劉相 康文燕 商玲玲 葛少華

山東大學齊魯醫(yī)學院·口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院牙周科山東省口腔組織再生重點實驗室山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室，濟南250012

牙周炎是一種由微生物、宿主免疫反應、環(huán)境和遺傳危險因素等多因素共同作用引起的慢性炎癥性破壞性疾病[1]，造成宿主牙周附著喪失、牙槽骨吸收，最終導致牙齒松動脫落[2]。目前的研究表明，菌斑生物膜是牙周炎的始動因素，但生物膜與宿主炎癥免疫反應之間的相互作用是牙周組織破壞的主要原因[3]，牙周致病菌攻擊宿主并激活免疫系統(tǒng)，誘發(fā)宿主慢性炎癥反應，進而損傷牙周組織[4]。牙齦卟啉單胞菌是一種重要的牙周致病菌，作為經(jīng)典的紅色復合體成員與慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是牙齦卟啉單胞菌細胞壁的主要構成成分，是一種重要的微生物毒力因子，可以引起宿主免疫反應，促使牙周組織破壞[6]。

牙齦炎癥反應是牙周炎的最初表現(xiàn)[7]，人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblast，HGF）是牙齦結(jié)締組織中最豐富的細胞，可直接與細菌和細菌產(chǎn)物相互作用，在牙周炎進展中起重要作用[8]。盡管HGF 不屬于天然的炎性細胞范疇，但它們可以提供信號來吸引和調(diào)節(jié)炎癥細胞的浸潤并清除必要部位的感染，還可以確保在初始炎癥解決后繼續(xù)清除浸潤的炎癥細胞，成纖維細胞功能失調(diào)可能會導致炎癥反應的時間延長，因此，HGF 在保護牙周組織免受外源性刺激方面發(fā)揮極其重要的作用[9-12]。LPS 刺激可誘導HGF 免疫反應并激活與炎癥基因的調(diào)節(jié)密切相關的核因子（nu‐clear factor，NF）-κB 信號轉(zhuǎn)導途徑，在牙周結(jié)締組織中誘導促炎細胞因子如白細胞介素（interleu‐kin，IL）-1、IL-6、IL-8 等的產(chǎn)生[8,13]。此外，在牙周炎反應過程中還觀察到超氧化物歧化酶2（su‐peroxide dismutase 2，SOD2）和趨化因子配體2（C-C motif ligand 2，CCL2）的上調(diào)[14-15]，從而形成牙周組織破壞的微環(huán)境。

西格列汀是一種新型的降糖藥物，于2006 年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局的批準而上市，可單獨使用或與其他藥物聯(lián)合使用來治療2 型糖尿病[16]。西格列汀除了具有顯著的降糖作用，還具有抗炎[17]、抗腫瘤[18]、腎臟保護[19]、心血管保護[20]和促組織再生[21]等多種生物活性和藥理作用。西格列汀的抗炎作用已有相關報道，可顯著降低2型糖尿病患者的促炎細胞因子如C 反應蛋白和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α，同時增加抗炎細胞因子IL-10 的表達[17]。此外，西格列汀也可通過抑制NF-κB的活性，在RINm細胞系中發(fā)揮抗炎作用[22]。然而，西格列汀對HGF 的免疫炎癥反應未見相關報道。因此，本研究的主要目的是初步探討西格列汀對LPS 誘導的HGF 炎癥反應的影響，并進一步闡明其潛在的分子學作用機制，為臨床應用西格列汀防治牙周炎提供基礎性理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Ea‐gle medium，DMEM）、磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）（Hyclone 公司，美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，BioInd 公司，以色列）；青-鏈霉素混合液（100 U·mL-1青霉素，100 mg·mL-1鏈霉素），Ⅰ型膠原酶、分散酶Ⅱ、西格列?。⊿igma Aldrich 公司，美國）；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（tris-buffered saline Tween，TBST）緩沖液、放射免疫沉淀測定（radio immu‐noprecipitation assay，RIPA）細胞裂解液、苯甲基磺 酰 氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）蛋白酶抑制劑（北京市索萊寶生物科技有限公司）；磷酸酶抑制劑（武漢市博士德生物工程有限公司）；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantity real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（Takara公司，日本）；IL-6、IL-8、CCL2 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測試劑盒（Biolegend 公司，美國）；細胞計數(shù)試劑盒（cellcounting kit，CCK）-8細胞活性檢測試劑盒（Dojin‐do公司，日本）；牙齦卟啉單胞菌LPS（InvivoGen公司，美國）；NF-κB 抑制劑BAY11-7082（Abcam公司，英國）；兔抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyc‐eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、兔抗人波形絲蛋白抗體、兔抗人角蛋白17 抗體、熒光標記山羊抗兔二抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（Proteintech公司，美國）；兔抗人NFκB p65、p-p65、p-IκBα，鼠抗人IκBα 一抗（Cell Signaling Technology 公司，美國）；增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）液、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Milli‐pore公司，美國）。

1.2 主要儀器

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLYMPUS公司，日本），羅氏480Ⅱ型qRT-PCR 儀（Roche 公司，瑞士），SPECTRO star Nano 酶標儀（BMG Labtech公司，德國），Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)（GE Healthcare Life Sciences公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 分離與培養(yǎng)HGF 從2018 年12 月至2019 年4 月在山東大學口腔醫(yī)院頜面外科招募6 名需拔除埋伏阻生齒的健康志愿者（16～20 歲，3 名男性和3 名女性；平均年齡18 歲），收集其術中切除的少量牙齦組織。該項目根據(jù)2013 年修訂的1975 年赫爾辛基宣言的指導原則，將研究項目告知所有志愿者，并簽署知情同意書。本研究方案已獲得山東大學口腔醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準（協(xié)議編號：GR201801）。

將分離出的牙齦組織直接浸入含有5%抗生素（100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1鏈霉素）的預冷DMEM 培養(yǎng)液中，迅速轉(zhuǎn)移到實驗室。在超凈工作臺內(nèi)，將牙齦組織轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中，用含5%抗生素的PBS 沖洗4 次，去除上皮后將結(jié)締組織剪成約1～3 mm2的碎片，將剪碎的牙齦組織轉(zhuǎn)移到含3 mg·mL-1Ⅰ型膠原酶和4 mg·mL-1分散酶Ⅱ的無菌EP 管內(nèi)，將EP 管置于37 ℃水浴鍋中消化組織2 h，每隔10 min 進行搖晃，促使其消化完全。消化完成后，加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中和消化液，1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清，利用含20%FBS 的DMEM 重懸細胞，將單細胞接種到T25 培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，當HGF 達到80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 傳代，傳代的HGF 以1∶3 的稀釋比在不含抗生素的10%FBS DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選取第3～5代的HGF用于后續(xù)實驗。

1.3.2 HGF的鑒定 將培養(yǎng)的第3代HGF以每孔4×104個的密度均勻接種于24 孔板內(nèi)，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱里孵育24 h 使細胞完全貼壁。用4%多聚甲醛液固定細胞30 min 后預冷PBS 沖洗3 遍，0.1%Triton X-100室溫下破膜15 min，加入含1%BSA的PBS 液體封閉30 min。棄去封閉液，分別孵育稀釋的波形絲蛋白一抗（1∶300）和角蛋白17 一抗（1∶300）4 ℃孵育過夜。棄染液，滴入含熒光的二抗（1∶500）孵育1 h，利用DAPI染核5 min，在暗室中的熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.3 CCK8 檢測細胞活性 將HGF 以每孔5 000個的密度接種于96 孔板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜。將細胞培養(yǎng)基更換為含0、0.1、0.25、0.5、5、10、100、200、500 和1 000 μmol·L-1西格列汀的新鮮培養(yǎng)基，與HGF 作用24、48 h 后，進行CCK-8 檢測。同時檢測 西 格 列 ?。?.1、0.25、0.5 μmol·L-1） 與LPS（5 μg·mL-1）[23]共同作用24 h、48 h 對HGF 活性的影響。各組培養(yǎng)結(jié)束后，棄去原有培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，每孔加入含10%CCK8的100μL DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)孵育2.5 h，使用酶標儀檢測各孔在450 nm 波長處的吸光度值。

1.3.4 實時熒光定量PCR 將HGF 以每孔2.5×105個的密度接種于6 孔板中，實驗分為5 組檢測不同濃度西格列汀對炎癥因子的影響，即空白對照組、LPS組、LPS+0.1μmol·L-1西格列?。↙PS+0.1）組、LPS+0.25μmol·L-1西格列?。↙PS+0.25）組、LPS+0.5μmol·L-1西格列汀（LPS+0.5）組，同時分別于12 和24 h 后收集培養(yǎng)上清液用于后續(xù)檢測。為了進一步證實西格列汀通過NF-κB 通路抑制炎癥因子 的 表 達，加 入5 μmol·L-1NF-κB 通 路 抑 制 劑BAY11-7082驗證通路，分為4 組：1）對照組：常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；2）LPS 組：加入5 μg·mL-1LPS；3）LPS+西格列汀組：加入0.5μmol·L-1西格列汀和5μg·mL-1LPS；4）LPS+NF-κB抑制劑BAY11-7082 組：加入5 μmol·L-1BAY11-7082 和5 μg·mL-1LPS，加藥培養(yǎng)24 h。使用TRIzol 法提取細胞總RNA，Nanodrop 超微量分光光度計檢測RNA 含量后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以1 000 ng 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用qRT-PCR 試劑盒和羅氏480Ⅱ型qRT-PCR 儀檢測IL-6、IL-8、SOD2 和CCL2 的mRNA 水平。以GAPDH 為管家基因，通過計算ΔCt（目的基因Ct-管家基因平均Ct），目標基因的表達水平表示為2-(ΔCt)。引物序列見表1。反應條件為95 ℃持續(xù)30 s 激活熱啟動酶，然后將cDNA 擴增45 個循環(huán)，包括在95 ℃變性5 s 和60 ℃延伸30 s。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗 1.3.4 所述的培養(yǎng)上清液用于檢測IL-6、IL-8 和CCL2 的蛋白濃度。將收集的培養(yǎng)上清液于4 ℃、12 000 r·min-1高速離心機內(nèi)離心5 min 去除細菌和死細胞沉淀后收集上清液，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測量450 nm 波長的吸光度值，計算細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和CCL2的蛋白含量。

1.3.6 蛋白提取及蛋白免疫印跡實驗 將HGF以每孔2.5×105個的密度接種于6 孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜，待細胞貼壁后根據(jù)實驗分組進行實驗。本研究利用NF-κB 信號通路抑制劑BAY11-7082 作為陽性對照，研究0.5μmol·L-1西格列汀對LPS 誘導的HGF 中NF-κB 信號通路變化的影響。本實驗分為4 組。1）對照組：常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；2）LPS 組：加入5 μg·mL-1LPS；3）LPS+西格列汀組：加入0.5 μmol·L-1西格列汀和5 μg·mL-1LPS；4）LPS+NF-κB 抑制劑BAY11-7082 組：加入5 μmol·L-1BAY11-7082 和5 μg·mL-1LPS。37 ℃條件下LPS 誘導2 h，待各組處理結(jié)束后棄掉原培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌3次，向各孔內(nèi)加入含有1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，將培養(yǎng)板置于冰上裂解30 min。使用細胞刮刀收集蛋白于離心管內(nèi)，超聲裂解后于4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液并轉(zhuǎn)移到新的離心管。使用BCA 蛋白測定試劑盒測定各組蛋白濃度，向每組加入蛋白上樣緩沖液后，于100 ℃條件下煮沸5 min 進行蛋白變性。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與以下一抗在4 ℃下孵育過夜：NF-κB p65，p-p65，IκBα，p-IκBα（1∶1 000）；GAPDH （1∶10 000）。次日，用TBST 洗滌3 次，辣根過氧化物酶結(jié)合的抗兔和抗小鼠二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次。ECL發(fā)光液顯影，并使用超靈敏成像儀進行掃描。使用Image J 1.44 軟件來定量蛋白質(zhì)表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 6 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，所有計量資料統(tǒng)計結(jié)果以Mean±SD 表示，用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF的分離和培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的HGF生長7 d后，倒置顯微鏡下觀察可見細胞呈集落樣生長，呈旋渦狀、放射狀排列（圖1A），細胞傳代到第4 代后，貼壁良好，生長旺盛，形態(tài)均一，細胞呈星形或長梭形，胞核呈圓形或卵圓形（圖1B、C）。

2.2 HGF的鑒定

細胞免疫熒光檢測的結(jié)果顯示：在體外培養(yǎng)的HGF 中，細胞波形絲蛋白染色呈陽性（圖2 中上），綠色熒光均勻分布在細胞漿內(nèi)，細胞核呈藍色熒光；細胞角蛋白17 染色呈陰性（圖2 中下），僅見細胞核呈藍色熒光，說明細胞來源于中胚層組織，無上皮組織來源細胞混雜。

2.3 西格列汀和LPS對HGF活性的影響

CCK8 結(jié)果表明，低濃度的西格列汀（0.1、0.25 和0.5 μmol·L-1） 作 用 于HGF 24、48 h，對HGF 的增殖沒有明顯影響（P＞0.05，圖3A、B）。與對照組相比，高濃度西格列?。?～1 000μmol·L-1）顯著地抑制細胞增殖（P＜0.001，圖3A、B）。結(jié)果表明：5 μg·mL-1LPS 單獨作用或與0.1、0.25 和0.5μmol·L-1西格列汀共同作用于HGF 24、48 h，對細胞增殖無明顯影響（P＞0.05，圖4A、B）?；诒静糠謱嶒灲Y(jié)果，本研究選取對HGF 無明顯毒性作用的低濃度西格列汀（0.1、0.25和0.5μmol·L-1）與5μg·mL-1LPS進行后續(xù)實驗。

圖1 分離和培養(yǎng)HGFFig 1 Isolation and culture of HGFs

圖2 HGF的鑒定 熒光顯微鏡 ×400Fig 2 Identification of HGFs fluorescence microscope ×400

圖3 不同濃度西格列汀對HGF活性的影響Fig 3 Effects of sitagliptin at different concentrations on HGFs viability

圖4 不同濃度西格列汀和5μg·mL-1 LPS共同作用對HGF活性的影響Fig 4 Effects of sitagliptin at different concentrations and 5μg·mL-1 LPS on the viability of HGFs

2.4 西格列汀對LPS 誘導的炎性細胞因子基因表達的影響

為了研究西格列汀對LPS 誘導的HGF 炎癥反應的影響，本研究通過qRT-PCR 檢測了西格列汀與LPS 共同作用12 h、24 h 后細胞內(nèi)CCL2、IL-6、IL-8和SOD2的基因表達水平。結(jié)果表明，相比于對照組，LPS顯著上調(diào)了HGF中CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 的基因表達水平（P＜0.000 1，圖5），且24 h 較12 h 上調(diào)更為明顯。西格列汀劑量依賴性地抑制LPS 上調(diào)的CCL2（P＜0.001，圖5A）、IL-6（P＜0.01，圖5B）、IL-8（P＜0.01，圖5C）和SOD2（P＜0.05，圖5D）的表達。西格列汀對CCL2、IL-6與IL-8的基因表達水平的影響在12 h和24 h呈現(xiàn)一致變化，而西格列汀抑制SOD2 的作用效果在24 h 較12 h 更為明顯，0.1 μmol·L-1西格列汀作用于HGF 12 h 對SOD2 的基因表達水平無明顯影響（P＞0.05，圖5D）。

圖5 西格列汀對LPS誘導的HGF炎癥細胞因子mRNA表達水平的影響Fig 5 Effects of sitagliptin on the mRNA expression levels of LPS-induced HGFs inflammatory cytokines

2.5 西格列汀對LPS 誘導的炎性細胞因子蛋白表達水平的影響

與對照組相比，HGF 經(jīng)LPS 刺激12 h 和24 h，培養(yǎng)上清液中的CCL2、IL-6、IL-8 蛋白表達量呈不同程度升高，且24 h 較12 h 升高更為明顯。西格列汀與LPS 共同作用于HGFs 12 h 和24 h 后，與單獨使用LPS 組相比，0.1、0.25 和0.5 μmol·L-1的西格列汀均顯著性地降低了炎性細胞因子CCL2的蛋白表達水平（P＜0.001，圖6A）；對于IL-6，西格列汀與LPS 共同作用于HGF 12 h，0.1、0.25 和0.5 μmol·L-1的西格列汀可明顯降低其表達（P＜0.000 1），而在作用24 h 時，低濃度的西格列汀（0.1μmol·L-1）對LPS 誘導的IL-6 蛋白表達沒有明顯的抑制作用（P＞0.05），而高濃度的西格列汀（0.25 μmol·L-1和0.5 μmol·L-1）則顯著性地抑制了LPS 誘導的IL-6 分泌（P＜0.05，圖6B）；對于IL-8的表達，西格列汀與LPS 共同作用于HGF 12 h 與24 h，0.25、0.5μmol·L-1西格列汀均可顯著性地降低LPS 誘導的IL-8 表達（P＜0.01），而0.1μmol·L-1的西格列汀作用24 h 可以顯著降低LPS 誘導的IL-8 表達（P＜0.01），作用12 h 則對IL-8 蛋白的分泌無明顯影響（P＞0.05，圖6C）。

圖6 西格列汀對LPS誘導的HGF炎癥細胞因子蛋白表達水平的影響Fig 6 Effects of sitagliptin on the protein expression levels of LPS-induced HGFs inflammatory cytokines

2.6 西格列汀對LPS 誘導的HGF 中NF-κB 信號通路的影響

蛋白免疫印跡檢測結(jié)果表明，LPS 刺激HGF 2 h可通過促進IκBα降解（P＜0.000 1）以及增加pp65 和p-IκBα 蛋白表達水平（P＜0.000 1），來激活NF-κB 信號通路，而在0.5 μmol·L-1西格列汀和5μmol·L-1BAY11-7082處理組，LPS的作用則明顯減弱（圖7）。qRT-PCR 分析結(jié)果表明，同正常對照組比較，LPS 組的CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 的基因表達含量明顯增加（P＜0.000 1，圖8），而同LPS 組相比，0.5 μmol·L-1西格列汀抑制LPS 上調(diào)的CCL2（P＜0.001，圖8A）、IL-6（P＜0.001，圖8B）、IL-8（P＜0.001，圖8C）和SOD2（P＜0.000 1，圖8D）的表達，5 μmol·L-1BAY11-7082 組CCL2、IL-6、IL-8 和SOD2 含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1，圖8）。

3 討論

牙周炎是一種炎性免疫破壞性疾病，主要表現(xiàn)為起初的牙齦組織慢性炎癥，隨后伴發(fā)牙周袋形成、牙槽骨骨破壞及牙齒松動脫落，慢性牙周炎已經(jīng)成為成年人牙齒缺失的主要原因[7]。牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌等牙周致病菌能通過產(chǎn)生多種致病物質(zhì)及代謝產(chǎn)物如LPS、丁酸、牙齦素等作用于牙周支持組織并誘發(fā)宿主免疫反應，進而產(chǎn)生過多的促炎細胞因子和趨化因子如IL-1、IL-6、TNF-α 等，形成炎癥微環(huán)境，最終破壞牙周組織[9,11,24-25]。先前的研究[26]證實，控制過量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生是治療牙周病的有效方法之一。

西格列汀作為一種新型的降糖藥物，已被廣泛應用于臨床，除了具有顯著的降糖作用外，還具有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等多向作用，具有廣泛的應用前景[18,27-28]。以往研究[29-30]表明，西格列汀通過介導抗炎和抗纖維化作用，在治療心血管疾病中發(fā)揮重要作用。在2型糖尿病的臨床試驗[27]中，西格列汀已被證實能明顯降低單核細胞中Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）-4、TLR2、趨化因子受體-2 等的表達，進而抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-6 的表達。牙周炎是一種炎癥性疾病，牙周炎發(fā)生時炎癥細胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α 等表達量顯著增加，炎癥因子的濃度與牙周炎的嚴重程度密切相關[31]。關于西格列汀對牙周炎的影響在以往研究中報道極少，有學者[32]通過動物實驗表明，每天10 mg·kg-1的西格列汀管飼可降低牙周炎大鼠IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 和一氧化氮合酶-2 的基因表達水平，但在該模型中未觀察到對牙槽骨和膠原組織的顯著保護作用，可能是因為在所用劑量中，這種基因表達的改變并不能促進膠原的增加或減少牙槽骨的吸收，說明西格列汀可能對牙周炎具有一定的抑制作用。本研究旨在通過明確西格列汀對LPS 誘導的HGF 炎癥反應的影響來初步探討西格列汀對牙周炎的治療是否會有作用。

圖7 西格列汀和BAY11-7082對LPS誘導的NF-κB通路活化的影響Fig 7 Effects of sitagliptin and BAY11-7082 on LPS-induced activation of NF-κB pathway

圖8 西格列汀和BAY11-7082對LPS誘導的炎癥因子表達的影響Fig 8 Effects of sitagliptin and BAY11-7082 on LPS-induced inflammatory cytokines

本課題目前的研究發(fā)現(xiàn)，LPS能顯著促進HGF中炎性細胞因子CCL2、IL-6、IL-8、SOD2的基因表達，而西格列?。?.1、0.25、0.5 μmol·L-1）能顯著抑制LPS 誘導的這些炎性細胞因子的上調(diào)。此外，在LPS 誘導的HGF 中，西格列汀處理可明顯抑制LPS 誘導的IL-6 和IL-8 蛋白的分泌。據(jù)報道[9]，炎性細胞因子的升高與牙周炎的骨吸收有關。IL-6 在破骨細胞生成和牙周疾病的發(fā)病機制中起促進作用[33]。IL-6和IL-8在所有牙周炎患者的牙齦組織中表達增高[34]。本實驗以5 μg·mL-1牙齦卟啉單胞菌的LPS 為刺激源，以HGF 為實驗對象成功建立炎癥模型，結(jié)果表明：西格列汀能不同程度地下調(diào)IL-6、IL-8 的基因表達及蛋白分泌水平，這些結(jié)果表明西格列汀在牙周炎的發(fā)病過程中，可能通過抑制LPS 導致的炎癥微環(huán)境來發(fā)揮其抗炎作用。

除促炎細胞因子，已經(jīng)證實SOD2的上調(diào)與牙周炎的嚴重程度呈正相關，SOD2 是一種重要的抗氧化酶，可導致分子氧或過氧化氫的產(chǎn)生[15]，而氧化應激相關的炎癥介質(zhì)與牙周炎密切相關[35]。本研究表明，LPS可上調(diào)HGF中SOD2的表達，而西格列汀可抑制其上調(diào)。該結(jié)果表明西格列汀可通過抑制LPS誘導的SOD2過表達，從而維持活性氧穩(wěn)態(tài)，進而發(fā)揮其保護牙周組織的作用。CCL2也被稱為單核細胞趨化蛋白-1，作為一種促炎趨化因子，可吸引單核細胞和中性粒細胞到牙周炎的炎癥部位發(fā)揮相應的作用，從而加速牙周炎的發(fā)展進程[14,36]。本 研 究中，LPS 誘導HGF 中CCL2 的表達升高，而西格列汀從基因和蛋白水平抑制了CCL2的升高，提示西格列汀可以減輕牙周炎癥。

轉(zhuǎn)錄和翻譯過程本身受許多因素影響，蛋白質(zhì)和mRNA 表達之間的差異很可能是基因表達的生物學結(jié)果。蛋白質(zhì)調(diào)控是多層次、多時間和多類型的，僅RNA 不能決定蛋白質(zhì)表達，諸如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白質(zhì)半衰期、合成速度之類的其他因素也影響蛋白質(zhì)表達水平[37-39]。這可能是低濃度的西格列汀（0.1 μmol·L-1）對HGF 中IL-6 和IL-8 的mRNA和蛋白的表達作用不一致的原因。

NF-κB 通路是參與激活促炎細胞因子表達的關鍵核轉(zhuǎn)錄因子，長期以來一直被認為是典型的促炎信號通路[40]。在正常情況下，NF-κB以其非活性形式存在于細胞質(zhì)中，p50/p65 與其抑制物IκB結(jié)合成三聚體，使其不能核易位。一旦受到NFκB 激活劑（如LPS）的刺激，細胞信號就會啟動并導致IκB 蛋白的磷酸化和降解。隨后，NF-κB p65 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，以調(diào)節(jié)炎癥細胞因子[41]。先前的研究[41-43]表明，NF-κB 在HGF 中表達，且慢性牙周炎患者的牙齦組織中NF-κB（p50/p65）激活率遠高于正常組織，該信號通路的激活在牙周疾病的發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用。本實驗證明了西格列汀能夠下調(diào)NF-κB p65 和IκBα的磷酸化水平以及IκBα 的降解，進而阻斷LPS 誘導NF-κB 信號通路激活，抑制炎性細胞因子IL-6、IL-8、CCL2 和SOD2 的表達，這與先前的研究[44]結(jié)果一致。同時，本研究將NF-κB 通路抑制劑BAY11-7082作為陽性對照，并探究其對HGF 中炎癥因子CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 mRNA和NF-κB通路的影響，結(jié)果表明：BAY11-7082 對CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 mRNA 的表達以及LPS 誘導的NF-κB 活化有抑制作用，說明阻斷NF-κB 通路可有效抑制LPS 引起的HGF 炎癥反應，這同西格列汀的效果相同，據(jù)此本研究推測，西格列汀對HGF 的抗炎作用很可能是通過阻斷NF-κB 活化，進而抑制炎癥因子的釋放，其可能的作用機制見圖9。

圖9 西格列汀在LPS誘導的NF-κB信號通路中的作用機制Fig 9 Putative mechanism for the role of sitagliptin in LPS-in‐duced NF-κB signaling pathway

本研究從體外實驗證明了西格列汀通過阻斷NF-κB 信號通路激活來抑制LPS 誘導的HGF 中炎癥反應，在未來的研究中，將進一步增加體內(nèi)實驗及臨床研究來驗證西格列汀在抗炎方面的作用，為未來研發(fā)西格列汀應用于牙周炎治療提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。