董笑克 劉金民 李中浩 袁斯遠(yuǎn) 王凱悅 黎莉莉 鄭香春

中國有900萬以上癲癇患者，約30%因抗癇藥物難以控制發(fā)作而成為耐藥性癲癇。單一靶點的藥物很容易產(chǎn)生耐藥，對耐藥性癲癇的治療難以發(fā)揮應(yīng)有的療效。柴貝止癇湯是劉金民教授在《醫(yī)學(xué)心悟》定癇丸及《傷寒論》柴胡加龍骨牡蠣湯的基礎(chǔ)上，結(jié)合王永炎院士及個人多年臨證經(jīng)驗所創(chuàng)制，由柴胡、天麻、浙貝母、法半夏、石菖蒲、牡蠣和地龍7味藥組成，具有疏肝理氣、化痰息風(fēng)、醒神開竅的功效。團(tuán)隊通過大量臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)柴貝止癇湯具有良好的抗癇療效及安全性，具有較高的臨床價值及研究意義[1-8]。為了進(jìn)一步挖掘其抗癇作用物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究通過借助超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)-串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)技術(shù)以及氣相色譜(gas chromatography，GC)- MS/MS技術(shù)，分析柴貝止癇湯主要吸收入血成分，并借助DAS軟件計算其藥代動力學(xué)參數(shù)，為中藥治療耐藥性癲癇有效成分的挖掘開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

柴貝止癇湯由柴胡12 g、天麻15 g、浙貝母9 g、法半夏9 g、石菖蒲9 g、煅牡蠣30 g、地龍6 g組成，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥劑科，每劑中藥統(tǒng)一煎至100 mL。

貝母素甲(110750)、貝母素乙(110751)、貝母辛(111892)、柴胡皂苷A(110777)、柴胡皂苷D(110778)、天麻素(110807)、香草醛(100093)、原兒茶醛(110810)、胡蘆巴堿(110883)、α-細(xì)辛醚(100298)、β-細(xì)辛醚(112018)、普萘洛爾(100783)標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院，柴胡皂苷C(B20149)、對羥基苯甲醛(B20327)、天麻苷元(對羥基苯甲醇，111970)、檸檬醛(B25317)、茴香腦(B20579)、細(xì)辛醛(B21345)、甲苯磺丁脲(B26427)標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器

DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀；Thermo Q EXACTIVE質(zhì)譜儀；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)，液相部分：島津GC-2010 Plus，進(jìn)樣器：AOC-5000 Plus，質(zhì)譜部分：MS/MS；色譜柱：RTX-5MS(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；控制軟件與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為島津公司高效化學(xué)工作站(GC-MS/MS Real Time Analysis)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠6只，體重(200±10)g，由北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供，合格證號：SYXK(京)2011-0024。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物實驗中心，飼養(yǎng)級別為SPF級，3只/籠，保證正常光照節(jié)律、溫濕適度、環(huán)境安靜，正常大鼠生長繁殖飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.4 柴貝止癇湯有效成分收集

柴貝止癇湯由柴胡、天麻、浙貝母、法半夏、石菖蒲、牡蠣和地龍7味藥組成，通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)和篩選藥物中含量較大、研究較多、對癲癇治療可能存在主要作用的化學(xué)成分，鎖定目標(biāo)成分17種，分別為：貝母素甲(verticine，來源：浙貝母)、貝母素乙(verticinone，來源：浙貝母)、貝母辛(貝母辛堿，peimisine，來源：浙貝母)、柴胡皂苷A(saikosaponin A，來源：柴胡)、柴胡皂苷D(saikosaponin D，來源：柴胡)、柴胡皂苷C(saikosaponin C，來源：柴胡)、對羥基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde，來源：天麻)、天麻苷元(對羥基苯甲醇，p-hydroxybenzoic alcohol，來源：天麻)、天麻素(gastrodin，來源：天麻)、香草醛(vanillin，來源：天麻)、原兒茶醛(protocatechualdehyde，來源：天麻)、胡蘆巴堿(trigonelline，來源：天麻)、檸檬醛(citral，來源：半夏)、茴香腦(anethole，來源：半夏)、α-細(xì)辛醚(α-細(xì)辛腦，α-asarone，來源：石菖蒲)、β-細(xì)辛醚(β-細(xì)辛腦，β-asarone，來源：石菖蒲)、細(xì)辛醛(asarylaldehyd，來源：石菖蒲)。

1.5 干預(yù)方式及樣品采集

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食10小時，自由飲水，取大鼠眶靜脈取血約0.2 mL，記為0分鐘。給予大鼠柴貝止癇湯9 mL/kg(折合生藥藥量8.125 g/kg)灌胃，分別于灌胃后15min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4h眼眶取血0.2 mL于抗凝管中，4℃離心機(jī)3000 rpm離心10 min分離血漿，-80℃保存以進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.6 血漿樣品處理

1.6.1 UPLC-MS/MS檢測樣品前處理 將血漿加入3倍沉淀劑沉淀蛋白，10000 rpm離心10 min后，取100 μL上清液進(jìn)樣5μL于液質(zhì)，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.6.2 GC-MS/MS檢測樣品前處理 取待測血漿樣品50 μL，加入含內(nèi)標(biāo)的乙酸乙酯：三氯甲烷(8∶2)萃取劑150 μL，渦旋混勻60秒，13000 rpm離心10 min，吸取上清液100 μL，吸取1 μL進(jìn)行GC-MS測定。

1.7 UPLC-MS/ MS分析條件

1.7.1 UPLC條件 Thermo Syncronis C18，1.9 μm，2.1×100 mm色譜柱，液相條件：(1)A：水(含0.1%甲酸及2 mmoL/L甲酸銨)，D：乙腈；梯度洗脫，分析時間0～8min，進(jìn)樣量5 μL，流速0.25 mL/min。梯度條件見表1。

表1 UPLC檢測梯度條件

1.7.2 MS/MS分析條件 電噴霧電離源ESI(+)；監(jiān)測模式：二級數(shù)據(jù)依賴性掃描(Targeted-SIM)；噴霧電壓：2800V；蒸發(fā)溫度：350oC；鞘氣：35Arb；輔助氣：10Arb；毛細(xì)管溫度：320oC；S-lens RF：50。

化合物參數(shù)：(1)原兒茶醛(-)：137.02442，貝母素甲(+)：432.34722，貝母辛(+)：428.31592，香草醛：151.04007，貝母素乙(+)：430.33157，對羥基苯甲醛(-)：121.02950；(2)柴胡皂苷A(-)：779.45871，天麻素(-)：321.07355，柴胡皂苷C(-)：925.51662，天麻苷元(-)：123.04515，柴胡皂苷D(-)：779.45871，普萘洛爾(IS+)：260.16451，甲苯磺丁脲(IS-)：269.09654。標(biāo)曲濃度范圍：0.001～500 ng/mL。

1.8 GC-MS/MS條件

載氣為He氣，恒流模式，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，氣化室溫度250℃，柱溫為程序升溫，起始溫度為80℃，維持1 min，30℃/min升至250℃，維持1 min，30℃/min升至300℃，維持1 min，總測定時間10.33 min。MSD檢測為MS/MS模式。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

血漿濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.0軟件進(jìn)行計算參數(shù)：AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、MRT(0-∞)、t1/2、Tmax、Cmax。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及曲線線性范圍 通過UPLC-MS/MS檢測標(biāo)準(zhǔn)品：貝母素甲、貝母素乙、貝母辛、柴胡皂苷A和D、柴胡皂苷C、對羥基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。見圖1。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲濃度范圍：0.001～500 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程R2>0.998，提示在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可滿足藥物濃度定量分析的要求。

注：A：貝母素甲；B：貝母素乙；C：貝母辛；D：柴胡皂苷A和D；E：柴胡皂苷C；F：對羥基苯甲醛；G：天麻苷元；H：天麻素；I：香草醛；J：原兒茶醛；K：甲苯磺丁脲內(nèi)標(biāo)；L：普萘洛爾內(nèi)標(biāo)

注：A：胡蘆巴堿；B：檸檬醛；C：茴香腦；D：α-細(xì)辛醚；E：β-細(xì)辛醚；F：細(xì)辛醛

GC-MS/MS檢測標(biāo)準(zhǔn)品胡蘆巴堿、檸檬醛、茴香腦、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、細(xì)辛醛色譜圖，見圖2，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲濃度范圍：0.01～500 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程R2>0.996，提示在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可滿足藥物濃度定量分析的要求。

2.1.2 日內(nèi)、日間精密度及回收率 柴貝止癇湯主要單體成分：貝母素甲、貝母素乙、貝母辛、柴胡皂苷A和D、柴胡皂苷C、對羥基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原兒茶醛、胡蘆巴堿、檸檬醛、茴香腦、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、細(xì)辛醛17個標(biāo)準(zhǔn)品日內(nèi)精密度和日間精密度RSD<5%，回收率在97%～103%，符合定量分析要求。

2.2 柴貝止癇湯不同時間點入血成分濃度定量檢測

17種標(biāo)準(zhǔn)品檢測柴貝止癇湯不同時間點入血成分，檢測出15種化合物，分別是貝母素甲、貝母素乙、貝母辛、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、對羥基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原兒茶醛、胡蘆巴堿、茴香腦、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、細(xì)辛醛。檸檬醛及柴胡皂苷D在各個采血點均未檢測出，通過各個標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程定量計算各化合物不同時間點濃度。見表2。

表2 柴貝止癇湯主要入血成分不同時間點濃度均值結(jié)果(ug/L)

2.3 柴貝止癇湯入血成分平均血漿藥-時曲線

采用DAS2.0軟件繪制柴貝止癇湯入血成分平均血漿藥-時曲線，血漿藥-時曲線呈現(xiàn)為一個單峰曲線，曲線在0.25小時達(dá)到最高峰。見圖3。

圖3 柴貝止癇湯入血成分平均血漿藥-時曲線

2.4 柴貝止癇湯入血吸收成分藥代動力學(xué)參數(shù)

通過DAS2.0軟件，分析柴貝止癇湯15種入血成分不同時間點的藥代動力學(xué)參數(shù)：AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、MRT(0-∞)、t1/2、Tmax、Cmax，結(jié)果見表3。柴貝止癇湯15種入血成分入血含量由高到底排列依次為：天麻素、對羥基苯甲醛、胡蘆巴堿、天麻苷元、原兒茶醛、柴胡皂苷A、香草醛、細(xì)辛醛、貝母素乙、α-細(xì)辛醚、茴香腦、β-細(xì)辛醚、柴胡皂苷C、貝母素甲、貝母辛，含量顯著高于其他成分的天麻素、對羥基苯甲醛、胡蘆巴堿、天麻苷元等均為天麻的有效成分。15種入血成分Tmax多集中在0.25或0.5小時，t1/2分布范圍差異較大，其均值為4.28小時。

表3 柴貝止癇湯15種入血成分的藥代動力學(xué)參數(shù)

3 討論

癲癇屬于中醫(yī)“癇證”的范疇，現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為痰濁內(nèi)阻，臟氣不平，陰陽偏勝，神機(jī)受累，元神失控是癲癇的關(guān)鍵病機(jī)。本團(tuán)隊收集耐藥性癲癇患者的一般情況及中醫(yī)四診信息，應(yīng)用因子分析法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇患者以痰氣郁滯證所占比例最高[9]，認(rèn)為理氣化痰是癲癇主要治則之一[10]，擬定柴貝止癇湯治療耐藥性癲癇證屬痰氣郁滯證患者。團(tuán)隊通過隨機(jī)雙盲臨床對照試驗發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)抗癇西藥的基礎(chǔ)上添加柴貝止癇湯治療，與單純采用抗癇西藥相比，患者癲癇發(fā)作頻次、癲癇積分、癲癇發(fā)作伴隨癥狀積分均較治療前顯著下降[2]。

此外，添加柴貝止癇湯治療耐藥性癲癇，對患者疲勞、發(fā)作恐懼、社會支持、藥物不良反應(yīng)4項具有一定的改善作用[3]，隨著療程的延長，療效逐漸顯著，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[4]。動物實驗同樣證實了柴貝止癇湯具有抗癇作用[5-8]。然而中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多途徑的特點，柴貝止癇湯中有效成分?jǐn)?shù)量龐大，對組方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究有助于篩選到柴貝止癇湯的主要效應(yīng)成分，對組方精簡及抗癲癇新藥的研發(fā)就有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)了柴貝止癇湯的15個吸收入血成分，按照血藥濃度高低依次為天麻素、對羥基苯甲醛、胡蘆巴堿、天麻苷元、原兒茶醛、柴胡皂苷A、香草醛、細(xì)辛醛、貝母素乙、α-細(xì)辛醚、茴香腦、β-細(xì)辛醚、柴胡皂苷C、貝母素甲、貝母辛。其中排名前五位的天麻素、對羥基苯甲醛、天麻苷元、原兒茶醛均為天麻的主要吸收成分，天麻味甘平，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，在柴貝止癇湯中為君藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“味辛溫，主殺鬼精物，蠱毒，惡氣，久服益氣力，長陰肥健，輕身增年”。天麻是治療癲癇最常用的中藥之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明天麻可以使戊四氮誘導(dǎo)的癲癇模型大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長、發(fā)作持續(xù)時間縮短，降低大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]。其他研究同樣證實了天麻的抗癲癇作用及神經(jīng)保護(hù)作用[12]，其主要成分天麻素可以通過激活PI3K/AKT信號通路保護(hù)過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷[13]，干預(yù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放、調(diào)控Nrf2/ERK的表達(dá)，下調(diào)氧化應(yīng)激酶類血紅素加氧酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等的作用、抑制膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)炎癥因子白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等以達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的目的[14]。柴貝止癇湯中的其他入血吸收成分如α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、原兒茶醛等同樣具有一定的抗癇作用[15-16]，并能調(diào)節(jié)突觸可塑性，一定程度改善認(rèn)知功能[17]。胡蘆巴堿、柴胡皂苷等具有抗炎、抗氧化的作用，可抑制核因子κB信號通路發(fā)揮抗炎作用[18]。

本研究借助UPLC-MS/MS及GC-MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了柴貝止癇湯的15個主要吸收入血成分及其藥代動力學(xué)特征，下一步可借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等研究方法，對入血吸收成分的作用靶點及疾病治療靶點做相關(guān)性分析，以進(jìn)一步揭示柴貝止癇湯抗癇作用的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)，并通過實驗研究加以驗證，為耐藥癲癇的治療及新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)。