宋 政 馬麗霞 彭青枝 黃 徽 程銀琪

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2. 國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作湖北中心，湖北 武漢 430075)

茶葉和海苔是典型的鋁超富集植物。渠心靜等[1]調(diào)查了22種山茶科植物葉片中的鋁含量，其中茶樹新葉中的總鋁含量為3 910 mg/kg，老葉中總鋁含量高達11 124 mg/kg；尚德榮等[2]對中國主要海藻養(yǎng)殖區(qū)的紫菜和海帶中鋁含量進行檢測，壇紫菜中總鋁含量為53.2～2 714.6 mg/kg；筆者實驗室也曾發(fā)現(xiàn)某海苔(條斑紫菜)樣品中的總鋁含量高達5 000 mg/kg。據(jù)統(tǒng)計[3]，中國自2007—2019年的茶葉年消費量由83.6萬t增長至200.0萬t，茶葉消費群體達到4.9億。泡水飲用是茶葉的食用方式之一，這種方式被證明是安全的[4-6]，茶水中僅含有少量的鋁，這部分鋁幾乎不被吸收，而茶葉中富集的高含量鋁殘留在茶葉片中未被攝入人體。茶葉和海苔的另一種食用方式是直接攝入，茶葉與海苔作為常用的食品原材料通常被用來制作含茶或含海苔食品(如抹茶糕點、海苔麻花、即食海苔等)，在食用此類食品時，茶葉和海苔中的鋁均被全部直接攝入體內(nèi)，這些由茶葉和海苔引入的鋁的毒性尚不明確，相關(guān)研究也鮮有報道。

鋁的毒性與形態(tài)相關(guān)[7]，鋁離子毒性最大[8-9]，而有機鋁、絡(luò)合鋁無毒。鋁的形態(tài)取決于所處體系的pH值、配體種類及濃度和總?cè)芙庥袡C碳等因素，在細胞層級，不同的細胞部位化學環(huán)境存在差異，鋁分布在不同細胞部位時，其存在形態(tài)也不同。因此研究茶葉和海苔中鋁的亞細胞分布是解析其毒性的關(guān)鍵。Yoichi等[10]用微束質(zhì)子激發(fā)X射線熒光(micro-beam PIXE)分析成熟茶葉表皮細胞中鋁的分布，Roser等[11]用低能X射線熒光光譜法(LEXRF)定位茶葉表皮細胞中的鋁，而Carr等[12]采用的是能量色散X射線顯微分析(EDXMA)法。這些光譜類方法的優(yōu)點在于直觀地揭示出茶葉細胞中鋁的亞細胞分布，但分辨率有限。研究擬采用分辨率更高的透射電子顯微鏡—能譜法(TEM-EDS)分析茶葉和海苔中鋁的亞細胞分布，結(jié)合差速離心法和微波消解—電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)解析鋁在茶葉和海苔亞細胞尺度上的分布特征，探討茶葉和海苔中的鋁對人體的毒性作用，以期為茶葉和海苔中鋁的深入毒理學研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

場發(fā)射透射電子顯微鏡：Talos F200X型，賽默飛世爾科技有限公司；

超薄切片機：UC7型，徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：NexION 350X型，珀金埃爾默有限公司；

高速離心機：5810R型，艾本德有限公司；

渦旋混勻儀：Trayster digital型，艾卡儀器設(shè)備有限公司；

紫外—可見分光光度計：UH5300型，日立有限公司；

微波消解儀：Multiwave PRO型，安東帕商貿(mào)有限公司。

1.1.2 材料與試劑

茶葉：綠茶，湖北武漢某茶山；

海苔：條斑紫菜，江蘇連云港某水產(chǎn)養(yǎng)殖基地；

電鏡固定液、812包埋劑：武漢賽維爾生物科技有限公司；

Na2HPO4·2H2O、無水乙醇、丙酮、蔗糖、硫酸銨、硼氫化鈉、草酸銨、氫氧化鉀：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

鹽酸：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司；

二硫赤蘚糖醇：生物試劑，上海麥克林生化科技有限公司；

Tris試劑：純度≥99%，上海麥克林生化科技有限公司；

纖維素酶：50 U/mg，上海麥克林生化科技有限公司；

果膠酶：100 U/mg，上海麥克林生化科技有限公司；

堿性蛋白酶：200 U/mg，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶葉與海苔中鋁的分布 采用TEM-EDS法。取茶葉和海苔樣品，組織體積一般不超過1 mm×1 mm×1 mm，迅速投入電鏡固定液固定，并用真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h，轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱。0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。1%的鋨酸和0.1 mol/L 磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)室溫(20 ℃)固定5 h。0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。組織依次加入體積分數(shù)30%，50%，70%，80%，90%，95%乙醇和無水乙醇中進行脫水，每次1 h。依次用V乙醇∶V丙酮為3∶1，1∶1，1∶3的無水乙醇—丙酮混合液脫水，每次0.5 h，再純丙酮脫水1 h。然后依次用V丙酮∶V812包埋劑為3∶1，1∶1，1∶3的丙酮—812包埋劑混合液分別處理2～4，12，2～4 h，再用純812包埋劑包埋5～8 h，將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。60 ℃烤箱聚合48 h。用超薄切片機切成60～80 nm的超薄切片。在場發(fā)射透射電子顯微鏡下觀察、照相，并進行能譜分析鋁元素面掃。

1.2.2 差速離心法分離茶葉與海苔細胞壁、細胞器和細胞質(zhì)組分 根據(jù)Gao等[13]提出的方法分離海苔和茶葉的細胞壁、細胞器及細胞質(zhì)組分。取2.0 g海苔或茶葉于瑪瑙研缽中，加入10 mL研磨介質(zhì)(含250 mmol/L蔗糖溶液、1 mmol/L二硫赤蘚糖醇溶液和50 mmol/L pH為7.5的Tris-HCl)研磨均質(zhì)30 min，所有步驟均在4 ℃下操作。將均質(zhì)后的樣品裝入50 mL離心管用高速冷凍離心機于300×g下離心5 min，收集上清液，用研磨介質(zhì)清洗離心后的沉淀物，重復操作兩次，合并上清液，得到沉淀物為細胞壁組分。上清液繼續(xù)用高速冷凍離心機于20 000×g下離心45 min，得到沉淀為細胞器碎片組分，上清液為細胞質(zhì)組分。通過檢測細胞色素c氧化酶(線粒體的標記物)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(細胞質(zhì)的標記物)的活性來檢驗各組分的純度[14-15]。

1.2.3 細胞壁中果膠、半纖維素、纖維素的分離 細胞壁的化學成分為果膠、半纖維素、纖維素等[16]。根據(jù)Zhong等[17]的方法對細胞壁中果膠、半纖維素、纖維素進行分離提取。取1.2.2步驟中的細胞壁0.5 g于50 mL塑料離心管中，加入5 mL硼氫化鈉(質(zhì)量濃度0.1%)與草酸銨(質(zhì)量濃度0.5%)混合溶液，沸水浴1 h，10 000×g下離心15 min，重復提取3次后合并上清液，上清液中為果膠成分。沉淀中加入5 mL氫氧化鉀(質(zhì)量濃度4%)與硼氫化鈉(質(zhì)量濃度0.1%)混合溶液，室溫下以200 r/min振搖8 h，10 000×g下離心15 min，重復3次后，換成氫氧化鉀(質(zhì)量濃度24%)與硼氫化鈉(質(zhì)量濃度0.1%)混合溶液繼續(xù)提取3次，混合上清液，此步驟上清液為半纖維素成分。余下沉淀為纖維素成分。將得到的果膠、半纖維素溶液按王媛莉等[18]的方法進行處理，即加熱濃縮濾液至有少量固形物出現(xiàn)后，加1.2倍體積pH為2～3的體積分數(shù)95%的乙醇溶液，有絮凝物析出后靜置1 h，抽濾，棄去濾液，濾餅用體積分數(shù)95%的乙醇溶液洗滌2次，再抽濾后得棉絮狀果膠，45 ℃烘干備用，半纖維素同理可得。

1.2.4 人工模擬胃液提取試驗 取1.2.3步驟中0.5 g細胞壁分離的茶葉和海苔細胞壁果膠、細胞壁半纖維素、細胞壁纖維素組分，及茶葉細胞器組分、海苔細胞器組分、茶葉粉末、海苔粉末各0.2 g，用人工模擬胃液(按2015版藥典配制)5 mL，在37 ℃恒溫水浴下分別提取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 h。測定各提取液中鋁含量及各組分鋁的總含量，計算鋁的提取率。

1.2.5 鋁含量的測定 按GB 5009.182—2017的第二法——微波消解—電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法執(zhí)行。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 各指標測定均重復3次，以3次的平均值標示。

2 結(jié)果與討論

2.1 海苔和茶葉中鋁的亞細胞分布

2.1.1 差速離心法

(1) 海苔和茶葉細胞壁、細胞器、細胞可溶性組分中鋁的分布：如表1所示，茶葉中用微波消解-ICP-MS法測定的總鋁含量為398.0 mg/kg，按差速離心法分離的各組分中鋁含量加和為385.6 mg/kg，差速離心法的鋁回收率為96.9%，表明差速離心法破碎細胞過程中鋁的損失較小，僅為2.1%。茶葉細胞壁組分、細胞器組分和細胞質(zhì)組分中鋁的含量分別為304.0，43.5，38.1 mg/kg，結(jié)果表明，茶葉中78.8%的鋁分布在細胞壁中、11.3%的鋁分布在細胞器組分中，細胞質(zhì)組分中的鋁含量占9.9%。

海苔的亞細胞分布結(jié)果見表1，海苔中用微波消解-ICP-MS法測定的總鋁含量為735.00 mg/kg，按差速離心法分離的各組分中鋁含量加和為717.60 mg/kg，差速離心法的鋁回收率為97.6%。海苔細胞壁組分、細胞器組分和細胞可溶性組分中鋁的含量分別為658.00，49.80，9.76 mg/kg，結(jié)果表明，海苔中91.70%的鋁分布在細胞壁中、6.94%的鋁分布在細胞器組分中，而細胞質(zhì)組分中的鋁含量占1.36%。表明海苔生長過程中，吸收的大量鋁富集在細胞壁中。

茶樹中有高含量的鋁，其對鋁的毒性具有很高的耐受性[19]，表明茶樹可能有特殊的解毒機制。海苔生長在鋁含量較高的海水中，高含量鋁的海水環(huán)境可能也促使海苔形成了類似茶葉的解毒機制，在這種機制的作用下，茶葉或海苔細胞可以將吸收的鋁元素隔離在細胞中的特定區(qū)域，如細胞壁或液泡表面，而不影響其生命活動的正常進行，Gao等[13]對茶葉根和葉細胞的研究表明，茶葉根細胞壁中含有69.8%的鋁，葉細胞中含有75.2%的鋁，葉細胞壁中有97.3%的鋁與果膠和半纖維素結(jié)合。Rengel等[20]報道了珊瑚輪藻細胞中99.99%的鋁分布在細胞壁；Chang等[21]分析了煙葉中鋁的亞細胞分布，發(fā)現(xiàn)76%的鋁與煙葉細胞壁結(jié)合，與試驗中海苔和茶葉中鋁主要分布在細胞壁中的結(jié)論一致。

(2) 鋁在茶葉和海苔細胞壁果膠、半纖維素、纖維素中的分布：由表2可知，茶葉細胞壁中鋁在果膠中的分布占53.4%、鋁在半纖維素中占45.0%，而纖維素中鋁含量較低，僅為1.6%；海苔細胞壁中，鋁在果膠中的分布占比2.8%，在半纖維素中占比29.0%，而纖維素中鋁含量占68.2%。茶葉和海苔細胞壁果膠中鋁含量的差異可能是由茶葉和海苔中果膠甲酯化酶含量的差異造成，茶葉中果膠甲酯化程度較低，羧基含量較高，因此對鋁的吸附量高，海苔中果膠甲酯化程度較高，羧基含量少，對鋁的吸附量降低。而半纖維素和纖維素中的鋁含量差異推測是由于結(jié)合在其中的有機酸類物質(zhì)含量差異造成的。

表1 茶葉和海苔中鋁在細胞壁、細胞器、細胞質(zhì)中的分布

表2 茶葉和海苔細胞壁果膠、半纖維素、纖維素中鋁的分布

2.1.2 TEM-EDS分析 圖1可見清晰完整的茶葉細胞顯微結(jié)構(gòu)，包括細胞壁、原生質(zhì)體、液泡結(jié)構(gòu)及部分其他細胞器。對比同一細胞中鋁的EDS面掃分布結(jié)果(圖2)，細胞壁及液泡結(jié)構(gòu)上鋁元素分布密集，而細胞質(zhì)中鋁元素分布稀少，表明鋁主要在茶葉的細胞壁和液泡上富集，這一結(jié)果與差速離心法吻合。

圖3為海苔細胞的TEM顯微圖，可見海苔細胞的單層片狀排布細胞結(jié)構(gòu)，單個細胞中細胞壁結(jié)構(gòu)完整。對比相同位置鋁的EDS面掃分布結(jié)果(圖4)，可見細胞壁及細胞器碎片上鋁元素分布密集，而細胞質(zhì)中鋁元素分布稀少，這一結(jié)果與差速離心法吻合。

2.2 海苔和茶葉中鋁的模擬攝入和風險性分析

由于茶葉和海苔中的鋁在細胞壁和細胞器中的含量占鋁總含量的比例較高，茶葉為89.6%，海苔為98.6%，因此，細胞壁和細胞器中的鋁的形態(tài)是解析其生物毒性的關(guān)鍵。用人工模擬胃液提取了茶葉粉末、茶葉細胞器組分和茶葉細胞壁組分進一步分離的果膠、半纖維素、纖維素等。由圖5可知，果膠、半纖維素和纖維素組分中的鋁提取率均較低，僅為1%左右，而細胞器中鋁的提取率略高于細胞壁，細胞壁和細胞器中鋁的提取率隨提取時間變化幅度較??；直接提取粉碎后的新鮮茶葉樣品，經(jīng)過8 h提取后提取率達到9.48%。粉碎的新鮮茶葉中人工模擬胃液提取出的鋁推測主要是由茶葉細胞質(zhì)組分貢獻的，極少部分來自細胞壁和細胞器。

圖1 茶葉細胞TEM圖Figure 1 Cell of tea leaves by TEM

圖2 茶葉細胞中鋁的分布Figure 2 Distribution of Al in tea leaves cell

由圖6可知，海苔中果膠、半纖維素、纖維素和細胞器中經(jīng)8 h提取的鋁均低于1.0%，直接提取粉碎的海苔鮮樣，鋁的提取率也僅為1.3%，表明海苔細胞壁和細胞器中的鋁難以被人工模擬胃液溶出，而海苔細胞質(zhì)中的鋁可能以離子或可溶性鹽的狀態(tài)被人工模擬胃液提取。

茶葉和海苔的特殊解鋁毒機制，使其在生長過程中將吸收的鋁轉(zhuǎn)運至細胞壁，細胞壁中的鋁除了與果膠多糖的羧基結(jié)合外[21]，在茶葉中，鋁也和細胞壁半纖維素和纖維素中的有機酸及酚類物質(zhì)結(jié)合[22-23]，作用位點同樣是羧基，而在海苔中，此類研究鮮有報道，推測海苔在高濃度鋁的刺激下分泌某種有機酸進入細胞壁中與鋁緊密結(jié)合。由于茶葉和海苔細胞壁中鋁的特殊結(jié)合狀態(tài)，人體在攝食后，無法分解其細胞壁，細胞器中的鋁也難以被胃液溶出，因此可能產(chǎn)生毒性的鋁含量較低。即使攝入含有可溶性鋁的茶湯，人體血漿中鋁的濃度也沒有增加[24]，而動物試驗[25]結(jié)果表明，喂食茶湯和茶葉后，小鼠肝臟及血液中鋁含量均未增加，表明茶葉中鋁的生物利用度極低。這可能歸因于茶葉中的鋁主要存在于細胞壁和細胞器中，不能被胃液溶出，而細胞質(zhì)中的可溶性狀態(tài)的鋁與有機酸或酚類物質(zhì)絡(luò)合，難以被吸收。因此，茶葉和海苔中天然富集的高含量鋁的攝入風險較低。

圖3 海苔細胞TEM圖Figure 3 Cell of seaweed by TEM

圖4 海苔細胞中鋁的分布Figure 4 Distribution of Al in seaweed cell

圖5 人工模擬胃液提取茶葉各組分中的鋁Figure 5 Extraction of Al from tea by simulated gastric juice

圖6 人工模擬胃液提取海苔各組分中的鋁Figure 6 Extraction of Al from seaweed by simulated gastric juice

3 結(jié)論

透射電子顯微鏡—能譜法直觀地揭示出茶葉和海苔細胞中鋁的亞細胞分布特征，并且茶葉與海苔具有高度相似性，鋁在茶葉和海苔中均主要分布在細胞壁中。差速離心法從亞細胞分布及細胞壁化學組成的角度定量地得出茶葉和海苔中鋁的分布數(shù)據(jù)，茶葉和海苔中的鋁主要分布在細胞壁中，其中茶葉細胞壁中的鋁占茶葉鋁總含量的78.8%，海苔細胞壁中的鋁占海苔鋁總含量的91.7%；茶葉細胞壁中鋁又主要分布在果膠和半纖維素中，占比分別為53.4%和45.0%，海苔細胞壁中鋁主要分布在半纖維素和纖維素中，占比分別為29.0%和68.2%?；诓枞~和海苔中鋁的分布特征，采用人工模擬胃液提取法探討直接攝入茶葉和海苔的風險性，結(jié)果表明，茶葉中的鋁難以被溶出和吸收，因此風險性較小；而海苔中的鋁由于缺乏相應(yīng)毒理學研究，僅從海苔細胞中鋁的分布特征及人工模擬胃液溶出性來看，其較茶葉細胞中的鋁風險性更低。要確切地解析海苔中鋁的生物毒性問題，尚需要基于鋁亞細胞分布的深入的毒理學研究。