戴婷 何文明 麥一峰

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性進(jìn)行性疾病，以血管內(nèi)膜形成粥樣斑塊為特征，主要累及大中型動(dòng)脈，造成血管腔狹窄、血管壁彈性減弱[1-2]，從而引起相應(yīng)器官繼發(fā)性改變，重則導(dǎo)致腦卒中、心肌梗死等。在我國(guó)，AS 的患病率不斷上升，對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[3]。麝香保心丸是一種中藥制劑，含有七種常見(jiàn)的中藥物質(zhì)，包括麝香、人參提取物、牛黃、肉桂、蟾酥、蘇合香和冰片[4]，在冠心病中廣泛使用，并具有一定療效[5-7]，但目前對(duì)其抗AS 作用機(jī)制的研究并不深入。本研究使用載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠以建立AS 動(dòng)物模型，探討麝香保心丸對(duì)小鼠AS 斑塊形成的影響，并從脂質(zhì)代謝、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、斑塊穩(wěn)定性等方面探索相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)6 周齡健康雄性C57BL/6小鼠10 只，重量（20.0±2.0）g；6 周齡健康雄性ApoE-/-小鼠20 只，重量（25.0±1.8）g，均購(gòu)于北京維通利華公司，由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房飼養(yǎng)，批準(zhǔn)編號(hào)：2018-01。

1.2 藥物、試劑和儀器 高脂飼料購(gòu)自北京博泰宏達(dá)生物有限公司（批號(hào)：2017072304，規(guī)格2 kg）。麝香保心丸由上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。白介素（interleukin，IL）-1βELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems 公司，單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion 公司；HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；FS essential DNA green Marker 購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；引物均購(gòu)自深圳華大基因股份有限公司；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alphasmooth muscle actin，α-SMA）抗體（ab5694）、抗CD68 抗體（ab125212）和抗CD31（ab28364）抗體均購(gòu)自美國(guó)abcam 公司；免疫組化試劑盒、油紅O染色液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。全自動(dòng)生化分析儀為深圳庫(kù)貝爾生物科技有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)、PCR 儀為德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；熒光定量PCR 儀為美國(guó)Roche 公司產(chǎn)品（LightCycler 480Ⅱ）；冰凍切片機(jī)和酶標(biāo)儀均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；普通光學(xué)顯微鏡為日本Olympus 產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為Nikon 儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 10 只C57BL/6 小鼠作為對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)。20 只ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周建立AS 模型后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：APOE-/-模型組10 只，采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，1 mL/d；麝香保心丸組10 只，將麝香保心丸30 mg/kg溶于1 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1 mL/d，劑量按照小鼠與人體表面積換算成等效劑量。每組灌胃1 次/d，持續(xù)8 周后無(wú)小鼠死亡，處死各組小鼠，取血液及病理標(biāo)本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血清脂質(zhì)水平及IL-1β、MCP-1 水平檢測(cè)各組小鼠眼球靜脈取血約1 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min 后取上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density Lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，使用ELISA 法檢測(cè)各組小鼠血清中炎癥因子IL-1β 和促炎細(xì)胞因子MCP-1 水平。

1.3.3 主動(dòng)脈大體油紅O 染色 小鼠腹腔注射10%水合氯醛0.2 mL 麻醉，麻醉后立刻暴露心臟，經(jīng)左心室快速注射0.9%氯化鈉溶液以清除殘余血液，取小鼠心臟主動(dòng)脈開(kāi)口處至腹主動(dòng)脈腎動(dòng)脈分支處的主動(dòng)脈組織，分離周?chē)Y(jié)締組織后縱向剖開(kāi)血管，油紅O 染料染15 min，用70%酒精分化3 min，蒸餾水沖洗后平鋪拍照，采用Image J 軟件分析圖像。

1.3.4 主動(dòng)脈根部冰凍切片油紅O 染色 取用分離后的小鼠心臟及主動(dòng)脈，剪取小鼠心臟主動(dòng)脈開(kāi)口處的組織，4%多聚甲醛4 ℃過(guò)夜后再分別放入20%及30%蔗糖溶液梯度脫水處理各24 h，OCT 包埋后放入液氮速凍，-80 ℃保存。冰凍切片機(jī)以8 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，從顯微鏡下能觀(guān)察到主動(dòng)脈瓣膜形狀開(kāi)始進(jìn)行標(biāo)記，各組小鼠選取相同標(biāo)記號(hào)的切片進(jìn)行油紅O 染色。切片室溫回溫，蒸餾水浸泡1 min，60%異丙醇浸潤(rùn)2 min，油紅O 染液孵育15 min，60%異丙醇調(diào)色5 s，流水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸酒精分化3 s，流水沖洗反藍(lán)，中性樹(shù)脂封片。切片拍照后采用Image J 軟件分析圖片中AS 斑塊的面積。

1.3.5 小鼠主動(dòng)脈及肝臟組織中細(xì)胞因子、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織中IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、MCP-1、基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、自噬相關(guān)基因p62（Sequestosome 1，p62）和Beclin1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，肝臟組織中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）-2、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ATPbinding cassette transporter G1，ABCG1）mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。分別研磨小鼠主動(dòng)脈組織和肝臟組織，用TRIzol 試劑提取總RNA，測(cè)定RNA 濃度和純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后在熒光定量PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。PCR 反應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，PCR 循環(huán)95 ℃10 s，56 ℃20 s，72 ℃30 s，72 ℃延伸1 min，共45 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.6 主動(dòng)脈斑塊中α- 平滑肌肌動(dòng)蛋白（alphasmooth muscle actin，α-SMA）、CD68 和CD31 蛋白的表達(dá)檢測(cè) 選取相對(duì)應(yīng)編號(hào)的各組小鼠主動(dòng)脈根部冰凍切片，選用平滑肌細(xì)胞抗體α-SMA，巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68 和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31，按照免疫組化試劑盒步驟分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)量。在400 倍顯微鏡下觀(guān)察，免疫組化陽(yáng)性染色為棕黃色或棕褐色，每例隨機(jī)觀(guān)察3 個(gè)以上視野，陽(yáng)性率=平均光密度/陽(yáng)性著色面積×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 PCR 反應(yīng)引物序列

表2 各組小鼠血清脂質(zhì)水平比較（mmol/L）

2.1 各組小鼠血清脂質(zhì)水平比較 見(jiàn)表2。

由表2 可見(jiàn)，與對(duì)照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠血清TC、TG 和LDL-C均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），HDL-C水平雖有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平比較見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平比較（pg/mL）

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈組織中炎癥因子和細(xì)胞因子mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較（注：與對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與ApoE-/-模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。IL 為白介素，TNF 為腫瘤壞死因子，MCP 為單核細(xì)胞趨化蛋白，MMP 為基質(zhì)金屬蛋白酶）

由表3 可見(jiàn)，與對(duì)照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 各組小鼠主動(dòng)脈大體AS 斑塊油紅O 染色結(jié)果 見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

由圖1 可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈壁光滑平整，無(wú)AS 斑塊產(chǎn)生；ApoE-/-模型組小鼠主動(dòng)脈壁可見(jiàn)大量被油紅O 染紅的AS 斑塊，占整條主動(dòng)脈的比例約為26.3%±2.0%，斑塊大小不一，多位于動(dòng)脈分叉處；麝香保心丸組小鼠主動(dòng)脈壁可見(jiàn)AS 斑塊，占整條主動(dòng)脈的比例約為17.0%±1.3%，較ApoE-/-模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠主動(dòng)脈根部切片AS 斑塊油紅O 染色結(jié)果 見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。

由圖2 可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈根部切片中組織的形態(tài)正常，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌排列整齊，管腔內(nèi)無(wú)贅生物；ApoE-/-模型組小鼠主動(dòng)脈根部切片中可明顯觀(guān)察到中膜的平滑肌層被炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、破壞，管腔內(nèi)存在被油紅O 染成紅色的AS 斑塊組織，斑塊面積為（419 841±26 590）μm2，內(nèi)含大量膽固醇結(jié)晶和壞死核心；麝香保心丸組小鼠主動(dòng)脈根部也存在斑塊組織，斑塊面積為（533 710±24 309）μm2，較ApoE-/-模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠主動(dòng)脈組織中炎癥因子和細(xì)胞因子mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)圖3。

由圖3 可見(jiàn)，與對(duì)照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠主動(dòng)脈組織中IL-8、IL-1β、TNF-α、MCP-1、MMP-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠主動(dòng)脈組織中IL-8、IL-1β、TNF-α、MCP-1 和MMP-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.6 各組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)圖4。

由圖4 可見(jiàn)，與對(duì)照組小鼠比較，ApoE-/-模型組 小 鼠 肝 臟 組 織 中SREBP-2、LDLR、ABCA1 和ABCG1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠肝臟組織中SREBP-2、LDLR 和ABCA1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.7 各組小鼠主動(dòng)脈組織中平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞含量比較 見(jiàn)圖5（插頁(yè)）。

由圖5 可見(jiàn)，與對(duì)照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠主動(dòng)脈組織中平滑肌細(xì)胞含量降低，巨噬細(xì)胞含量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），內(nèi)皮細(xì)胞含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與ApoE-/-模型組小鼠比較，麝香保心丸組小鼠主動(dòng)脈組織中巨噬細(xì)胞含量減少（P＜0.05），而平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.8 各組小鼠主動(dòng)脈組織中自噬相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)圖6。

由圖6 可見(jiàn)，與對(duì)照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠主動(dòng)脈組織中自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ和Beclin1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），p62 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠主動(dòng)脈組織中p62 mRNA 相對(duì)表達(dá)量下降，Beclin1 和LC3-ⅡmRNA 相對(duì)表達(dá)量上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖4 各組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較（與ApoE-/-模型組比較，*P＜0.05；SREBP 為膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，LDLR 為低密度脂蛋白受體，ABCA1 為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1，ABCG1 為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1）

圖6 各組小鼠主動(dòng)脈組織中自噬相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較（與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與ApoE-/-模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。LC3-Ⅱ?yàn)槲⒐芟嚓P(guān)蛋白1 輕鏈3）

3 討論

異常的慢性炎癥反應(yīng)是加速斑塊發(fā)生發(fā)展和增加斑塊不穩(wěn)定性的主要因素[8]。在A(yíng)S 斑塊形成的過(guò)程中，各種刺激誘使內(nèi)皮細(xì)胞活化，增加炎性細(xì)胞因子和促炎因子的釋放，如IL-8、MCP-1 等，促進(jìn)了血液?jiǎn)魏思?xì)胞的募集和黏附[9]。單核細(xì)胞滲入內(nèi)皮下并被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，產(chǎn)生MMPs 和大量炎癥因子，加劇了局部炎癥反應(yīng)[10]，從而促進(jìn)了AS 斑塊的形成。MMP-1 屬于MMP 家族，能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)[9]，因此巨噬細(xì)胞分泌的MMP-1 增加會(huì)破壞細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡，加劇AS 斑塊的不穩(wěn)定，促進(jìn)斑塊的破裂。我們之前的研究已證明通過(guò)抑制炎癥可有效抑制AS 的進(jìn)程[11]，本實(shí)驗(yàn)在用麝香保心丸治療后，主動(dòng)脈組織中炎癥因子IL-8、IL-1β、TNF-α 和細(xì)胞因子MCP-1、MMP-1 的基因表達(dá)顯著下調(diào)，血液中IL-1β 和MCP-1 水平也顯著降低。因此，麝香保心丸可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)減緩AS斑塊的發(fā)展，并且也起到了穩(wěn)定AS 斑塊的作用。

此外，AS 斑塊的穩(wěn)定性與斑塊的形態(tài)相關(guān)，晚期A(yíng)S 斑塊中壞死核心區(qū)域的不斷擴(kuò)大會(huì)誘發(fā)斑塊破裂，引起急性心腦血管事件[8]。本研究顯示，麝香保心丸顯著減輕了整條主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部的AS斑塊病變負(fù)擔(dān)，小鼠AS 斑塊中的炎性巨噬細(xì)胞含量降低，壞死核心區(qū)域面積也有所下降，這都有助于增強(qiáng)AS 斑塊的穩(wěn)定性，對(duì)疾病的結(jié)果具有積極影響。

除了異常的炎癥反應(yīng)外，血脂異常，特別是血清LDL-C 水平升高，也是引起AS 發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[12]。肝臟是參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的重要器官，在維持血液和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平中發(fā)揮著重要的作用[13]。麝香保心丸在脂質(zhì)代謝中的調(diào)節(jié)作用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注，在其所含的多種化學(xué)成分中，有兩種膽汁酸，即熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，可抑制膽固醇的產(chǎn)生，治療高甘油三酯血癥[14]。與之前的結(jié)果相似[15-16]，在給予麝香保心丸治療8 周后，AS 小鼠的血脂代謝紊亂也有了明顯的改善，血清TC、TG 和LDL-C 水平明顯降低。肝臟中與膽固醇代謝密切相關(guān)的基因，如SREBP-2、LDLR 和ABCA1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)。SREBP-2 負(fù)責(zé)調(diào)控包括LDLR在內(nèi)的膽固醇合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，LDLR的表達(dá)上調(diào)使之與LDL 的結(jié)合增加，加快清除血液中的LDL，延緩AS 斑塊的發(fā)展[17]。ABCA1 則介導(dǎo)膽固醇流出至無(wú)脂的載脂蛋白A1，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)外流。因此，麝香保心丸可能通過(guò)加快膽固醇清除以及促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)減少AS 斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞的堆積，降低血液循環(huán)中過(guò)量的脂蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷而發(fā)揮抗AS 的作用。

研究表明，麝香保心丸可以清除活性氧，通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞線(xiàn)粒體依賴(lài)性凋亡而抑制AS 的發(fā)展[17]。自噬是一種保守的進(jìn)化過(guò)程，其通過(guò)溶酶體途徑降解并循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，從而積極響應(yīng)細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)以維持穩(wěn)態(tài)[18]。自噬缺陷或自噬能力受損會(huì)使細(xì)胞清除能力下降，引起應(yīng)激、氧化、炎癥反應(yīng)等，因此與AS 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。許多文獻(xiàn)報(bào)道也證明自噬在A(yíng)S 的發(fā)展中參與了脂質(zhì)代謝和膽固醇穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，AS 小鼠在麝香保心丸治療后，主動(dòng)脈組織中自噬相關(guān)基因P62 的表達(dá)量下調(diào)，而B(niǎo)eclin1 和LC3-Ⅱ的表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明麝香保心丸還可能通過(guò)激活自噬來(lái)抑制AS 斑塊的發(fā)展。

綜上所述，麝香保心丸能抑制AS 斑塊的發(fā)展，具有抗AS 的效果，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)，增加斑塊穩(wěn)定性，促進(jìn)膽固醇清除和逆轉(zhuǎn)運(yùn)，以及激活自噬有關(guān)。