5,11,13-17,21]等 （表1）。

1.2 Cd的毒性作用機(jī)制

鎘在海水中有多種存在形態(tài)，一般認(rèn)為Cd2+對(duì)浮游植物具有較高的生物可利用性和毒性，因此后文主要以Cd2+為代表闡述其毒性作用機(jī)制。Cd2+對(duì)海洋浮游植物的毒性效應(yīng)存在很大的種間和種內(nèi)差異，但高濃度的Cd2+對(duì)絕大部分海洋浮游植物的生長(zhǎng)發(fā)育均具抑制效應(yīng)[11,13-29,34]。

1.2.1Cd對(duì)鈣信使系統(tǒng)的影響 Ca2+作為細(xì)胞中最重要的第二信使，參與了細(xì)胞許多生理過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。胞內(nèi)Ca2+濃度的改變是Ca2+信使系統(tǒng)啟動(dòng)的中心環(huán)節(jié)。Cd2+離子半徑與Ca2+相近，結(jié)構(gòu)相似，Cd2+與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)性地利用Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞 內(nèi)[35-36]，因此外界環(huán)境Cd2+濃度增加可能導(dǎo)致海洋浮游植物細(xì)胞對(duì)Ca2+的吸收量減少[11]。除此之外，Cd2+還可以通過自然抵抗力相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等通道進(jìn)入浮游植物細(xì) 胞[35-36]。

表1 重金屬Cd對(duì)海洋浮游植物的毒性效應(yīng)Table 1 The toxicological effects of heavy metals (cadmium) on marine phytoplankton

續(xù)表1（Continued）

細(xì)胞內(nèi)Cd2+與Ca2+之間亦存在陽(yáng)離子競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)：1）可以替代Ca2+與下游的Ca2+信號(hào)靶蛋白結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)一系列與Ca2+相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[31]；2）直接與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ca2+-ATPase，導(dǎo)致Ca2+-ATPase活性降低，影響Ca2+的跨膜運(yùn)輸；3）在線粒體、質(zhì)膜、微管、肌動(dòng)蛋白等的Ca2+結(jié)合部位，直接競(jìng)爭(zhēng)或取代Ca2+，使胞質(zhì)中游離的Ca2+濃度增加。另外，Cd2+極易與線粒體膜上的巰基結(jié)合，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)改變，膜通透性增加。大約80%的胞內(nèi)Ca2+貯存在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣庫(kù)中，一旦線粒體等膜結(jié)構(gòu)功能被Cd2+破壞，將導(dǎo)致胞質(zhì)中Ca2+濃度的增加。胞內(nèi)Ca2+濃度的大幅增加，將激活某些酶如內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致DNA的片段化[23]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.2.2Cd對(duì)光合作用損傷 海洋浮游植物的光合作用對(duì)Cd2+脅迫十分敏感。Cd2+對(duì)海洋浮游植物光合作用的毒性作用機(jī)理較為復(fù)雜，可能的途徑包括5種：1）進(jìn)入細(xì)胞的Cd2+可直接與葉綠素中的Mg2+發(fā)生替換，使葉綠素失去捕光功能，導(dǎo)致光合速率降低[5,11,13,15,24,27]。2）Cd2+具有高度的巰基親和性，可以與含巰基的生物大分子特異性結(jié)合[24,26,34]，抑制海洋浮游植物的葉綠素合成酶（如原葉綠素酸酯還原酶、δ-氨基-γ-酮戊酸脫水酶）活性，同時(shí)增強(qiáng)葉綠素酶的活性。葉綠素酶能夠抑制原葉綠素酸酯還原酶復(fù)合物的合成。因而，Cd2+通過對(duì)葉綠素合成酶和葉綠素酶活性的影響，導(dǎo)致葉綠素降 解[5,11,13-17,21]。3）Cd2+可以作用于海洋浮游植物光系統(tǒng)電子傳遞鏈的許多位點(diǎn)，尤其是PSII電子供體側(cè)的放氧復(fù)合體位點(diǎn)，抑制光反應(yīng)過程中的電子傳遞[11,30]，降低光合作用效率[5,11,13,15,24,27,30]。4）Cd2+能抑制碳同化過程中的關(guān)鍵酶活性[17]。碳酸酐酶是海洋浮游植物光合作用中的關(guān)鍵酶，可以加速HCO3-和CO2之間的轉(zhuǎn)換，為光合作用中CO2固定的酶促反應(yīng)提供反應(yīng)底物。Cd2+可以替換碳酸酐酶活性中心的Zn2+，抑制碳酸酐酶的活性，進(jìn)而干擾CO2固定過程。5）Cd2+可以破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，影響葉綠體的正常功能。對(duì)南極嗜冷單細(xì)胞藻（K.Antarctica）研究表明，Cd2+脅迫損傷了葉綠體超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基粒片層消失、類囊體空泡、基粒堆疊混亂[11]。

1.2.3Cd誘導(dǎo)氧化脅迫 Cd2+進(jìn)入海洋浮游植物細(xì)胞后，不僅影響光合作用，還會(huì)間接誘導(dǎo)ROS的生成，造成細(xì)胞的氧化損傷。ROS是生物體的正常代謝產(chǎn)物。海洋浮游植物體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化酶和抗氧化劑?？寡趸钢饕ǔ趸锲缁福⊿OD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化氫酶（CAT）等，抗氧化劑主要包括還原型谷胱甘肽（GSH）、類胡蘿卜素（Car）等。未受到環(huán)境脅迫時(shí)，在抗氧化系統(tǒng)作用下海洋浮游植物體內(nèi)ROS維持在較低水平。在受到Cd2+脅迫時(shí)，海洋浮游植物細(xì)胞內(nèi)通常會(huì)積累大量的 ROS[5,22]，導(dǎo)致氧化脅迫。雖然Cd2+是非氧化還原性金屬，無法通過Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)直接產(chǎn)生ROS，但Cd2+可以通過以下方式間接導(dǎo)致海洋浮游植物體內(nèi)ROS含量的增加：1）置換蛋白質(zhì)等生物大分子中的Fe或Cu等過渡性金屬，引起細(xì)胞內(nèi)游離的過渡性金屬含量上升，過渡性金屬可以通過Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)加速ROS的生成，從而加劇氧化脅迫。2）Cd2+可以抑制線粒體和葉綠體的電子傳遞[30]，并導(dǎo)致線粒體和葉綠體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)性損傷[11]，使光呼吸功能紊亂，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生。3）Cd2+引起抗氧化系統(tǒng)功能的失調(diào)，如抑制抗氧化酶的活性[13-14,17,22]或?qū)寡趸瘎┑南?耗[14,15,30]等，導(dǎo)致氧化脅迫。氧化脅迫可以引起膜組分中脂質(zhì)的過氧化[13-15,17,22]，其直接的結(jié)果是膜不飽和脂肪酸減少、膜脂的流動(dòng)性降低、膜功能異常，引起細(xì)胞透明性病變、纖維化，導(dǎo)致細(xì)胞裂 解[11,28]。

高濃度的ROS會(huì)導(dǎo)致氧化損傷，而低濃度的ROS可作為信號(hào)分子誘導(dǎo)浮游植物細(xì)胞的程序性死亡。H2O2呈電中性并且能夠通過細(xì)胞膜，存在時(shí)間較長(zhǎng)，常被看作ROS中的最佳信號(hào)分子。對(duì)綠藻（Chlorella saccharophila和Micrasterias）[37-38]和甲藻（Peridinium gatunense）[39]的研究表明，在環(huán)境脅迫下H2O2作為主要的ROS信號(hào)分子，誘導(dǎo)了caspase-3-like酶活性上升,從而介導(dǎo)了細(xì)胞的類程序性死亡的發(fā)生。

2 Cu的毒性效應(yīng)及機(jī)制

2.1 Cu的毒性效應(yīng)

Cu是海洋浮游植物生長(zhǎng)必需的微量元素，是呼吸作用和光合作用中多種酶的輔助因子。但過量的Cu對(duì)海洋浮游植物的毒性很大，會(huì)影響浮游植物的光合作用[5,27,40-46]、色素含量[5,40,42,45,47-48]、脂肪酸代謝[27]、碳水化合物合成[42,47,49]、ATP生成[42,49]、蛋白質(zhì)合成[23,33,42,44,47-50]、基因表達(dá)[5,33,42,44,46]等多種生理生化過程。Cu對(duì)海洋浮游植物的毒性效應(yīng)因受試物種不同而有所差異（表2）。

表2 重金屬Cu對(duì)海洋浮游植物的毒性效應(yīng)Table 2 The toxicological effects of heavy metals (copper) on marine phytoplankton

續(xù)表2（Continued）

2.2 Cu的毒性機(jī)制

Cu2+水溶性很高，在自然水體中極易遷移，一直是海洋環(huán)境研究中一個(gè)不容忽視的問題，因此后文對(duì)銅毒性機(jī)制的討論主要以Cu2+為代表。

Cu對(duì)海洋浮游植物的毒性作用機(jī)制大致可以概括為：1）Cu2+與氨基酸的羧基、羥基、氨基、巰基具有高度親和性[49]，Cu2+與這些基團(tuán)的結(jié)合會(huì)使蛋白質(zhì)失去活性[42,48-50]，干擾生理生化過程。2）Cu屬于過渡性金屬，可以與細(xì)胞內(nèi)的脫氧劑反應(yīng)生成Cu+，Cu+是Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)的催化劑，直接加速細(xì)胞內(nèi)ROS的生成[56]，誘導(dǎo)氧化脅迫。3）Cu2+和Cu+都可以與其他結(jié)合在特定位點(diǎn)的必需金屬離子發(fā)生替換，對(duì)海洋浮游植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

2.2.1Cu與高度親和性基團(tuán)結(jié)合 海洋浮游植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上存在豐富的多糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類物質(zhì)，Cu2+具有較強(qiáng)的極化性，極易與這些物質(zhì)的羧基、羥基、氨基、巰基等官能團(tuán)結(jié)合。海洋環(huán)境中Cu2+濃度增大時(shí)，首先被吸附到浮游植物細(xì)胞壁上[54]，當(dāng)超出細(xì)胞壁容納能力之后，過量的Cu2+通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[54]。海洋浮游植物細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)由于具有豐富的不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，因而成為Cu2+優(yōu)先攻擊的部位之一。Cu2+可與膜蛋白的官能團(tuán)（如羧基、羥基、氨基等）或磷脂分子層的磷脂類物質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致膜蛋白失去活性，影響膜的選擇透過性[41]和流動(dòng)性，進(jìn)而影響各細(xì)胞器與細(xì)胞質(zhì)之間、細(xì)胞與外界之間的信號(hào)傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬磉^程，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞解體[40,42]。Cu2+還可以與細(xì)胞內(nèi)含有巰基的分子如GSH[45]、植物螯合肽[50]結(jié)合。植物螯合肽主要功能是作為必需微量金屬元素的緩沖劑，螯合并運(yùn)輸過量的重金屬至液泡。植物螯合肽合成的前體是GSH，其合成將消耗GSH，導(dǎo)致GSH含量下降。三角褐指藻（P.triconut）在受到Cu2+脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的植物螯合肽含量增加，GSH含量略有下降[50]。GSH的消耗意味著生物體的抗氧化潛力降低，這對(duì)處于過渡性重金屬（如Cu）脅迫下的海洋浮游植物影響極大。

2.2.2Cu誘導(dǎo)氧化脅迫 Cu是具有3種價(jià)態(tài)（0、+1、+2）的過渡金屬元素，在生物體內(nèi)可以直接催化H2O2反應(yīng)生成ROS。對(duì)多種海洋浮游植物的研究表明，Cu2+脅迫可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，使抗氧化防御系統(tǒng)失衡，引起氧化損傷[5,42,45-48,51-52,54]。ROS攻擊的主要目標(biāo)之一是質(zhì)膜和細(xì)胞器膜中的不飽和脂肪酸，引起膜脂過氧化[42,47-48,51-52,54]，膜透性上升，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+大量外滲[41]。ROS還能夠氧化蛋白質(zhì)側(cè)鏈中一些氨基酸的殘基，被ROS氧化的變性蛋白質(zhì)最終為蛋白水解酶降解。這可能是Cu2+脅迫下，杜氏鹽藻D.salina[47]、四鞭藻Tetraselmisspp.[49]等細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量和種類減少的原因之一。此外，ROS可將DNA分子中的鳥嘌呤氧化，若此時(shí)DNA損傷修復(fù)失敗，則進(jìn)一步導(dǎo)致堿基由G變?yōu)門，發(fā)生DNA突變[23]。Cu2+能導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生，海洋浮游植物細(xì)胞中的抗氧化防御系統(tǒng)能在一定范圍內(nèi)清除ROS，保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫。因而，在Cu2+脅迫下，海洋浮游植物細(xì)胞內(nèi)的多種抗氧化酶（CAT、SOD等）活性及抗氧化劑（GSH等）含量發(fā)生變化[5,33,42,45-52,54]。

2.2.3Cu對(duì)光合作用的損傷 Cu脅迫對(duì)海洋浮游植物的光合作用的毒性作用機(jī)制是多方面的，可概括為：1）Cu2+可以替換葉綠素卟啉環(huán)中的Mg2+[9]，生成銅代葉綠素，銅代葉綠素?zé)o法行使正常葉綠素的捕光功能，即有效葉綠素含量降低[5,40,42,45,47-48]，導(dǎo)致海洋浮游植物的光合作用受到抑制。2）過量的Cu損傷葉綠體的膜系統(tǒng)[42]，改變?nèi)~綠體或類囊體的結(jié)構(gòu)。類囊體存在于葉綠體基質(zhì)中，其膜上含有光合色素和電子傳遞鏈組分。Cu脅迫導(dǎo)致細(xì)胞葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)遭破壞，基粒堆疊結(jié)構(gòu)解體，因而提供給暗反應(yīng)的ATP和還原氫減少，直接導(dǎo)致光合速率降低。3）抑制光合作用相關(guān)的酶活性或降低其含量，影響光合速率。例如二磷酸核酮糖羧化酶，它催化卡爾文循環(huán)中最初固定CO2的反應(yīng)。Cu脅迫可以抑制該酶的活性，并降低海洋浮游植物細(xì)胞內(nèi)該酶的含量[42,49]。4）降低光系統(tǒng)的電子傳遞效率[43-44]。電子傳遞鏈中傳遞電子的載體脫氫酶絕大多數(shù)包含鐵硫簇（Fe-S），由于Cu極化性比Fe強(qiáng)，因此相對(duì)Fe而言更加親巰基，所以Cu競(jìng)爭(zhēng)性與硫結(jié)合形成“Cu-S簇”，抑制脫氫酶活性，造成電子傳遞不暢，導(dǎo)致光合作用受到抑制[27,42-44,46,49]。同時(shí)，溢出的電子還會(huì)與氧結(jié)合形成ROS，造成細(xì)胞氧化損傷。

除此之外，過量的Cu進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)會(huì)與DNA的磷酸羥基或二硫鍵結(jié)合，誘發(fā)DNA之間、蛋白質(zhì)之間以及DNA和蛋白質(zhì)之間的分子內(nèi)和分子間交聯(lián)[23]。Cu脅迫還可能導(dǎo)致DNA甲基化異常，直接影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平，最終引起基因調(diào)控紊亂和蛋白質(zhì)合成受抑制[5,23,42,44,47,49]。研究表明，在Cu的脅迫下四鞭藻Tetraselmissp.細(xì)胞內(nèi)微管蛋白含量減少[49]。微管蛋白在浮游植物的生長(zhǎng)和發(fā)育中起到維持細(xì)胞形態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞分裂的作用。這可能是Cu脅迫抑制海洋浮游植物細(xì)胞生長(zhǎng)速率的原因之一。

3 展望

近年來關(guān)于重金屬污染對(duì)海洋浮游植物的毒性作用機(jī)制研究，主要以單種浮游植物為研究對(duì)象，測(cè)試指標(biāo)以細(xì)胞生長(zhǎng)速率、抗氧化酶活性、葉綠素?zé)晒馓匦詤?shù)等生理生化水平指標(biāo)為主。本研究表明海洋浮游植物對(duì)同一種污染物的響應(yīng)具有物種差異性，而在自然海洋環(huán)境中往往是多種浮游植物和多種污染物共存。因此，在今后的研究中，筆者認(rèn)為應(yīng)該重點(diǎn)考察重金屬元素對(duì)多種浮游植物共存時(shí)的毒性機(jī)理研究，這樣結(jié)合實(shí)際情況才能為保護(hù)生態(tài)環(huán)境提供更大的幫助；加強(qiáng)重金屬元素在海洋浮游植物亞細(xì)胞水平上的遷移、轉(zhuǎn)運(yùn)、積累的研究，基于高通量手段檢測(cè)生物體在重金屬脅迫下基因、蛋白質(zhì)和代謝物等的全部信息變化，以便更全面系統(tǒng)地詮釋重金屬對(duì)海洋浮游植物的毒害機(jī)理。