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（上海市農業(yè)科學院 a.林木果樹研究所；b.上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403）

‘鳳丹’Paeonia ostii為原產(chǎn)我國的芍藥屬名貴花卉，栽培歷史悠久，集觀賞和藥用價值于一身，素有“花中王后”的美譽?！P丹’籽油分含量高，可食用，因富含亞麻酸等對人體健康有益的不飽和脂肪酸，具增強人體免疫力和延緩衰老等保健功能[1]。目前，我國牡丹產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，對于新優(yōu)品種的需求與日俱增，然而牡丹育種技術單一落后，多采用傳統(tǒng)雜交育種，無法滿足市場需求。利用先進的轉基因、基因編輯技術進行新優(yōu)品種選育是牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向，而這些技術的應用均依賴于高效誘導與再生體系的建立。

高等植物再生主要包括組織修復（tissue repair）、器官發(fā)生（organogenesis）和體細胞胚胎發(fā)生（somatic embryogenesis）[2]。體細胞胚胎發(fā)生一般是指在未經(jīng)生殖細胞融合的情況下植物體細胞模擬合子胚胎發(fā)生發(fā)育形成完整新個體的過程，是誘導植物細胞實現(xiàn)全能性的一種形式。20 世紀90年代，Sangwan 等[3]和Wu 等[4]報道了以擬南芥未成熟合子胚作為外植體誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織，進而誘導體細胞胚胎發(fā)生。之后，在較多木本植物中也成功誘導了體細胞胚胎發(fā)生。在體細胞胚胎誘導過程中，植物激素起非常重要的作用，通常用生長素類似物（如2,4-D）等處理后，可觀察到愈傷組織和胚性細胞團的產(chǎn)生[5]。近年來，毒莠定（Picloram，PIC）、麥草畏（Dicamber，DIC）等生長素類除草劑也被用于植物體細胞胚再生的相關研究中，并取得較好的效果。國內外關于牡丹組織培養(yǎng)及再生相關研究已有報道，主要涉及快繁體系的建立和優(yōu)化[6-9]，以合子胚為外植體的愈傷組織再生技術體系的建立[10]，以鱗芽為外植體建立快繁體系[11]，誘導外植體愈傷組織[12-16]，通過莖尖培養(yǎng)獲得再生苗[17]，減輕牡丹愈傷褐化現(xiàn)象發(fā)生[18-19]，促進生根[20]等方面。關于牡丹體細胞胚胎發(fā)生途徑的研究報道相對較少。殷麗青等[21]以牡丹品種‘鳳丹’的不同外植體為材料，研究了不同濃度PIC 對愈傷組織及體細胞胚胎發(fā)生的影響，并建立了牡丹高頻體細胞胚發(fā)生體系，但獲得的再生植株較少。朱向濤等[22]建立了‘鳳丹’的體胚誘導技術體系，但誘導率僅38.33%。秦磊等[23]開展了牡丹‘Golden era’愈傷組織發(fā)生和分生結節(jié)形成的細胞組織學研究。雖然關于牡丹組織培養(yǎng)再生體系已有一定的研究基礎，但是仍存在愈傷分化率低、極易褐化、生根困難等難題，再生效率和生根率等有待提高，而且目前完整的再生體系成功應用于轉基因的研究鮮見報道。‘鳳丹白’為江南牡丹群‘鳳丹’的系列品種之一，本研究中以‘鳳丹白’成熟的合子胚為試驗材料，通過摸索適宜的植物生長調節(jié)劑及其濃度，建立愈傷組織誘導及增殖技術體系，并對不同狀態(tài)的愈傷組織開展形態(tài)學和組織細胞學鑒定，確定具分化潛能的胚性愈傷組織，旨在為牡丹再生技術體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

單瓣白花‘鳳丹白’成熟種子由武漢市農業(yè)科學院林業(yè)果樹科學研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織誘導培養(yǎng)

選取健康飽滿的‘鳳丹白’成熟種子，用洗滌劑清洗表面，流水沖洗30 min，無菌水中浸泡2 ～3 d 后進行消毒。在無菌環(huán)境下先將種子用70%的酒精浸泡30 ～60 s，再用10%的次氯酸鈉表面消毒30 min，無菌水沖洗6 次，無菌濾紙吸干備用。用手術刀切開種子，剝取成熟胚接種于愈傷誘導培養(yǎng)基。

在改良MS 培養(yǎng)基（按WPM 培養(yǎng)基添加硝酸鈣）中添加0.5 g/L 水解酪蛋白（購自上海宇涵生物技術公司）和生長調節(jié)劑作為愈傷組織誘導培養(yǎng)基。其中，生長素類生長調節(jié)劑包括PIC、DIC、2,4-D、NAA，細胞分裂素類生長調節(jié)劑包括6-BA、TDZ、KT，均購自Sigma 公司，各處理中植物生長調節(jié)劑種類及其質量濃度配比見表1。用NaOH 將培養(yǎng)基pH 調為5.8±0.1，121 ℃滅菌20 min。每個處理接種3 瓶，每瓶接種10 個外植體，每個處理重復3 次。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，黑暗條件下培養(yǎng)，并觀察愈傷組織誘導情況，30 d后統(tǒng)計成活率和愈傷組織誘導率。

表1 ‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導培養(yǎng)基中植物生長調節(jié)劑的種類及其質量濃度Table 1 Types and concentrations of plant growth regulators used in callus induction medium of P.ostii cv.‘Phoenix White’ mg/L

1.2.2 愈傷組織增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)誘導的愈傷組織接種于愈傷組織增殖培養(yǎng)基中。除添加的植物生長調節(jié)劑外，愈傷組織增殖基本培養(yǎng)基與誘導培養(yǎng)基成分基本相同。其中，添加的生長素類包括PIC、DIC、NAA，添加的細胞分裂素類包括6-BA、TDZ、KT，均購自Sigma 公司。各處理中植物生長調節(jié)劑種類及其質量濃度配比見表2。每處理接種3 瓶，每瓶接種10 個外植體，每個處理重復3 次。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，黑暗條件下培養(yǎng)，并觀察愈傷組織增殖情況，30 d 后統(tǒng)計愈傷組織擴增率和擴增系數(shù)。

表2 ‘鳳丹白’愈傷組織增殖培養(yǎng)基中植物生長調節(jié)劑的種類及其質量濃度Table 2 Types and concentrations of plant growth regulators used in callus proliferation of P.ostii cv.‘Phoenix White’ mg/L

1.2.3 愈傷組織分類和鑒定

根據(jù)繼代培養(yǎng)后愈傷組織的生長情況、顏色、質地、形態(tài)、分散程度等對愈傷組織進行分類。將分割成小塊的不同狀態(tài)的愈傷組織置于體視顯微鏡（Nikon SMZ 745T）下觀察拍照，參照文獻[24]中的方法制作常規(guī)石蠟切片，并在光學顯微鏡（Nikon ECLIPSE E200）下采集圖像信息。結合形態(tài)學特征與石蠟切片鑒定是否為胚性愈傷組織，并統(tǒng)計誘導率等指標。

1.3 數(shù)據(jù)分析

外植體成活率為成活的外植體數(shù)占接種外植體數(shù)的百分比；愈傷誘導率為誘導出愈傷組織的外植體數(shù)占成活外植體數(shù)的百分比；愈傷擴增率為擴增愈傷數(shù)占接種愈傷數(shù)的百分比；愈傷擴增系數(shù)為培養(yǎng)30 d 后外植體質量較其初始質量的增加值占外植體初始質量的百分比。

使用SPSS 16.0 軟件采用單因素方差分析法（ANOVA）進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導培養(yǎng)

將成熟胚接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后膨大，培養(yǎng)5 d后子葉邊緣膨松（圖1A），培養(yǎng)9 d 后子葉邊緣出現(xiàn)裂縫（圖1B），培養(yǎng)14 d 后部分子葉邊緣膨大形成愈傷組織（圖1C），培養(yǎng)21 d 后2 片子葉均膨大形成愈傷組織（圖1D），培養(yǎng)30 d 后子葉基部膨大形成愈傷組織（圖1E）。部分外植體子葉邊緣膨大為白色球狀，后期不能繼續(xù)發(fā)育（圖1F）。

圖1 ‘鳳丹白’成熟胚在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上的狀態(tài)Fig.1 The status of mature embryo of P.ostii cv.‘Phoenix White’ on callus induction medium

誘導培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑的配比對種胚的愈傷誘導影響較大，各培養(yǎng)基中‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導情況見表3。由表3可知，在14種誘導培養(yǎng)基中，添加6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L NAA 的培養(yǎng)基中外植體成活率最高，為93.33%；添加6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L TDZ 的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導率最高，為70.61%；添加4 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中外植體成活率和愈傷組織誘導率均最低，且均為21.88%。誘導培養(yǎng)基中添加PIC、DIC、2,4-D 均能促進外植體愈傷組織的誘導，但添加PIC 和DIC 的促進效果明顯好于添加2,4-D。除了生長素類物質外，培養(yǎng)基中添加細胞分裂素對愈傷組織的狀態(tài)有影響，在添加相同質量濃度PIC 的培養(yǎng)基上，添加TDZ 的效果優(yōu)于添加6-BA，極顯著優(yōu)于添加NAA 和KT。

表3 不同培養(yǎng)基中‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導情況?Table 3 The effect of plant growth regulators on callus inductivity of P.ostii cv.‘Phoenix White’ %

2.2 愈傷組織的增殖培養(yǎng)

在添加不同配比的植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上，‘鳳丹白’胚性愈傷組織的增殖情況見表4。由表4可知，添加6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中愈傷擴增率最高，為97.78%，愈傷擴增系數(shù)最高，為19.97。

表4 不同培養(yǎng)基中‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織增殖情況Table 4 The effect of plant growth regulators on callus differentiation of P.ostii cv.‘Phoenix White’

在培養(yǎng)基中單獨添加0.2 或0.4 mg/L PIC 時，愈傷擴增率分別為55.78%、48.97%，且長期培養(yǎng)后會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L DIC時，愈傷擴增率為87.78%，長期培養(yǎng)后會出現(xiàn)褐化死亡。結果表明，高質量濃度的PIC 與低質量濃度的NAA 或6-BA 配合使用，利于愈傷組織增殖生長，愈傷組織胚性保持較好；培養(yǎng)基中添加低質量濃度的NAA、KT、PIC 和DIC，也有利于愈傷組織的增殖生長，但愈傷擴增率低于添加高質量濃度PIC 的處理；培養(yǎng)基中添加高質量濃度NAA 的處理中，有胚性愈傷組織分化為根的現(xiàn)象，培養(yǎng)基中添加細胞分裂素不利于愈傷組織的生長與分化。

2.3 愈傷組織的形態(tài)特征

2.3.1 外觀形態(tài)特征

初代培養(yǎng)中誘導的‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)2 ～3 次后，外觀如圖2所示。愈傷組織出現(xiàn)6 種形態(tài)特征：1）松散透明狀愈傷組織，繼代培養(yǎng)后仍為松散狀（圖2A）；2）致密白色霧凇狀愈傷組織，在解剖鏡下觀察其為顆粒狀（圖2B）；3）綠色愈傷組織，在解剖鏡下觀察其為綠色顆粒狀（圖2C）；4）致密片狀愈傷組織，解剖鏡下觀察其為透明狀細胞（圖2D）；5）絮狀披針形愈傷組織，整體呈松軟狀態(tài)，部分膨大增殖，無胚性（圖2E）；6）透明褐色愈傷組織（圖2F）。在這6 類愈傷組織中，松散透明愈傷組織的分散性最好，隨著培養(yǎng)時長的增加不褐化，仍保持良好的胚性，可增殖；致密白色愈傷組織和致密綠色愈傷組織質地較硬，增殖較快。這3 種愈傷組織為胚性愈傷組織。絮狀披針愈傷組織增殖快，質地松軟；致密片狀愈傷組織及透明褐色愈傷組織狀態(tài)差，不增殖。這3 種愈傷組織為非胚性愈傷組織。

圖2 ‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織的外觀形態(tài)Fig.2 The status of subcultured callus of P.ostii cv.‘Phoenix White’ on callus proliferation medium

在添加了6 mg/L PIC 和0.5 mg/L TDZ 或添加了6 mg/L PIC 和0.5 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基上，成熟胚外植體的愈傷誘導率高，誘導效果較好，且愈傷組織擴增2 ～3 代后形成松散透明、致密白色和致密綠色愈傷組織的比例高，分別為88.89%、82.35%和63.63%。在培養(yǎng)基中添加其他植物生長調節(jié)劑后，愈傷組織經(jīng)擴增產(chǎn)生致密片狀、絮狀披針形及透明褐色愈傷組織的比例較高，分別為70.00%、62.50%和83.30%。

2.3.2 組織細胞學形態(tài)特征

胚性和非胚性愈傷組織不但外觀形態(tài)差異明顯，而且其形態(tài)細胞學形態(tài)也存在明顯差異，‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織的組織細胞學形態(tài)如圖3所示。松散透明狀愈傷組織的細胞排列較緊密，細胞染色深，細胞核小，且有明顯的分生中心（圖3A）；致密白色愈傷組織的細胞排列緊密，細胞染色較淺，細胞核?。▓D3B）；致密綠色愈傷組織的細胞排列緊密，細胞染色深，細胞核小，有明顯的分生中心。結果表明，松散透明、致密白色和致密綠色愈傷組織的細胞為胚性細胞，有進一步分化出植株的可能。致密片狀愈傷組織的細胞染色淺，無明顯的胚性細胞及分生組織中心；絮狀披針形愈傷組織的細胞有明顯的細胞核，但細胞分散、排列不規(guī)則，無明顯的分生中心；透明褐色愈傷組織的細胞染色淺，部分細胞有細胞核，且細胞核大，大多數(shù)細胞排列不規(guī)則，無明顯的胚性細胞及分生組織中心。這3 類為非胚性愈傷組織，較難進一步分化出植株。

圖3 ‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織的組織細胞學形態(tài)Fig.3 Histological observation of callus tissues on P.ostii cv.‘Phoenix White’

3 結論與討論

本試驗中研究了不同的植物生長調節(jié)劑種類及其質量濃度對‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織增殖的影響，結果表明不添加植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上愈傷組織易褐化，添加少量NAA 易使胚性愈傷組織發(fā)育為根，極少分化出芽，添加高濃度的生長素PIC 和少量細胞分裂素容易使愈傷組織增殖，這一研究結果與張建偉等[25]對粗枝云杉的研究結果一致。誘導14 d 后，成熟胚開始形成愈傷組織，PIC 和TDZ 為適宜‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導和擴增的生長調節(jié)劑，繼代培養(yǎng)后松散透明、致密白色和致密綠色的愈傷組織具有分化潛能。

3.1 植物生長調節(jié)劑對成熟胚愈傷組織的誘導與增殖的影響

植物生長調節(jié)劑是誘導木本植物（如樟樹[26]、冬青[27]等）外植體形成愈傷組織的關鍵因素，應用于愈傷組織誘導的植物生長調節(jié)劑的種類越來越多。PIC 是一種化學結構類似于2,4-D 的除草劑[28]，目前已被廣泛應用于球根類植物胚性愈傷組織的誘導，且已取得良好效果[29-31]。DIC 是一種安息香酸系的除草劑，近年來也開始被應用于植物愈傷組織的誘導[32-33]。本試驗中研究了培養(yǎng)基添加PIC 或DIC 對成熟胚愈傷組織誘導效果的影響，結果表明培養(yǎng)基中添加這2 種植物生長調節(jié)劑對牡丹成熟胚愈傷組織的誘導效果均優(yōu)于添加2,4-D，胚性愈傷組織誘導率高，胚性好。殷麗青等[21]報道，在添加4.0 mg/L PIC 的培養(yǎng)基上，‘鳳丹’幼胚的愈傷誘導率達98.1%，效果優(yōu)于2,4-D，與本研究結果一致。本研究中培養(yǎng)基添加DIC 后的愈傷誘導率略低于添加PIC，但誘導效果的差異不顯著，說明除了PIC 外，DIC 也適用于牡丹成熟胚外植體愈傷組織的誘導。高濃度的生長素類和細胞分裂素類植物生長調節(jié)劑共同添加能顯著提高‘鳳丹白’的愈傷誘導率。TDZ 是一種人工合成的植物生長調節(jié)劑，具有細胞分裂素和生長素的雙重功能，在植物體內較為穩(wěn)定，比BA 活性高[34-35]。本研究中，在牡丹愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加TDZ 較添加6-BA 和KT 這2 種細胞分裂素有更好的效果，與Zheng 等[36]在大蒜愈傷組織誘導研究中得出的結果一致。

3.2 愈傷組織解剖結構

植物體細胞胚間接發(fā)生途徑一般是體細胞經(jīng)過重編程后形成胚性愈傷組織，再從愈傷組織中的胚性細胞分化形成體細胞胚。一般情況下，誘導體細胞胚產(chǎn)生的胚性愈傷組織從中柱鞘細胞和非中柱鞘類細胞發(fā)育而來，胚性愈傷組織形成后，其表面或內部產(chǎn)生由分裂旺盛、排列相對緊密的小細胞組成的胚性細胞團[37]。而非胚性愈傷組織的構成細胞一般大小不一致，細胞質稀，液泡較大，細胞分化能力差。

本研究中，牡丹愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)后出現(xiàn)不同的顏色和質地，組織學鑒定結果表明有的為胚性愈傷組織，有的為非胚性愈傷組織。在培養(yǎng)基中同時添加PIC 和細胞分裂素類植物生長調節(jié)劑，更容易誘導出具有再生潛能的胚性愈傷組織。在添加了6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L TDZ 或添加了6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基上，成熟胚外植體的愈傷誘導率高，誘導效果較好，且愈傷組織擴增2 ～3 代后形成松散透明、致密白色或致密綠色愈傷組織的比例高。在培養(yǎng)基中添加其他植物生長調節(jié)劑后，愈傷組織經(jīng)擴增產(chǎn)生致密片狀、絮狀披針形及透明褐色愈傷組織的比例較高。在仙客來[38]和朱頂紅[39]等植物的研究報道中也存在類似現(xiàn)象。

非胚性愈傷組織與胚性愈傷組織之間可以相互轉換，其取決于所添加植物生長調節(jié)劑的種類及其濃度和愈傷組織本身的狀態(tài)，只有具胚性的愈傷組織才可能分化出體細胞胚或再生植株。因此，對愈傷組織進行組織形態(tài)學鑒定有利于篩選可分化的組織材料。為實現(xiàn)不同類型胚性愈傷組織再生能力的早期鑒定，縮短不同品種牡丹再生體系建立的周期，下一步擬觀察統(tǒng)計胚性愈傷組織成苗率，并進行不同類型愈傷組織的轉錄組分析，嘗試開發(fā)與愈傷組織胚性和再生潛能相關的分子標記，并從分子水平闡明植物生長調節(jié)劑和培養(yǎng)基添加物促進胚性愈傷組織誘導的機制。