□ 王海云

（馬鞍山師范高等?？茖W(xué)校，安徽 馬鞍山 243000）

目前植物活性成分的研究和天然產(chǎn)品的開發(fā)利用一直是食品行業(yè)研究的熱點。而紫蘇屬于唇形科紫蘇屬草本植物[1]，易于種植，在我國有著悠久的種植歷史，是國家衛(wèi)生部首批的60種藥食同源的植物之一[2]，其含有豐富的酚類，被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)抗氧化物質(zhì)。目前對紫蘇的研究主要集中于其揮發(fā)油組成和含量測定，以及測定迷迭香酸和黃酮含量測定，提取方法的優(yōu)化也是基于提高迷迭香酸和黃酮含量，針對不同熱加工條件對紫蘇葉抗氧化活性及總酚含量影響的研究相對較少?？紤]到紫蘇葉中含有許總酚類物質(zhì)，在熱加工條件下容易分解或揮發(fā)損失，而超聲波能夠在較低溫度下加快提取，保證物質(zhì)的穩(wěn)定。本試驗抗氧化活性的測定采用超聲波提取法，以總酚、自由基清除率作為衡量指標(biāo)，以研究不同的熱加工條件對紫蘇提取物抗氧化活性及總酚含量的影響。在此基礎(chǔ)上，本試驗還比較了不同紫蘇樣品在相同提取方法下的總酚提取率，為紫蘇熱加工方式和加工條件的選擇提供理論基礎(chǔ)，對研究利用紫蘇總酚類物質(zhì)的營養(yǎng)價值、生理功能及人體健康的影響有一定指導(dǎo)意義。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

新鮮的紫蘇葉、干紫蘇籽購于黑龍江省。

福林酚，北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸、亞硝酸鈉、無水乙醇，碳酸氫鈉，江陰市化學(xué)試劑有限公司；過硫酸鉀、ABTS，上海市拉丁生化科技股份有限公司，以上均為分析純。

（二）儀器與設(shè)備

SV105VE型超低溫冰箱、粉碎機、Modell680型酶標(biāo)儀、烘箱、Centrifuge5810R型臺式冷凍離心機、分析天平、SB-100DTN型超聲波清洗器、SBH130D/3型干浴器、df-101s恒溫磁力攪拌器、J09601型96孔全白酶標(biāo)板。

（三）方法

1. 酚類物質(zhì)的提取

將新鮮的紫蘇葉、干紫蘇籽烘干磨碎，兩種樣本分別稱取兩克，按照料液比1:20加入40mL70%乙醇，50℃超聲波輔助提取30min，在4500rpm離心15min，取上清液后，同樣方法再次提取殘渣兩次，合并提取液，加入提取溶劑至40ml，用于總酚及抗氧化能力的測定。

2. 總酚的測定

總酚的測定采用福林酚法，在此基礎(chǔ)上略加修改，具體方法如下：

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱量5 m g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用7 0%乙醇溶解，定容到50mL容量瓶，配制濃度為0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃低溫避光保存。移取標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液1ml，加入0.5 ml福林酚試劑、2ml10%碳酸鈉溶液，定容至10ml，室溫條件暗處放置2h。在500-800nm進行波長掃描，確定最佳檢測波長。取0.1mg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置0.02 mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml0的沒食子酸溶液。取不同濃度沒食子酸溶液1ml，按上述方法在最佳吸收波長處測定吸光值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。

（二）樣品總酚的測定

按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，移取200μL反應(yīng)液打入96孔全白酶標(biāo)板，將載有反應(yīng)液的96孔全白酶標(biāo)板放入多功能微孔板讀數(shù)儀在660nm處測吸光度值。使用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中相應(yīng)的總酚含量，進行三次平行試驗。按照下面公式進行換算（總酚含量以沒食子酸當(dāng)量示）：W =（C×V×N）/M

3. ABTS自由基清除能力的測定

利用ABTS+清除能力指標(biāo)來評價樣品的總抗氧化能力，采用參考文獻（Pellegrini et ah 1999[3]）的方法，并進行相應(yīng)調(diào)整。

（一）配制ABTS+ 儲備液

同體積的7mM的ABTS+與4.9mM的過硫酸鉀混合，將混合液放置在黑暗的室溫條件下反應(yīng)16h。測定前，將上述混合液用無水乙醇稀釋直至用比色皿在波長734nm處測得其吸光度為0.7左右。

（二）樣品ABTS+ 自由基清除能力測定

先將樣品用超純水稀釋至適當(dāng)濃度，在0.1mL樣品稀釋液中加入ABTS+工作液3.9mL，以去超純水為參比溶液，吸取200μL反應(yīng)液吹入96孔全白酶標(biāo)板，將載有反應(yīng)液的96孔全白酶標(biāo)板放入多功能微孔板讀數(shù)儀在734 nm處測吸光度值。每個樣品進行三次平行試驗。按照下面公式計算樣品對ABTS+自由基的清除率。

S =1- (A1/A2)×100%

公式中 A1—測定的某濃度的樣品吸光度值

A2—用相同體積的無水乙醇代替上述樣品測定吸光度值

4. 紫蘇樣品熱處理

將提取后的紫蘇樣品注入玻璃試管中，加蓋子在干浴器進行熱處理。熱處理的溫度分別為：60℃、80℃、100℃、120℃、140℃。熱處理的時間分別為：5min、10min、15min、20min。

（四）統(tǒng)計分析

采用鄧肯式多重比較方法，用prism8軟件作圖。

二、結(jié)果與分析

（一）不同提取次數(shù)對紫蘇葉和紫蘇籽總酚含量的影響

圖2-1可以得出，相同提取方法紫蘇葉和紫蘇籽中總酚含量差異顯著。三次提取中，紫蘇葉與紫蘇籽總酚含量均呈現(xiàn)下降的趨勢，紫蘇葉總酚含量始終高于紫蘇籽。

（二）不同提取次數(shù)對紫蘇葉和紫蘇籽總酚提取率的影響

圖2-2可以看出在三次提取中，紫蘇葉的提取率依次下降，第一次紫蘇葉提取率為44.65%達(dá)到最高，第二次紫蘇葉提取率是第一次提取的0.7倍；第三次紫蘇葉提取率最低為18.09%。紫蘇葉的第三次總酚提取率相比第二次的提取率顯著降低。在三次提取中，紫蘇籽的提取率也依次下降，第一次紫蘇籽提取率為19.92%達(dá)到最高，第二次紫蘇籽提取率是第一次提取的0.7倍；第三次紫蘇籽提取率最低為4.98%。紫蘇籽的第三次總酚提取率相比前兩次的提取率都有顯著降低。在三次提取中，紫蘇葉的總酚提取率均高于紫蘇籽。有研究表明[4]，紫蘇葉的最佳提取條件為70%的乙醇溶液，超聲時間為30.52min，溫度為50℃。在最佳條件下，紫蘇籽的平均提取率約為45.49%，與本實驗紫蘇葉第一次提取的提取率偏差0.84%，而紫蘇籽的最佳提取條件為70%的乙醇溶液，超聲時間為35.66min，溫度為58.82℃，在最佳條件下，紫蘇籽的平均提取率約為23.67%，與本實驗紫蘇籽第一次提取的提取率偏差2.75%，本實驗提取條件與紫蘇葉的最佳提取條件更加吻合，因此在三次提取中紫蘇葉的總酚提取率均高于紫蘇籽。

（三）不同熱加工條件對紫蘇總酚含量的影響

從圖2-3中可以看出，在整個加熱過程中，紫蘇提取物的總酚含量隨加熱時間的延長、溫度的升高呈下降趨勢。未經(jīng)加工的紫蘇提取物中總酚含量為2.2325mg/g。在加熱相同時間的條件下，隨著加熱溫度的升高（60℃、80℃、100℃、120℃），紫蘇提取物總酚含量連續(xù)降低。加熱溫度為60℃時，隨著加熱時間從0min到20min，總酚含量始終呈下降趨勢。其中15-20min下降最為明顯，下降了0.269mg/g。紫蘇葉樣品在60℃加熱時，隨著時間延長總酚含量和自由基清除率下降，其中5min最高，20min最低，與未加熱對比，幾乎不存在顯著差異。加熱溫度為80℃時，隨著加熱時間從0min到20min，總酚含量也連續(xù)下降。其中15-20min下降最為明顯，下降了0.2224mg/g，與未加熱對比，和5min間存在顯著差異。加熱溫度為100℃時，隨著加熱時間從0min到20min延長，總酚含量連續(xù)下降。其中15-20min下降較不明顯為0.0405mg/g，與未加熱對比，和5min、10min間存在顯著差異。加熱溫度為120℃時，隨著加熱時間從0min到20min延長，總酚含量連續(xù)下降，但變化趨勢相比60、80、100℃較不明顯與未加熱對比，和5min、10min間存在顯著差異。在0-5min內(nèi)隨著加熱溫度的升高，總酚含量降低的最為明顯，分別降低了0.0736、0.3406、0.4844、0.6463mg/g。加熱20min時，隨著加熱溫度的升高，總酚物質(zhì)含量有少量的降低。本研究表明，熱處理對紫蘇總酚的影響是隨著加熱溫度升高、加熱時間延長，紫蘇總酚含量呈下降趨勢。另一可能的原因是由于酶促褐變反應(yīng)造成了酚類物質(zhì)含量的下降。還有一種原因可能是紫蘇中的酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)形式存在，研究表明游離態(tài)酚類物質(zhì)隨著加熱時間的延長、加熱溫度的升高呈下降的趨勢顯著，而結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)其含量的變化規(guī)律不明顯，因此總體呈下降趨勢。在熱加工過程中，應(yīng)盡可能避免因蒸煮、油炸等需要耗費長時間處理導(dǎo)致的加熱處理過長而造成酚類物質(zhì)損失。

（四）不同熱加工條件對紫蘇總酚抗氧化性的影響

從圖2-4中可以看出，在整個加熱過程中，紫蘇提取物的ABTS自由基清除能力隨加熱溫度的升高呈下降趨勢。未經(jīng)加工處理的紫蘇提取物的ABTS自由基清除率最高，其值為65.02%。在加熱相同時間的條件下，隨著加熱溫度的升高（60℃、80℃、100℃、120℃、140℃），紫蘇提取物ABTS自由基清除率連續(xù)降低。樣品在140℃加熱20min時的ABTS+清除能力最低為39.04%，其值約為原始提取物的0.6。在同一加熱溫度下，加熱時間為0min-20min時，自由基清除能力變化極顯著。在加熱5min時，60℃自由基清除率存在顯著差異，加熱10min、15min、20min是同樣趨勢。

本研究結(jié)果表明紫蘇經(jīng)過熱加工后，ABTS自由基清除能力有明顯下降的趨勢。ABTS自由基清除率變化趨勢與總酚含量的變化趨勢相似，因此熱加工過程中影響抗氧化活性改變的因素可能是酚類物質(zhì)的含量的下降，使抗氧化能力降低。推測降低的原因：①酚類物質(zhì)在熱加工過程當(dāng)中發(fā)生熱分解、氧化或著聚合反應(yīng)；②樣品中大分子總酚解離；③樣品中酚類物質(zhì)在溶劑中發(fā)生自溶；④酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)等大分子產(chǎn)生交聯(lián)結(jié)構(gòu)[5]。

三、結(jié)論

本實驗對紫蘇葉、紫蘇籽的提取率進行了比較，并對不同熱加工條件下的紫蘇葉粗提物的總酚含量及抗氧化能力變化進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同條件下紫蘇葉的總酚提取率均高于紫蘇籽，且隨著時間的延長、溫度的升高，紫蘇中的酚類物質(zhì)含量逐漸降低，抗氧化能力有一定程度降低。