王 紅 ，曹 君 ，張 敏 ，張士義 ，張季軍 ，劉俊杰 ，楊 鎮(zhèn) ，呂立濤 **

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110161）

羊肚菌屬（Morchella Dill.ex Pers.:Fr.），隸屬于子囊菌門（Ascomycata） 盤菌亞門（Pezizomycotina）盤菌綱（Pezizomycetes） 盤菌目（Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae）[1]，因其菌蓋有不規(guī)則的凹陷褶皺，狀如羊肚而得名，是一種珍貴的食（藥）用真菌。自羊肚菌屬建立以來，科研人員針對(duì)其生態(tài)分布、分類鑒定、菌種保育及栽培技術(shù)等開展了大量的研究。羊肚菌在亞洲、歐洲、北美洲等均有分布[2-5]。目前，已記錄羊肚菌種和變種的數(shù)據(jù)多達(dá)344個(gè)[6]，其中中國分布有羊肚菌30種[7]，以溫帶落葉闊葉林、高海拔暗針葉林及針闊混合林為羊肚菌的主要植被生境[8-9]。羊肚菌主要在3月～5月出菇[2]，僅有少數(shù)物種在7月及9月～10月出菇[8，10]。

根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法，羊肚菌分為黃色羊肚菌（yellow morels）、黑色羊肚菌（black morels）和半開羊肚菌（semifree capped moerls），而發(fā)育過程中，其形態(tài)特征會(huì)受到環(huán)境的影響，且物種間宏觀顯微特征有限，會(huì)引起同物異名和同名異物的現(xiàn)象[11-14]。2000年，Taylor等[15]提出了多基因系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育種識(shí)別法（genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR），為羊肚菌精準(zhǔn)分類提供了方向。2011年，O’Donnell等[16]首次利用GCPSR的方法，基于ef1-α、LSU、rpb1和rpb2的核苷酸序列，將羊肚菌分為Elata Clade（黑色羊肚菌支系）、Esculenta Clade（黃色羊肚菌支系） 和Rufobrunnea Clade（變紅羊肚菌支系）。目前，國內(nèi)外已有許多地區(qū)采用GCPSR對(duì)羊肚菌資源進(jìn)行系統(tǒng)分類的報(bào)道[17-22]，以從分子系統(tǒng)分類學(xué)角度，糾正或彌補(bǔ)羊肚菌分類上的錯(cuò)誤和不足。

1987年開始，郭浩等[23]對(duì)遼寧省陸續(xù)進(jìn)行實(shí)地考察，對(duì)野生羊肚菌的生態(tài)分布、分類鑒定、馴化栽培等進(jìn)行了研究。而野生資源分類鑒定方面，僅根據(jù)形態(tài)特征分類[23-25]，除本課題組對(duì)遼寧省康平地區(qū)羊肚菌資源[26-27]及羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Morchella MLST database）[28]中涉及的遼寧省沈陽市和丹東市兩個(gè)采樣點(diǎn)采用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行分類鑒定外，未見依據(jù)分子生物學(xué)標(biāo)記專門針對(duì)遼寧省野生羊肚菌進(jìn)行分類鑒定的報(bào)道。

通過調(diào)查遼寧省的羊肚菌資源及其發(fā)生環(huán)境，確定其種屬關(guān)系，探索其發(fā)生的適宜條件，旨在確定遼寧省擁有的羊肚菌種質(zhì)資源，為遼寧省野生羊肚菌的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)文獻(xiàn)記載[23-25]及實(shí)地調(diào)研，遼寧省野生羊肚菌主要分布在遼寧省東部山區(qū)和遼西的大凌河流域，出菇時(shí)間在每年的4月初～5月末，通常分布在楊樹林或楊樹林緣草地、河灘草等地。

根據(jù)出菇特征，2016年～2018年，在遼寧省的沈陽市、撫順市、鞍山市、朝陽市、丹東市、本溪市、阜新市7個(gè)市布點(diǎn)采樣。3年間，共采集羊肚菌子實(shí)體53份，分布于16個(gè)羊肚菌發(fā)生地。樣品采集地點(diǎn)以楊樹林為主，分布在東部山區(qū)的羊肚菌多發(fā)生在楊樹林中，樹林中腐葉較多，土壤多為褐色粘質(zhì)土壤；分布在大凌河流域的羊肚菌多發(fā)生在樹林緣草地、河灘草中，雜草叢生，土壤為黑褐色沙質(zhì)土，在樹林附近有小溪或水溝。試驗(yàn)采集樣品保存于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所食用菌所，采集樣本信息見表1。

表1 羊肚菌子實(shí)體樣本采集信息及居群Tab.1 Collection information and populations of Morchella spp.samples collected

1.2 形態(tài)鑒定

將采集的子實(shí)體，參照《羊肚菌生物學(xué)與栽培技術(shù)》[29]按照子實(shí)體顏色、形狀和脊背等特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類，然后采用組織分離法獲得菌絲體進(jìn)行顯微形態(tài)鑒定。

1.3 分子鑒定

1.3.1 總DNA提取

采用E.Z.N.A.TM Fungal DNA Kit試劑盒提取菌絲體的總DNA，將提取的總DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS序列擴(kuò)增

建立20 μL的PCR反應(yīng)體系，其中2×Easy Taq Mix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板DNA 0.8 μL，ddH2O 補(bǔ)至 20 μL。

ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性4 min，95℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。引物序列[29]見表2。

PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶測(cè)序。

1.3.3 多基因序列擴(kuò)增

建立20 μL的PCR反應(yīng)體系，其中2×Easy Taq Mix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，模板DNA 0.8 μL，ddH2O 補(bǔ)至 20 μL。

多基因擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性60 s，50℃退火30 s，72℃延伸 60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。引物序列見表2。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶測(cè)序。

表2 PCR引物序列Tab.2 PCR Primer sequences

1.4 ISSR序列分析

利用1.3.1提取的總DNA，建立15 μL的ISSRPCR反應(yīng)體系，其中2×Easy Taq Mix 7.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL，模板DNA 0.6 μL，ddH2O補(bǔ)至15 μL。引物序列見表3。

表3 ISSR-PCR引物序列Tab.3 ISSR-PCR Primer

ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性 45 s，53℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，38個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳90 min，電泳檢測(cè)，用凝膠成像儀記錄條帶數(shù)量及位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定

不同地區(qū)羊肚菌子實(shí)體形態(tài)特征見圖1、圖2、表4。

表4 不同地區(qū)羊肚菌子實(shí)體的大小Tab.4 The size of Morchella spp.in different areas

圖1 不同發(fā)生地采集的羊肚菌Fig.1 Morchella spp.collected from different habitats

圖2 羊肚菌菌絲顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Micromorphology of Morchella spp.

由圖1，圖2，表4可知，遼寧野生羊肚菌子實(shí)體偏小。子囊果4.9 cm～6.0 cm，菌蓋高2.88 cm～4.20 cm，最寬部位寬1.90 cm～3.30 cm，通常為圓錐形；主脊和橫脊交錯(cuò)組成不規(guī)則的凹坑；子囊果為棕黃色至深褐色；菌蓋與菌柄合生；菌柄長(zhǎng)0.8 cm～1.7 cm，寬0.4 cm～1.1 cm，近乎圓柱形；菌柄和菌肉同色，白色，中空。孢子橢圓型，表面光滑，孢子印深灰色。

2.2 分子鑒定

2.2.1 ITS分子鑒定

提取子實(shí)體總DNA，ITS序列擴(kuò)增測(cè)序，通過羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫Morchella MLST[27]比對(duì)，53份樣本為黃色系羊肚菌。采用MEGE 7.0進(jìn)化樹分析軟件，以黑色系羊肚菌Mel-10作為外群，采用Maximum Likelihood Tree法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

由圖3可知，53份羊肚菌樣本，通過NCBI網(wǎng)站查詢比較，均歸類為Esculenta Clade。其中8X01～8X06、 8C04 ～8C19、 8C91、 7S02 ～7S06、 7C01 ～7C02、7C05～7C06、6F01～6F02、6S02，共 35 份樣本與Mes-6同為一種；8D01～8D04，共4份樣本與Mes-21為同一種；8B01～8B02，共2份樣本與 Mes-8 為同一種；8C01～8C03、8D05～8D08、6A01～6A02、6S01、 6S04～6S05，共 12 份樣本與Mes-20和Mes-9聚在一起，共分為4個(gè)區(qū)域?；贗TS序列構(gòu)建的遼寧省野生羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹無法將第4區(qū)域中的12份樣本完全區(qū)分開來。因此，還需要采用GCPSR法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其種間關(guān)系。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogentic tree based on rDNA ITS sequence

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用GCPSR的方法，基于ef1-α、LSU、rpb1和ITS這4個(gè)基因的核苷酸序列，對(duì)53份羊肚菌樣品進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。多基因序列經(jīng)逐一多重比對(duì)后，利用Sequencematrix進(jìn)行多源數(shù)據(jù)合并，數(shù)據(jù)文件進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn)（partition homogeneity test，PHT），采用ILD Test檢驗(yàn)方法，P值為0.06，大于數(shù)據(jù)集可聯(lián)合的閾值0.05，表明4種基因序列可以聯(lián)合分析。采用最大簡(jiǎn)約法（most parsimony tree，MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4 遼寧省黃色羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yellow morels in Liaoning province

由圖4可知，與ITS系統(tǒng)發(fā)育樹一致，但略有差異。GCPSR法，將與Mes-9和Mes-20聚在一起的 12 份樣本區(qū)分開來，8C01～8C03、8D05～8D08、6A01～6A02，9份樣本與Mes-20聚成一類，6S01、6S04～6S05，3份樣本與Mes-9聚成一類。而8D01～8D04被分成兩部分，8D01～8D02與Mes-21聚成一類，8D03～8D04與Mes-7聚成一類，因此8D03～8D04的種屬關(guān)系還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 ISSR的統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 ISSR-PCR擴(kuò)增

以遼寧省分布最多的Mes-6為研究對(duì)象，32份樣本進(jìn)行擴(kuò)增，11條引物共獲得56個(gè)位點(diǎn)，片段大小分布在300 bp～2 000 bp，其中具多態(tài)性的位點(diǎn)51個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的91.07%。

2.3.2 遺傳多樣性分析

利用遺傳多樣性分析軟件POPGEN version，遼寧省野生羊肚菌遺傳多樣性分析見表5。

由表5可知，居群水平上，平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù) （Ne） 為 1.211 6±0.082 2，Nei’s基因多樣性（H） 為0.120 1±0.046 6，各居群多樣性信息指數(shù)為0.106 6～0.287 0，平均指數(shù)為0.177 4±0.069 5。居群之間，遺傳多樣性有顯著性差異，其中P8遺傳多樣性水平最高，采樣點(diǎn)位于朝陽北票市速生楊人工林中。P10遺傳多樣性水平最低，采樣點(diǎn)位于朝陽喀左老爺廟地區(qū)。

表5 野生羊肚菌遺傳多樣性水平Tab.5 Genetic diversity of Morchella

2.3.3 遺傳多結(jié)構(gòu)分析

利用Arlequin軟件分析遼寧野生羊肚菌居群的基因多樣性Nei’s結(jié)果表明，遼寧省Mes-6野生羊肚菌種居群遺傳有一定分化。6個(gè)居群總基因多樣度（Ht）為0.306 2±0.028 5，其中居群內(nèi)多樣度（Hs） 為0.120 1±0.009 8，居群間基因多樣度為0.186 1，居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.607 9，表明在物種水平上，居群間存在60.79%的遺傳變異，而居群內(nèi)存在39.21%的遺傳變異，居群間的遺傳分化大于居群內(nèi)?；蛄鳎∟m）為0.322 5，表明遼寧省野生羊肚菌在各地區(qū)存在非常有限的交流或短距離移動(dòng)。

2.3.4 居群聚類分析

Nei’s遺傳一致度與遺傳距離見表6。

由表6可知，運(yùn)用POPGEN version軟件分析獲得6個(gè)居群間的遺傳距離（D）和遺傳一致度（I），遺傳距離為0.084 6～0.492 1，遺傳一致度為0.611 4～0.918 9。

表6 Nei’s遺傳一致度與遺傳距離Tab.6 Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance

3 討論

羊肚菌資源種類豐富，營養(yǎng)和藥用建價(jià)值高，對(duì)羊肚菌種屬關(guān)系的鑒定是羊肚菌資源保育及其開發(fā)利用的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)羊肚菌研究是基于羊肚菌形態(tài)學(xué)和生態(tài)學(xué)，包括子實(shí)體形態(tài)觀察和顯微結(jié)構(gòu)觀察等。收集的53份遼寧省野生羊肚菌子實(shí)體，表面多凹坑，凹坑形狀不規(guī)則，棕黃色至深褐色；菌柄短且較細(xì)，乳白色，圓柱狀，表面光滑，符合羊肚菌的形態(tài)特征，可確定為羊肚菌，但很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。野生羊肚菌在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，形態(tài)特征受環(huán)境條件影響較大，由于連續(xù)3年春季降雨比較少，全年干旱，采摘時(shí)地面上菌帽清晰可見，菌柄高度小于1 cm，菌帽采摘時(shí)已失水嚴(yán)重，子實(shí)體大小也比往年小[24]。

羊肚菌種屬豐富、物種多樣，采用單一的分子標(biāo)記技術(shù)（如PCR-ITS，PCR-RAPD） 進(jìn)行鑒定，會(huì)出現(xiàn)同物異名和同名異物現(xiàn)象[14]。對(duì)收集的53份樣品ITS rDNA進(jìn)行測(cè)序分析，通過Morchella MLST數(shù)據(jù)庫比對(duì)，均屬于黃色羊肚菌支群，以Mes-10為外群，構(gòu)建羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹[28，30]；Mes-20、Mes-9和 12 份樣本 （8C01～8C03、8D05～8D08、6A01～6A02、6S01、 6S04～6S05，） 聚在一類，但無法精確鑒定這12份樣本種屬關(guān)系，可能導(dǎo)致同物異名現(xiàn)象發(fā)生。

多基因系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育種識(shí)別法（GCPSR法），是通過多基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行物質(zhì)界定，因此也被稱為多基因聯(lián)合分析法。通過對(duì)ef1-α、LSU、rpb1核酸序列測(cè)序[7，20]，結(jié)合ITS序列，采用MP法，構(gòu)建羊肚菌進(jìn)化樹，獲得遼寧省羊肚菌遺傳多樣性圖譜。通過GCPSR法，將ITS法精確鑒定的12份樣本與Mes-20和Mes-9清晰分開。

在基于ITS序列的物種多樣性的基礎(chǔ)上，結(jié)合ef1-α、LSU、rpb1三個(gè)片段，聯(lián)合分析，更準(zhǔn)確、全面地對(duì)遼寧省羊肚菌屬進(jìn)行了分析，并界定到具體的物種并正確命名。53份羊肚菌樣本被鑒定為5種，即 Morchella sp.（Mes-6）、Morchella sp.（Mes-8）、Morchella sp.（Mes-9）、Morchella sp.（Mes-20）、Morchella sp.（Mes-21），其中， Mes-20 和Mes-21為遼寧省新記錄種。8X01～8X06、8C04～8C19、8C91、7S02～7S06、7C01～7C02、7C05～7C06、6F01～6F02、6S02 鑒定為 Mes-6，8B01～8B02鑒定為Mes-8，6S01、 6S04～6S05 鑒定為 Mes-9，8C01～8C03、 8D05～8D08、 6A01～6A02 鑒 定 為 Mes-20，8D01～8D04鑒定為Mes-21。在羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫Morchella MLST[28]中，有遼寧省2個(gè)采樣點(diǎn)的數(shù)據(jù)，丹東采樣點(diǎn)收集的羊肚菌鑒定為Mes-8，康平采樣點(diǎn)收集的羊肚菌鑒定為Mes-6。對(duì)遼寧省康平地區(qū)羊肚菌資源[26]收集鑒定后，確定康平存在2個(gè)羊肚菌種，即Mes-6和Mes-9。收集的53份樣本，鑒定為5個(gè)種，經(jīng)比對(duì)，確定Mes-20和Mes-21為遼寧省新記錄種。該研究成果不僅豐富了遼寧省野生羊肚菌多樣性的菌種資源庫信息，還為野生羊肚菌的人工栽培及進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。遼寧省羊肚菌物種多樣性豐富，還需加強(qiáng)羊肚菌資源分類研究。

4 結(jié)論

利用11條ISSR引物對(duì)Mes-6的6個(gè)居群進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，遼寧省羊肚菌在居群水平上的遺傳多樣性較低。雖然遼寧省東部山區(qū)、大凌河流域特有的地理特征、生境特征，為豐富遺傳資源提供了孕育場(chǎng)所，但近些年人們對(duì)羊肚菌認(rèn)識(shí)越來越廣泛，人為濫采濫伐，造成了生態(tài)環(huán)境破壞和居群片段化，對(duì)遼寧省羊肚菌資源調(diào)查的準(zhǔn)確性造成了一定的影響。因此，需加強(qiáng)野生羊肚菌資源的保護(hù)，進(jìn)一步研究遼寧省羊肚菌種群進(jìn)化活躍區(qū)域，探索遼寧省羊肚菌種群、居群間的演化過程。