黃治國 彭思婕 李 浩 鐘姝霞 鄧 杰 任志強(qiáng) 衛(wèi)春會(huì)

(1. 四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2. 四川水井坊股份有限公司，四川 成都 610036；3. 自貢檢驗(yàn)檢測院，四川 自貢 643000)

濃香型白酒又稱瀘香型白酒，是中國四大典型香型白酒之一，以瀘州老窖特區(qū)酒為典型代表，屬于大曲酒，其主要的香型物質(zhì)為己酸乙酯，酒體無色透明、窖香濃郁、綿軟甘冽、香味協(xié)調(diào)、尾凈爽口[1]。其中最能體現(xiàn)濃香型大曲酒釀造工藝獨(dú)特之處是“泥窖固態(tài)發(fā)酵、續(xù)糟配料、混蒸混燒”[2-3]。

傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過程中，微生物對(duì)白酒的質(zhì)量、品質(zhì)、風(fēng)味等有重要作用[4]，多數(shù)微量物質(zhì)都是微生物的代謝產(chǎn)物[5]。大曲作為糖化發(fā)酵劑，是多種微生物群的混合體系[6]，微生物的生長繁殖形成了種類繁多的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而賦予大曲酒獨(dú)特的風(fēng)格和特色[7]。曲中的微生物主要是從環(huán)境中富集而來，各種微生物互相作用進(jìn)而影響發(fā)酵過程[8]。游玲等[9]研究表明窖泥、空氣、糟醅之間的微生物存在相互轉(zhuǎn)移，釀造過程中的霉菌、細(xì)菌、酵母菌大部分來自空氣，釀造環(huán)境空氣中的微生物是否在釀造特性方面有發(fā)展取決于環(huán)境條件。

目前，有關(guān)白酒微生物的研究主要是以酒醅或酒曲為出發(fā)點(diǎn)[10]，從微生物的角度探究白酒的發(fā)酵機(jī)理，并提出白酒微生物與風(fēng)味之間的聯(lián)系是今后研究的重點(diǎn)[11]，尤其是不同香型白酒具有不同的風(fēng)味特征，其中微生物的作用十分重要[12]。目前有關(guān)釀造過程中的細(xì)菌和霉菌的群落結(jié)構(gòu)變化、群落結(jié)構(gòu)與風(fēng)味組分以及微生物群落與氨基酸含量的相關(guān)關(guān)系研究較多[13-17]，但未進(jìn)行大量的菌落篩選，且空氣中酵母菌的產(chǎn)酒產(chǎn)香作用尚未見報(bào)道。文章擬以濃香型白酒釀造車間空氣微生物為研究對(duì)象，利用YPD培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基，對(duì)濃香型白酒釀造車間空氣微生物進(jìn)行分離鑒定，并從中篩選出酵母菌；對(duì)酵母菌進(jìn)行耐受特性分析，并采用GC-MS分析其代謝產(chǎn)物。旨在為白酒釀造機(jī)理以及引進(jìn)新型養(yǎng)生酒的同時(shí)提高白酒質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空氣微生物樣品：將取樣機(jī)置于釀造車間，對(duì)釀造車間空氣進(jìn)行多點(diǎn)取樣并混合均勻作為試驗(yàn)分析樣品，密封后于4 ℃保藏，川北某濃香型白酒廠；

瓊脂、葡萄糖、95%乙醇、濃鹽酸等：分析純，成都科龍化工試劑公司；

酵母浸膏、蛋白胨等：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975B型，美國安捷倫科技公司；

紫外可見分光光度計(jì)：A360型，上海翱藝儀器有限公司；

雙色熒光定量PCR儀：CFX96 型，美國BIO-RAD公司；

化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：ChemiDoc XRS型，美國BIO-RAD公司；

正置生物顯微鏡：DM3000型，德國Leica公司；

菌落計(jì)數(shù)分析儀：ProtoCOL3型，廣州市華粵行儀器有限公司；

電泳儀：Mini-subce11型，美國BIO-RAD公司；

高性能臺(tái)式離心機(jī)：X1R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

離心機(jī)：5418型，艾本德(中國)有限公司；

均質(zhì)器：Precellys24型，奧然科技有限公司；

恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZWYR-D2403型，上海智城分析儀器制造有限公司；

微生物培養(yǎng)箱：LS-I201型，上海桑戈生物科技有限公司；

大型臺(tái)式恒溫冷凍搖床：MaxQ4000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2D型，上海實(shí)業(yè)蘇凈有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

(1) YPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌15 min。

(2) 馬鈴薯液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

(3) 高粱汁培養(yǎng)基[18]：高粱粉250 g，耐高溫α-淀粉酶(10 U/g原料)45 mg，糖化酶(250 U/g原料)20 mg，酸性蛋白酶(30 U/g原料)30 mg，蒸餾水1 000 mL，糖度20 °Bx，115 ℃滅菌15 min。

1.3.2 空氣中微生物的分離純化及形態(tài)觀察 無菌條件下，取1 mL空氣樣品，加入9 mL無菌水，充分搖勻，振蕩5～10 min，梯度稀釋，選取10-3、10-5、10-7稀釋液各1 mL，均勻涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌種的生長狀況，選取適當(dāng)?shù)钠矫?，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于另一平皿。按此法重復(fù)轉(zhuǎn)接2～3次進(jìn)行分離純化，根據(jù)菌落特征及鏡檢確認(rèn)后，挑取單菌落移入斜面，培養(yǎng)后備用。對(duì)分離純化培養(yǎng)篩選出的菌株進(jìn)行鏡檢，確定菌落形態(tài)。

1.3.3 酵母菌DNA的提取 取1 mL菌懸液進(jìn)行活化，采用酶破碎法結(jié)合玻璃珠破碎法提取DNA。采用正向ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和反向引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共29個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.3.4 酵母菌的生長曲線及對(duì)乙醇、溫度、酸的耐受性

(1) 生長曲線：采用紫外可見分光光度計(jì)測定酵母菌數(shù)量，并繪制曲線圖。

(2) 乙醇耐受性：分別添加0%，3%，5%，7%，9%，11%乙醇至酵母菌液中，測定其吸光值。

(3) 溫度耐受性：取1 mL酵母菌懸液接種至馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，以3 ℃為增長梯度，從20～41 ℃，共9個(gè)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，測定其吸光值。

(4) 酸耐受性：各取1 mL菌懸液接種至馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH以0.5為梯度，從pH 2.0～6.0，每組9個(gè)培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，測定其吸光值。

1.3.5 酵母菌代謝產(chǎn)物分析 采用高粱汁培養(yǎng)基，分別接種酵母菌，28 ℃發(fā)酵3 d。采用GC-MS進(jìn)行鑒定，利用NIST數(shù)據(jù)庫，分析發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS軟件和Excel、Origin軟件等對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 空氣中酵母菌的分離純化

從川北某濃香型白酒廠釀造車間的空氣微生物樣品中分離純化得到4株酵母菌，分別編號(hào)為nz2、nz3、nz4、nz8，其菌落形態(tài)特征見表1。

表1 各菌株的菌落形態(tài)特征

2.2 基于5.8S rDNA-I TS區(qū)的分子鑒定結(jié)果

對(duì)分離純化后的4株酵母菌DNA進(jìn)行提取，使用引物ITS1和ITS4對(duì)其5.8S rDNA-ITS區(qū)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖1可知，4株酵母菌的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物長度為500～750 bp。利用NCBI對(duì)菌株序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并構(gòu)造發(fā)育樹如圖2所示。

由圖2可知，nz2和nz3同屬于膠紅酵母(R.mucilaginosa)，nz4和nz8同屬于季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)。趙春海等[19]研究發(fā)現(xiàn)膠紅酵母和季也蒙畢赤酵母均屬產(chǎn)油脂酵母類，可在一定條件下水解碳源、氮源產(chǎn)生脂肪酸。膠紅酵母包含獨(dú)特酶系，能很好分解酒中不良物質(zhì)[20]，季也蒙畢赤酵母可將豐富原料發(fā)酵轉(zhuǎn)換成油脂和其他微量物質(zhì)[21]，這兩株酵母均可適應(yīng)環(huán)境并代謝產(chǎn)生有益物質(zhì)，在釀造白酒的環(huán)境下，能夠產(chǎn)香、產(chǎn)醇，在篩選菌株時(shí)這兩株菌在培養(yǎng)基上生長繁殖會(huì)產(chǎn)生酒的香氣。葉偉慶[22]發(fā)現(xiàn)膠紅酵母菌可產(chǎn)生類胡蘿卜素、粗多糖、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、維生素B1、維生素B2、維生素B6等物質(zhì)，其中類胡蘿卜素和維生素都是對(duì)人體有益的微量元素[23-24]。故可將膠紅酵母引入到白酒中使之發(fā)展成為新型養(yǎng)生酒。因此，選用其中的nz3和nz4兩株酵母進(jìn)行生長曲線、耐受特性以及代謝產(chǎn)物分析。

M. DL2000 DNA marker 1. nz2的PCR產(chǎn)物 2. nz3的PCR產(chǎn)物 3. nz4的PCR產(chǎn)物 4. nz8的PCR產(chǎn)物圖1 酵母菌株的5.8S rDNA-ITS區(qū)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 DNA amplification resuLts of the strains

圖2 比對(duì)結(jié)果發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree analysis of the results compared

2.3 酵母菌生長曲線

由圖3可知，菌株nz3和nz4的生長趨勢大體一致，均先升高后降低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為10～12 h時(shí)，兩株菌的OD值增長幅度相近，但變化不大，此期間為生長曲線中的延滯期；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為12～22 h時(shí)，兩株菌的OD值增長速率較大，接近于倍數(shù)增長，nz4的OD值較nz3更大，此期間為生長曲線中的對(duì)數(shù)期；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為22～33 h時(shí)，兩株菌的OD值的變化趨于平穩(wěn)，先逐漸增大至最大值后降低，nz3的增長速率由小變大再降低，OD值在29 h處達(dá)最大，nz4的增長速率保持平穩(wěn)再降低，OD值在30 h處達(dá)最大值且大于nz3的，此期間為生長曲線中的平穩(wěn)期；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為33～34 h時(shí)，兩株菌的OD值均下降，且下降幅度較大，此期間為生長曲線的衰亡期。綜上，兩種酵母菌在29～30 h范圍內(nèi)生長更好。

2.4 酵母菌的耐受性

2.4.1 耐乙醇性 由圖4可知，兩種酵母菌在不同乙醇濃度下變化趨勢基本一致，OD值逐漸減小并趨近于0。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%～5%時(shí)，兩種酵母菌的OD值下降幅度較大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，nz3、nz4的OD分別為0.1，0.5左右；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%～11%時(shí)，nz3的OD值變化幅度較小，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為11%時(shí)變?yōu)?，nz4的OD值在乙醇體積分?jǐn)?shù)5%～7%時(shí)下降幅度較大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為7%～11%時(shí)，nz4的OD值持續(xù)減小并接近于0。同樣的生長條件下，nz4的OD值比nz3的更大，說明nz4的乙醇耐受性比nz3的更好。

圖3 兩株酵母菌的生長曲線Figure 3 The growth curve of two yeast strains

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 兩株酵母菌的乙醇耐受性Figure 4 Study on ethanol tolerance of two yeast strains

2.4.2 耐溫性 由圖5可知，兩種酵母菌的OD值變化趨勢一致，均先升高后降低。當(dāng)溫度為20～29 ℃時(shí)，兩種酵母菌的OD值持續(xù)上升，在29 ℃時(shí)達(dá)最大值，且nz4的增長幅度更大；當(dāng)溫度為29～44 ℃時(shí)，兩種酵母菌的OD值持續(xù)下降，nz3的下降幅度較大，在44 ℃時(shí)接近0，nz4在29～38 ℃時(shí)下降幅度較小，在38 ℃后急劇下降，44 ℃時(shí)接近0。同樣的生長環(huán)境下，nz4的OD值高于nz3，因此nz4的耐溫性更好。

2.4.3 耐酸性 由圖6可知，兩種酵母菌的OD值變化趨勢一致，均先平穩(wěn)后上升再下降。當(dāng)pH為2.0～3.5時(shí)，nz3的OD值是pH 3.0開始大幅度上升，在pH 3.5時(shí)達(dá)1.4左右，nz4的OD值從pH 2.0開始急劇增長，在pH 3.5 時(shí)達(dá)1.8左右；當(dāng)pH為3.5～5.5時(shí)，nz3的OD值仍在增長，從1.4增長至1.6左右，而nz4的增長幅度較小，變化趨于平緩，在pH 5.5時(shí)達(dá)最大值1.9；當(dāng)pH從5.5增加至6.0時(shí)，兩種酵母菌的OD值均下降至1.6左右。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 兩株酵母菌的溫度耐受性Figure 5 Study on temperature tolerance of two yeast strains

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 兩株酵母菌的酸度耐受性Figure 6 Study on the acidity tolerance of two yeast strains

同樣的生長環(huán)境下，nz4的OD值高于nz3，說明nz4在酸性條件下比nz3更適合生存。

綜上，空氣中的酵母菌在釀造特性方面表現(xiàn)優(yōu)良，與酒醅或大曲中的酵母菌性能[25]相近，表明空氣中的酵母菌也能在釀造環(huán)境下很好地生長并代謝出有益物質(zhì)，可進(jìn)一步將空氣中微生物進(jìn)行培養(yǎng)優(yōu)化，使酒質(zhì)更優(yōu)、風(fēng)味更佳。

2.5 酵母菌代謝產(chǎn)物

由表2可知，兩種酵母菌的優(yōu)勢產(chǎn)物均為乙醇和己酸乙酯，并含有少量的酸、高級(jí)醇、酯類、酚類等芳香類物質(zhì)，可構(gòu)成白酒香味成分[26]，其中己酸乙酯是濃香型白酒的香味主體成分。nz3的代謝產(chǎn)物中乙醇和己酸乙酯含量較高，還產(chǎn)生了苯乙醇和2，3-丁二醇，這兩種物質(zhì)是發(fā)酵產(chǎn)生的中間物，可以構(gòu)成一些香味物質(zhì)，能對(duì)酒體產(chǎn)生正面影響；nz4的代謝產(chǎn)物中乙醇、丁醇、苯乙醇、己酸乙酯、辛酸乙酯含量高于nz3，其發(fā)酵效果優(yōu)于nz3。綜上，nz4的產(chǎn)酒能力和產(chǎn)香能力都較好，可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵試驗(yàn)，并且通過觀察其產(chǎn)物的含量變化，利用生理生化試驗(yàn)優(yōu)化其產(chǎn)醇和產(chǎn)香的能力。此外，生香酵母用于濃香型白酒、醬香型白酒生產(chǎn)中對(duì)白酒產(chǎn)量的提高具有明顯效果[27-28]。因此，可以從生香方向研究篩選出的膠紅酵母和季也蒙畢赤酵母，對(duì)酵母菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，進(jìn)一步探究其產(chǎn)酒、產(chǎn)香作用，使之可應(yīng)用于白酒生產(chǎn)，賦予白酒風(fēng)味物質(zhì)，提高白酒質(zhì)量。

表2 兩株酵母的發(fā)酵產(chǎn)物?

3 結(jié)論

以濃香型白酒釀造車間空氣微生物為研究對(duì)象，利用YPD培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行分離鑒定，并采用GC-MS分析技術(shù)，對(duì)空氣微生物中的酵母菌進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析。結(jié)果表明：① 空氣微生物中大部分可培養(yǎng)的微生物包含細(xì)菌、霉菌和酵母菌，并篩選鑒定出了兩種酵母菌，分別是膠紅酵母(R.mucilaginosa)和季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)。② 兩種酵母菌最適生長時(shí)間為29～30 h，季也蒙畢赤酵母對(duì)乙醇、溫度、酸的耐受性優(yōu)于膠紅酵母。③ 兩種酵母菌均可應(yīng)用于釀造生產(chǎn)并提高酒質(zhì)和風(fēng)味，其優(yōu)勢產(chǎn)物有乙醇、己酸乙酯，還有少量高級(jí)醇、酯類、酚類等芳香成分。試驗(yàn)對(duì)酵母菌進(jìn)行了分離，但是參與白酒釀造的微生物還有霉菌、放線菌等多種微生物[29]。因此，對(duì)空氣中微生物種類的篩選可多樣化，還可將試驗(yàn)所得酵母菌與空氣中的霉菌、放線菌等結(jié)合，探究不同種類菌種的復(fù)合發(fā)酵效果。