，，，，

（1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2.森林食品資源利用與質(zhì)量控制國家林業(yè)局重點實驗室，浙江 杭州 310023）

薄殼山核桃Carya illinoinensis(Wangenh.) K.Koch是胡桃科山核桃屬植物，因其性狀優(yōu)良和核仁營養(yǎng)價值高，在世界五大洲被廣泛引種栽培，是重要的世界性干果和油料作物[1-2]。薄殼山核桃是雌雄同株的風(fēng)媒花異交植物，按照雌雄花成熟期的先后，大致可分為雄先型和雌先型2 種類型[3]。不同品種在不同氣候條件下會存在花期不遇的問題，這是影響薄殼山核桃穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)的重要原因之一。美國是薄殼山核桃的原產(chǎn)地之一，目前也是薄殼山核桃的中心產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的85%以上。美國現(xiàn)有1 000 多品種，在建園時往往可以根據(jù)當(dāng)?shù)氐臍夂蛱攸c進(jìn)行有效的雜交配置，壯年林干果產(chǎn)量可達(dá)1 500 kg/hm2以上。雖然我國引種薄殼山核桃已有100 多年的歷史，但是目前生產(chǎn)上常用的品種僅幾十個。多年的生產(chǎn)實踐結(jié)果證明我國不少地區(qū)是薄殼山核桃的適生區(qū)，但是較多薄殼山核桃產(chǎn)區(qū)面臨產(chǎn)量低下和產(chǎn)量不穩(wěn)定的問題，尤其是廣大亞熱帶地區(qū)。造成這一現(xiàn)象的原因有多個方面，比如實際使用的品種較為有限，再加上引種時存在錯誤以及一些雜交后代定名混亂，難以進(jìn)行有效的親本選擇和親緣關(guān)系分析，更難以根據(jù)當(dāng)?shù)氐臍夂蛱攸c進(jìn)行有效的雜交配置。

目前，用于薄殼山核桃品種鑒定的分子標(biāo)記方法主要有RAPD[4-5]、SSR[6-9]、SRAP[10]、ISSR[11-12]和SNP[13]等。一般來說，SSR 和SNP 等標(biāo)記須進(jìn)行大量基因組或轉(zhuǎn)錄組的測序和分析[13-14]，得到穩(wěn)定性和多態(tài)性較好的標(biāo)記的成本較高。在利用SSR引物對薄殼山核桃進(jìn)行品種鑒定時，重復(fù)性檢測中也存在一些問題[7]，這主要是因為：一方面薄殼山核桃高度雜合，基因組大且有較多重復(fù)，導(dǎo)致SSR 引物存在一定的非特異性；另一方面，SSR 和SNP 這類標(biāo)記對檢測的要求較高，且檢測識別時存在一定的人為干擾。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步以及越來越多的薄殼山核桃基因組數(shù)據(jù)的公布，利用品種間基因組數(shù)據(jù)的差異挖掘序列特異性標(biāo)記（sequence characterized amplified region，SCAR）是一個提高分子標(biāo)記的穩(wěn)定性和特異性的辦法。本研究中通過對不同薄殼山核桃品種葉片DNA 進(jìn)行簡單基因組測序，尋找品種特異性的SCAR 標(biāo)記，旨在針對生產(chǎn)上常用品種從分子水平上開發(fā)出穩(wěn)定、特異的DNA 指紋標(biāo)記，為輔助實現(xiàn)薄殼山核桃品種準(zhǔn)確快速鑒定和親緣關(guān)系分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

薄殼山核桃樣品采集于建德薄殼山核桃基地，地理位置為119°32.86′E、29°33.76′N，海拔97.5 m。5月上旬，采摘植株新鮮嫩葉，冰浴運輸，當(dāng)天保存于-20 ℃冰箱中備用。所涉及的品種見表1。其中，Ind23 和Ind24 為不同來源的同一品種，Ind23 為20 世紀(jì)80年代從美國德克薩斯州美國山核桃試驗站引進(jìn)，Ind24 為1999年從美國國家無性系種質(zhì)資源庫（National Clonal Germplasm Repository）引進(jìn)?！靶巯取焙汀按葡取钡呐袛嗍歉鶕?jù)不同性別花剛開始成熟的時間，雄花是指花粉開始散粉，雌花是指柱頭出現(xiàn)可授粉狀態(tài)[3]。

表1 薄殼山核桃試驗品種及其生理特點Table 1 Experimental varieties and physiological characteristics of C.illinoensis

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取

葉片DNA 的提取采用新型快速植物基因組DNA 提取試劑盒（BioTeke，北京）。取各品種葉片樣品0.02 ～0.03 g，剪碎后放入2.0 mL 離心管內(nèi)，加入直徑3 mm 碳化鎢研磨珠2 顆，用液氮冰凍5 ～10 min，再用MM400 研磨儀（萊馳，德國）30 Hz 研磨2 min，然后按照試劑盒說明書操作。提取好的DNA 經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，然后用NanoDrop2000 超微量分光光度計檢測其質(zhì)量濃度，置于-20 ℃冰箱備用，使用前將DNA 質(zhì)量濃度稀釋標(biāo)定至20 ng/μL。

1.2.2 簡化基因組測序和分析

簡化基因組測序是基于RAD（restriction-siteassociated DNA sequencing）方法進(jìn)行的。具體步驟：提取高質(zhì)量DNA，使用多種限制性內(nèi)切酶對DNA樣品分別進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切試驗的結(jié)果選擇合適的酶，構(gòu)建長度為300 ～500 bp 的pair-end 文庫，用Illumina HiSeq PE150 測序文庫，獲得每種樣品的簡化基因組原始數(shù)據(jù)。

后續(xù)分析方法：1）對每種樣品中的Reads1（雙端PE 測序后前端的數(shù)據(jù)，即含有EcoRI 酶切位點AATTC 的片段）進(jìn)行比對聚類；2）對每種樣品的序列聚類結(jié)果進(jìn)行內(nèi)部比對，得到樣品內(nèi)部各序列位點信息；3）將不同樣品的序列互相進(jìn)行比對，尋找個體之間堿基差異信息，并根據(jù)樣品信息尋找亞群特異的序列位點；4）根據(jù)特異序列信息獲得雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到亞群特異的基因組片段。

具體組裝方法：1）使用cap3 軟件（http://seq.cs.iastate.edu/cap3.html）將Reads1 與Reads2 進(jìn) 行局部組裝；將特異Taq（unique Tag）與最長的組裝結(jié)果進(jìn)行連接（中間加入5 個“N”），獲得初步組裝結(jié)果；2）將某一樣品獲得的組裝Tag 與其他樣品的序列進(jìn)行blastn 比對，過濾掉相似序列，比對使用的軟件為blastn，參數(shù)e-value 為1×10-5。另外，在設(shè)計引物前，為了增加引物擴增的有效率，使 用MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對組裝結(jié)果進(jìn)行SSR 預(yù)測，剔除含有SSR 的組裝結(jié)果。

使用Vector NTI 9.0 軟件設(shè)計引物，各樣品特異片段的引物設(shè)計原則：引物長度18 ～22 bp，解鏈溫度56 ～62 ℃，產(chǎn)物長度150 ～300 bp。

1.2.3 SCAR 標(biāo)記開發(fā)

對使用上述引物預(yù)測的片段進(jìn)一步開展blast分析，挑選出與核桃（Juglans regia，現(xiàn)有全基因組數(shù)據(jù)中與薄殼山核桃最近物種）同源性最高的DNA 序列片段，作為后續(xù)SCAR 標(biāo)記開發(fā)的候選序列。對這些序列進(jìn)行PCR 篩選，挑選出23 個品種中存在多態(tài)性的DNA 條帶，切膠回收純化這些條帶，并利用PCR 引物進(jìn)行兩端測序，測序結(jié)果經(jīng)Vector NTI 9.0 軟件中的ContigExpress 拼接，將重測序得到的序列與之前的基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，補充這些序列中間的未知堿基（這些堿基之前以“NNN”表示），將得到的完整序列作為新的SCAR 標(biāo)記。

1.2.4 PCR 篩選

常規(guī)PCR 試驗所用試劑為BioTeke PCR MasterMix（BioTeke，北京），整個反應(yīng)體系除引物和模板外，均按照試劑手冊要求操作。在15 μL體系中，引物用量為上游和下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，模板為2 μL。用于直接測序前，反應(yīng)體系擴大到60 μL，模板為前面15 μL 產(chǎn)物稀釋1 000 倍?；旌隙鄬σ镞M(jìn)行PCR 反應(yīng)時，適當(dāng)調(diào)整每對引物的量，至最佳擴增效果，其他條件不變。所有PCR 反應(yīng)在Genepro Thermal Cycle（Bioer，杭州）PCR 儀上進(jìn)行，程序：94 ℃ 300 s，95 ℃ 10 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，共35 輪循環(huán)；72 ℃，300 s。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，排槍上樣各5 μL，泳道順序?qū)?yīng)樣品分別是Ind01，Ind13，Ind02，Ind14……。Marker為DL2000（Takara），條帶大小依次為2 000、1 000、750、500、250、100 bp，上樣量3 μL。EB染色和ChemiDoc（Biorad，北京）拍照。

1.2.5 親緣關(guān)系分析

在各品種中，所篩選較為穩(wěn)定的SCAR 標(biāo)記的有無，分別以“1”“0”進(jìn)行記錄，然后使用NTSYS 2.2 軟件建立聚類分支樹狀圖。首先用similarity 程序組中的SimQual 計算形似系數(shù)矩陣，然后使用Clustering 程序組中的SHAN 進(jìn)行計算，聚類方法選用UPGMA，其他參數(shù)按默認(rèn)設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAD 測序和差異分析

選取性狀差異較大的5 個品種的樣品進(jìn)行Illumina HiSeq PE150 測序，分別是Moore、Nacono、Van Deman、Davis 和Pawnee，測序結(jié)果見表2。一般情況下A 與T 數(shù)量相等，C 與G 數(shù)量相等，(A+T)/(C+G)的值則具有物種特異性。從表2可知，由于該簡化基因組文庫是對酶切片段附近的序列進(jìn)行測序，所以堿基并不平衡，且頭部5 個堿基為固定的“AATTC”序列，薄殼山核桃(A+T)/(C+G)的值約為1.63。從堿基長度質(zhì)量指標(biāo)Q20%和Q30%來看，該文庫堿基質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

表2 性狀差異較大的5 個薄殼山核桃品種樣品的高通量測序結(jié)果Table 2 Deep sequencing results of five C.illinoensis cultivars with different characteristics

測得的數(shù)據(jù)經(jīng)初步組裝、blast 分析、精確組裝和比較，得到各品種的特異序列。其中Ind23 特異序列數(shù)量最多，達(dá)1 080 條，而Ind03 最少，僅為553 條。分析這些片段的二級結(jié)構(gòu)、二聚體形成和堿基分布等，設(shè)計了1 133 對引物（表3）。再結(jié)合擴增產(chǎn)物與核桃基因組序列的同源性，挑選其中473 對作為最終候選引物。

表3 性狀差異較大的5 個薄殼山核桃品種特征序列和引物搜索Table 3 Searching for characteristic sequences and primers of five C.illinoensis cultivars with different characteristics

2.2 PCR 引物篩選結(jié)果

PCR 篩選結(jié)果表明，絕大部分條帶在各品種間無差異，僅86 對引物在23 個品種中產(chǎn)生多態(tài)性，約占引物數(shù)量的1/5，其中80 對單一條帶可用于后續(xù)分析（圖1）。

圖1 80 對SCAR 引物在23 個薄殼山核桃品種中的多態(tài)性分布Fig.1 The polymorphism distribution of 80 SCAR markers among 23 cultivars

2.3 用于品種鑒定的SCAR 引物及其組合

所開發(fā)SCAR 標(biāo)記，大多數(shù)在多個品種中僅產(chǎn)生1 個條帶，其中有極少數(shù)可以特異性指示單一品種（圖2）。但是，也有少量引物在各品種中產(chǎn)生的條帶數(shù)量存在差異（圖3），這些較為復(fù)雜的多態(tài)性有待深入研究。將產(chǎn)生多態(tài)性的這些單一條帶進(jìn)行組合，獲得一系列可用于品種鑒定的引物組合（表4），這些引物的具體信息見表5。

圖2 薄殼山核桃品種特異性SCAR 標(biāo)記引物對及單一條帶Fig.2 Cultivar-specific primer pairs and their unique bands of SCAR markers

圖3 薄殼山核桃某些SCAR 標(biāo)記引物的多態(tài)性Fig.3 Polymorphism of some scar markers in C.illinoensis

2.4 SCAR 標(biāo)記用于品種親緣關(guān)系的分析

利用80 對引物在各品種間的多態(tài)性，進(jìn)行24個薄殼山核桃品種的聚類分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，聚類結(jié)果與實際的親緣關(guān)系有部分一致性，但也存在不一致的地方。例如，來自不同產(chǎn)地的Ind23 和Ind24 同為Pawnee 品種，聚在一起；Ind07（Choctaw）是Success×Mahan 的后代，Ind13（Dependable）是Jewett×Success 的后代，二者聚在一起，可能與其有較近的親緣關(guān)系有關(guān)；Ind10（Barton）是Moore×Success 的后代，與Ind01（Moore）聚在一起。但是，Ind04（Forkert）是Success×Schley 的雜交后代，Ind07（Choctaw）是Success×Mahan 的雜交后代，同為Success 的雜交后代，二者在聚類關(guān)系上卻相差較遠(yuǎn)，這可能是其遺傳組合的不同造成的，也可能是因為所篩選SCAR 標(biāo)記較為有限，在分析親緣關(guān)系方面尚存在一定的局限性。

3 結(jié)論與討論

因為分子標(biāo)記能夠從DNA 水平反映品種遺傳的本質(zhì)，成為品種鑒定最為重要的依據(jù)之一。然而，因為品種之間的遺傳差異較小，挖掘其多態(tài)性位點較為困難，特別是獲得穩(wěn)定的序列特異性標(biāo)記更為不易。利用簡單基因組測序可以獲得大量的差異位點。薄殼山核桃品種繁多，本研究中通過對大量基因組測序數(shù)據(jù)的分析，再加上PCR的反復(fù)驗證，獲得了一批可用于薄殼山核桃品種鑒定的SCAR 標(biāo)記。雖然后續(xù)PCR 篩選的工作量較大，但SCAR 標(biāo)記有其明顯的優(yōu)點，比如可以通過普通的PCR 檢測條帶的有無，使用成本較低。研究結(jié)果也表明，400 多對引物擴增率雖然較高，但多態(tài)性比例并不高，因為這種簡單基因組測序是通過酶切后進(jìn)行的，測序的信息主要來源于酶切位點附近，如果品種的差異點正好出現(xiàn)在酶切位點上，那么測序就會出現(xiàn)差異條帶，但事實上由此設(shè)計的引物能在所有品種中擴增出相似的條帶，這也是該方法的局限性造成的。同時，也可以利用簡單基因組測序獲得大量的SNP 位點，研究初期由于參考了核桃基因組數(shù)據(jù)，未能得到可靠的SNP 數(shù)據(jù)。因此，現(xiàn)有這些測序數(shù)據(jù)有進(jìn)一步挖掘的潛力，比如利用薄殼山核桃品種87MX3-2.11 作為參考基因組[15]，后續(xù)將進(jìn)一步分析SNP 位點。

表4 用于薄殼山核桃品種鑒定的特異SCAR 標(biāo)記組合舉例Table 4 The combination of specific SCAR markers for identification of pecan cultivars

表5 用于薄殼山核桃品種鑒定的特異SCAR 標(biāo)記引物的具體信息Table 5 Detailed information of primers with specific SCAR markers for identification of pecan cultivars

續(xù)表5Continuation of Table 5

但是，PCR 擴增有時會出現(xiàn)一定的假陽性，SCAR 引物也不例外，有時條帶較弱，經(jīng)多次重復(fù)才能擴增。其關(guān)鍵是提取DNA 的質(zhì)量以及DNA的分裝等問題。DNA 提取方式是影響DNA 質(zhì)量的重要因素，SSR 標(biāo)記的擴增也是如此[16]。DNA的分裝也會影響標(biāo)記擴增的穩(wěn)定性。通常情況下，較高濃度的DNA 須稀釋后用于后續(xù)的擴增，而稀釋后經(jīng)常會面臨分裝的問題，由于DNA 是大分子，分裝會帶來分配不均的問題，有時會影響到試驗的重復(fù)性。而這一問題經(jīng)常被研究人員忽視。通過定量PCR 試驗證實，如果未較好地進(jìn)行分裝，那么即使是同一初始模板和同一引物分裝在不同PCR 管中也會有一定的擴增差異。因此在分裝DNA 樣品時，應(yīng)進(jìn)行必要的均質(zhì)化，如超聲波震蕩等，對標(biāo)記擴增的一致性有重要的作用。另外，擴增片段的大小也有重要影響，小片段更容易獲得具有一致性的擴增結(jié)果。就鑒定的方便程度來說，可以通過大小片段的組合進(jìn)行混合引物PCR，但為了取得較為穩(wěn)定的檢測結(jié)果，應(yīng)測試各引物的不同濃度組合[17]。另外，在本研究中有些引物能產(chǎn)生多條特異性片段，其在品種鑒定中可能具有獨特的價值，但是鑒于其多態(tài)性較為復(fù)雜，本研究中暫未考慮，這些位點有待深入研究。

圖4 基于80 對引物的24 個薄殼山核桃樣品的聚類結(jié)果Fig.4 Cluster analysis of 24 C.illinoensis samples based on 80 pairs of primers

利用分子標(biāo)記進(jìn)行聚類分析，有助于分析品種間的親緣關(guān)系，對于后續(xù)的雜交親本選育具有重要意義。本研究中利用分離到的80 個SCAR 標(biāo)記對現(xiàn)有24 種樣品進(jìn)行分析，因為標(biāo)記數(shù)量不夠多等原因，其結(jié)果存在與現(xiàn)有親緣關(guān)系不一致的問題，而來自薄殼山核桃品種園的雜交品種較多，后續(xù)將采集更多的品種進(jìn)行類似的遺傳分析。