夏瑤丹 曹芳 楊浩婕 李國(guó)棟 顧瀟楓 劉浩歌 龐慶祿 焦揚(yáng)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明的，病情呈進(jìn)行性加重的間質(zhì)性肺疾病，主要臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性、不可逆的呼吸困難，死亡率高，目前西醫(yī)尚未有理想有效的藥物。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前研究發(fā)現(xiàn)的最主要的致纖維化因子，由哺乳動(dòng)物的巨噬細(xì)胞等合成并釋放。Patricia J.Sime等[1]首次利用腺病毒載體將TGF-β1轉(zhuǎn)入大鼠體內(nèi)，成功復(fù)制出肺纖維化模型。經(jīng)過(guò)多年臨床觀察[2-3]及實(shí)驗(yàn)研究[4-5]，已證實(shí)肺痹湯對(duì)肺纖維化有顯著改善作用。本研究所用銀甘湯由金銀花和生甘草組成，均是肺痹湯的主要組成部分，方中金銀花辛涼解表，清熱解毒，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)有抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用[6]；生甘草清熱解毒，祛痰止咳，調(diào)和諸藥，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)有抗炎、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，以TGF-β1重組腺病毒載體誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型為研究對(duì)象，觀察銀甘湯對(duì)小鼠肺纖維化的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠40只，7～8周齡，體重(22±2)g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0002，所有小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動(dòng)物室，環(huán)境溫度20～25℃，相對(duì)濕度60%～70%，12小時(shí)/12小時(shí)明暗周期照射，自由飲水與進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后使用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 銀甘湯制備：銀甘湯顆粒劑按照金銀花與生甘草3∶1比例制備，每付顆粒40 g，購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。將顆粒劑用100度開(kāi)水沖泡后，調(diào)整濃度為0.6007 g/mL。質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)(北京艾德萊生物科技有限公司)；限制性?xún)?nèi)切酶類(lèi)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；DNA Ligase(北京合生基因科技有限公司)；腺病毒包裝試劑盒(北京合生基因科技有限公司)；EpFectTMTransfection Reagent(北京合生基因科技有限公司)；EvaGreen?qPCR 2×Master Mix(北京合生基因有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)。Trizol(Invitrogen；批號(hào)：10296028)；DEPC水(MDL；批號(hào)：md911875)；超純瓊脂糖(ABI-invitrogen；批號(hào)：16500100)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI-invitrogen；批號(hào)：11752050)；SYBR qPCR mix(ABI-invitrogen；批號(hào)：4472920)；改良Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司；批號(hào)：20180906)；Mouse TGF-β1 ELISA kit(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：I217102)；Mouse BRP-39 ELISA kit(武漢華美生物工程有限公司；批號(hào)：I11034872)；Mouse IL-17 ELISA kit(武漢華美生物工程有限公司；批號(hào)：G19034871)；Mouse IL-13 ELISA kit(武漢華美生物工程有限公司；批號(hào)：I11034870)。

1.2.2 主要儀器 Sorvall Legend Mircro 17臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Sorvall ST 16R 冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；超低溫冷凍冰箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)；RM2135石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；1150H石蠟包埋機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；Asp-300自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；NanoDropTMLite分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Applied Biosystems?StepOneTMReal-Time PCR Systems(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；EPS 300電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；2500凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；HWS-24電熱恒溫水浴槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 TGF-β1重組腺病毒載體構(gòu)建

根據(jù)目的基因序列，分別進(jìn)行全基因合成，并插入腺病毒表達(dá)骨架質(zhì)粒載體中，完成腺病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。將3～5×106個(gè)AD293細(xì)胞傳代接種至100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16～24小時(shí)，腺病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染、收集、濃縮。最后利用構(gòu)建完成的基因過(guò)表達(dá)腺病毒質(zhì)粒、AD293細(xì)胞以及腺病毒包裝試劑盒，進(jìn)行腺病毒包裝。

1.4 動(dòng)物分組與造模

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表將40只小鼠隨機(jī)分為4組，即空白組、空載體組、模型組、銀甘湯組，每組10只。銀甘湯組予銀甘湯6.007 g/(kg·d)灌胃；空白組、空載體組及模型組予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃。各組于造模次日開(kāi)始連續(xù)灌胃28天，銀甘湯組小鼠灌胃劑量與人體折算倍數(shù)為9.01。

1.4.2 模型制備 異氟烷∶丙二醇體積比3∶2配置麻醉用藥，將1 mL上述麻醉藥物滴入自制麻醉裝置中，然后將小鼠放入其中，當(dāng)小鼠呈現(xiàn)深而慢的呼吸狀態(tài)時(shí)，將其上牙齒迅速懸掛于預(yù)置懸吊線，用鑷子將小鼠舌頭拽出，向模型組、銀甘湯組小鼠氣管內(nèi)快速滴入50 μL AdTGF-β1(5.0×108PFU)，空載體組小鼠氣管中滴入50 μL AdEGFP(5.0×108PFU)，空白組小鼠氣管中滴入等體積的PBS，嗆入氣管后直立旋轉(zhuǎn)小鼠數(shù)秒，放回鼠籠，待自然蘇醒。造模當(dāng)天記為0天。

1.5 樣本采集

干預(yù)第28天結(jié)束后，異氟烷麻醉，摘眼球取血，靜置2小時(shí)，4℃ 3000 rpm離心15分鐘，收集血清，-20℃保存，用于ELISA檢測(cè)。取血之后處死，剪取左肺浸泡于4%多聚甲醛，用于病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)；右肺放入液氮中速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃用于RT-qPCR檢測(cè)。

1.6 肺組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

取4%多聚甲醛固定的左肺組織常規(guī)脫水、石蠟包埋及切片，行HE染色、Masson染色。顯微鏡下觀察分析各組小鼠纖維化程度。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)肺組織TGF-β1、BRP-39、IL-17基因表達(dá)水平

提取小鼠肺組織RNA，測(cè)定總RNA含量，電泳檢測(cè)RNA完整性。反轉(zhuǎn)錄按照以下體系建立反應(yīng)體系(RNA均取200 ng，補(bǔ)水到10 μL)：RNA 200 ng(10 μL)，Oligo-dT 1 μL，Random 1 μL。上述反應(yīng)體系混勻，65℃保溫5分鐘，結(jié)束后置于冰上。在上述反應(yīng)體系中加入下列反應(yīng)液：dNTP(10 μM)1 μL，0.1M DTT 1 μL，5×Buffer 4μL，RT酶 1 μL，混勻后置于42℃水浴60分鐘，取出后置于85℃反應(yīng)10分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后置于-20℃待用。每個(gè)樣本分別用待檢測(cè)基因和內(nèi)參基因引擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)，按照以下體系建立擴(kuò)增體系(20 μL)：cDNA 2 μL，PCR mix 10 μL，primer F 1 μL，primer R 1 μL，dd H2O 6 μL，于熒光定量PCR儀上，按照以下條件反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 5分鐘1個(gè)循環(huán)；變性95℃10秒，退火58℃ 20秒，延伸72℃ 20秒，三者共40循環(huán)；熔解曲線 95℃ 15秒，60℃ 60秒，95℃ 15秒，1個(gè)循環(huán)?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。每個(gè)樣本檢測(cè)3次，讀取Ct值，采用以下公式進(jìn)行計(jì)算相對(duì)表達(dá)量(RQ)∶RQ=2-(Ctq-Ctab)(Ctq=待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值；Ctab=對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值)。

表1 引物信息

1.8 ELISA檢測(cè)血清TGF-β1含量及BRP-39、IL-17、IL-13表達(dá)情況

按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度，應(yīng)用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2>0.999為擬合較好，根據(jù)曲線的公式計(jì)算待測(cè)樣品濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HE染色

空白組和空載體組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁完整，未見(jiàn)明顯肺泡融合，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肺組織可見(jiàn)肺泡間隔增寬，肺泡塌陷甚至閉合，大部分肺組織可見(jiàn)實(shí)變，間質(zhì)散在較多炎癥細(xì)胞。銀甘湯組實(shí)變區(qū)占比減少，肺泡結(jié)構(gòu)得到改善，炎癥細(xì)胞明顯減少。見(jiàn)圖1。

注：A.空白組;B.空載體組;C.模型組;D.銀甘湯組；標(biāo)尺=100 μm。

2.2 Masson染色

空白組和空載體組小鼠肺組織除在氣道和血管周?chē)猓瑑H見(jiàn)少量藍(lán)色膠原纖維增生，肺泡間隔未增寬。模型組小鼠肺組織片狀實(shí)變區(qū)及增厚的肺泡間隔均可見(jiàn)大量的藍(lán)色膠原纖維沉積。銀甘湯組小鼠肺組織膠原纖維增生程度較模型組減輕。見(jiàn)圖2。

注：A 空白組、B 空載體組、C 模型組、D 銀甘湯組；標(biāo)尺=100 μm。

2.3 各組小鼠肺組織和血清TGF-β1含量情況

采用RT-qPCR檢測(cè)各組小鼠肺組織中TGF-β1 mRNA水平，空載體組與空白組比較，指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組TGF-β1 mRNA水平顯著高于空白組及空載體組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，銀甘湯組TGF-β1 mRNA水平顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中TGF-β1含量，空載體組與空白組比較，指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組TGF-β1 含量顯著高于空白組及空載體組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，銀甘湯組TGF-β1含量顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組TGF-β1重組腺病毒載體誘導(dǎo)肺纖維化小鼠TGF-β1含量情況

2.4 各組小鼠肺組織BRP-39、IL-17 mRNA表達(dá)情況

模型組BRP-39 mRNA、IL-17 mRNA水平明顯高于其他組，與空白組和空載體組比較，BRP-39 mRNA水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，IL-17 mRNA水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。銀甘湯組兩者水平較模型組有不同程度的下降，其中，IL-17 mRNA水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而B(niǎo)RP-39 mRNA水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但具有下調(diào)趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

表3 各組TGF-β1重組腺病毒載體誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織BRP-39、IL-17 mRNA水平

2.5 各組小鼠血清BRP-39、IL-17、IL-13表達(dá)水平

模型組小鼠血清中BRP-39、IL-17、IL-13水平均有升高，與空載體組比較，BRP-39、IL-17水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，IL-13水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。經(jīng)過(guò)銀甘湯治療后，小鼠血清中三種炎癥因子的蛋白表達(dá)水平均有下調(diào)。與模型組比較，銀甘湯組BRP-39、IL-17水平下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而銀甘湯組IL-13水平雖無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但有下調(diào)趨勢(shì)。見(jiàn)表4。

表4 各組TGF-β1重組腺病毒載體誘導(dǎo)肺纖維化小鼠血清BRP-39、IL-17、IL-13表達(dá)水平

3 結(jié)論

目前，制備肺纖維化動(dòng)物模型的誘導(dǎo)方式多用博來(lái)霉素，存在制模時(shí)間長(zhǎng)等局限性[9]。Sime等[1]研究組以腺病毒為載體將TGF-β1基因轉(zhuǎn)入大鼠體內(nèi)，并使其在肺泡上皮中高表達(dá)，成功制備了TGF-β1單基因過(guò)表達(dá)誘發(fā)的大鼠肺纖維化動(dòng)物模型。隨后，李建等[10]的實(shí)驗(yàn)也表明以TGF-β1重組腺病毒誘導(dǎo)是一種可靠的肺纖維化動(dòng)物模型制備方法，腺病毒誘發(fā)的肺纖維化的發(fā)病急、炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈、細(xì)胞外基質(zhì)增生迅速等特點(diǎn)與特發(fā)性肺纖維化病理過(guò)程相似。再者，以TGF-β1作為目的基因，用重組腺病毒載體進(jìn)行包裝導(dǎo)致的肺纖維化，直接針對(duì)TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路，靶點(diǎn)明確。

本研究所用銀甘湯由金銀花和生甘草按3∶1比例配伍而成，均是肺痹湯的主要組成部分。方中金銀花辛涼解表，清熱解毒；生甘草清熱解毒，祛痰止咳，調(diào)和諸藥。兩藥配合，藥理研究表明能起到抗炎、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫的作用。

本次實(shí)驗(yàn)從病理形態(tài)學(xué)結(jié)果來(lái)看，模型組小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增厚程度以及膠原纖維增生程度都比空白組和空載體組嚴(yán)重；而且模型組肺組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá)及血清中TGF-β1含量均比空白組和空載體組高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這兩者都提示了本實(shí)驗(yàn)肺纖維化小鼠模型制備的成功。

從病理形態(tài)學(xué)結(jié)果看，銀甘湯組小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增厚程度以及膠原纖維增生程度較模型組有所減輕。通過(guò)肺組織勻漿RT-qPCR和血清ELISA，發(fā)現(xiàn)銀甘湯可以降低肺組織中BRP-39 mRNA、IL-17 mRNA表達(dá)及血清中BRP-39、IL-17、IL-13表達(dá)水平。

此次研究表明，使用TGF-β1重組腺病毒進(jìn)行氣管滴注，能夠較好地制備肺纖維化動(dòng)物模型。TGF-β1可以促進(jìn)BRP-39、IL-17、IL-13等炎性因子的分泌，而銀甘湯可以減輕AdTGF-β1誘導(dǎo)C57BL/6小鼠的炎性反應(yīng)，從而在一定程度上緩解TGF-β1重組腺病毒誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。本次研究?jī)H針對(duì)造模后第28天的結(jié)果，對(duì)于炎性因子的動(dòng)態(tài)變化缺少觀察，今后可在造模后第3、7、14、28天分階段取材，深入研究AdTGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，使其更好地應(yīng)用于肺纖維化研究領(lǐng)域。