趙楠，楊鶴同，趙桂華，2

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2.句容市潤泰生物科技有限公司，江蘇 句容 212400）

白流蘇屬[AlbifimbriaL. Lombard & Crous（MB815924）]隸屬于半知菌亞門、絲孢綱、葡萄穗霉菌科（Stachybotriaceae），該科于2014 年由Crous 等[1]建立，包括了白流蘇屬在內(nèi)的24 屬106 種[2]。

2016 年，Lombard & Crous[2]建立了白流蘇屬（A.L. Lombard & Crous, gen. nov.）新屬，包括綠色白流蘇菌（A.viridisL.Lombard&Crous，MB815928）、側(cè)生白流蘇菌（A.lateralisL.Lombard&Crous,MB815925）、土生白流蘇菌（A. terrestrisL. Lombard & Crous，MB815926）3 個新種和瘤狀白流蘇菌[A. verrucaria（Alb. & Schwein.）L. Lombard & Crous, MB815927]一個新組合。有性世代不詳。

在我國，小龍蝦是綠色白流蘇菌的新宿主；在實驗室條件下，對該菌的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和DNA進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2018 年6 月13 日，在句容市潤泰生物科技有限公司養(yǎng)殖基地（31°50′73″N，119°10′08″E）采集到患有小龍蝦黑鰓病標本，裝入標本袋，放在4 ℃低溫冷藏箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 分離培養(yǎng)

將病蝦黑鰓放在自來水龍頭沖洗1 h 后，再放在滅菌水中洗3 次，取出后用滅菌的濾紙吸干黑鰓上的水分，用滅菌的剪刀將病鰓片剪下，在無菌條件下，轉(zhuǎn)移到含有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿放5塊鰓片組織，置于（25±2）℃的PRX-250A 型智能人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)（RH70%，黑暗），共分離12 皿60塊，5 d 后取出檢查，并統(tǒng)計分離結(jié)果。對不同顏色的真菌菌落分別進行純化、編號。對分離到的細菌未作進一步研究。

1.3 形態(tài)觀察

①將菌株接種到PDA 平面培養(yǎng)基上7～10 d（培養(yǎng)條件同1.2）觀察菌落生長形狀。

②載玻片培養(yǎng)：挑取該真菌的菌絲少許，接種到載玻片上的PDA 培養(yǎng)基上[3]（培養(yǎng)條件同1.2），培養(yǎng)5～6 d，待產(chǎn)生分生孢子后，做成臨時玻片，在德國蔡斯（Zeiss Imagers.A1）光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)，測量大小（n=30），并拍照。再根據(jù)相關(guān)資料[2]進行形態(tài)學(xué)比對、鑒定。

1.4 DNA 提取、純化和測序

該真菌的DNA 提取、PCR 擴增和測序反應(yīng)的試驗方法和步驟由南京金斯瑞生物科技有限公司協(xié)助完成，測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過NCBI的Blast 檢索系統(tǒng)進行序列同源性比對。測序菌株代號為177（保存菌種代號NLHf-6，即黑鰓病真菌6 號菌株）。

2 結(jié)果

2.1 分離結(jié)果

在60 塊鰓片上共分離得到真菌菌落37 個，占61.7%，細菌菌落23 個，占38.3%；經(jīng)初步鑒定，真菌有5 屬7 種，其中包括綠色白流蘇菌；其他的分離結(jié)果該文不作討論。

2.2 白流蘇屬

AlbifimbriaL. Lombard & Crous,Persoonia36:177 (2016)

MycoBank MB815924

該屬為中國新的記錄屬，模式種為瘤狀白流蘇菌[A.verrucaria（Alb.&Schwein.）L.Lombard&Crous.]，有性態(tài)未知。

在PDA 培養(yǎng)基上菌落白色，生長較慢。孢梗束似子座，表生，杯狀到盤狀，卵形到長形或外表不規(guī)則形狀，周圍有白色條紋，淡橄欖綠到暗綠色的菌絲叢；分生孢子堆粘頭狀；單根分生孢子梗從表面菌絲直接產(chǎn)生，桶狀、腎形至臘腸形，無色，光滑；子座的圓胞組織發(fā)育良好，無色。剛毛單生，不分枝，具分隔，無色，表面粗糙，薄壁，直或彎曲，從分生孢子梗之間或白色條紋中的子座基部直接產(chǎn)生；分生孢子梗菌絲狀，不規(guī)則，輪生或瓶梗狀分枝，無色，光滑；產(chǎn)孢細胞瓶梗狀，無色，光滑，圓柱形至臘腸形，具明顯囊領(lǐng)；分生孢子無隔膜，橢圓形、紡錘形、檸檬形到近圓形，無色，光滑[2]。

2.3 綠色白流蘇菌

為中國新記錄的種（圖1、圖2）。

A. viridisL. Lombard & Crous,Persoonia36:178 (2016) Fig.1～Fig.2

MycoBank: MB815928

2.3.1 培養(yǎng)性狀 在（25±2）℃（RH70%，黑暗）的PDA培養(yǎng)基上菌落生長慢，平均日生長量為2.5 mm，菌落白色（圖1），具短的氣生菌絲，在孢梗束上形成淡綠色分生孢子堆；培養(yǎng)皿背面為淡土黃色。菌落邊緣具偶散生的孢梗束，后期淡土黃色分泌物會擴散到PDA 培養(yǎng)基中。

2.3.2 形態(tài)特征 該真菌的分生孢子座表生，杯狀至盤狀，單生聚生，卵形至長形或不規(guī)則形，（110～640）μm×（53～162）μm，菌落邊緣有剛毛，剛毛生于子座基部薄壁細胞，無色，具小瘤，有分隔，不分枝，彎曲到旋轉(zhuǎn)狀，頂端鈍圓，（58～90）μm×（3～4.2）μm；分生孢子梗從子座基部產(chǎn)生，分枝，無色，光滑，長達65 μm（圖2a）；產(chǎn)孢細胞瓶梗狀，圓柱形，無色，光滑，（8～14）μm ×（1～2）μm，具明顯的囊領(lǐng)；分生孢子單細胞，光滑，無色，紡錘形，梭形，（7.5～8）μm×（2～3）μm（圖2b）。

該真菌分布在印度西部的浦那（Poona）市、伊拉克、美國堪薩斯州等地，中國屬于首次記載。小龍蝦是該真菌的新宿主。

圖1 綠色白流蘇菌在PDA 上的菌落

圖2 綠色白流蘇菌分生孢子梗和分生孢子

2.4 分子鑒定

通過對該真菌菌絲的DNA 提取，用ITS1 和ITS4 的通用引物進行PCR 擴增，得到長度為567 bp 的特異性DNA 片段。擴增ITS 區(qū)全序列（圖3），結(jié)果為：

對擴增片段進行測序，用NCBI 的Blast 在Genbank 中搜尋相似序列，結(jié)果與Genbank 中登陸號為KU845899.1,KU845897.1,KU845896.1 和KU845892.1[包括18S 核糖體RNA 基因的部分序列，ITS1（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1），5.8S 核糖體RNA 基因和ITS2 全序列，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2 全序列和28 S 核糖體RNA 基因部分序列]的同源性均為100%，因此，可以確定小龍蝦黑鰓上的菌株為綠色白流蘇菌（A. viridis），菌株保存在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程技術(shù)中心真菌研究室，菌株編號為NLHf-6。

圖3 ITS 1 和ITS 4 區(qū)域的PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

2.5 相似種的比較

根據(jù)2016 年Lombard 等[2]報道的白流蘇屬的4個種，土生白流蘇菌（A. terrestris）作為一個新組合，與其他2 個種形成了高度支持的進化枝，形態(tài)學(xué)類似于瘤狀白流蘇菌（A. verrucaria）[4]和綠色白流蘇菌。土生白流蘇菌的分生孢子（6～8）μm×（2～3）μm，平均（7×3）μm，比瘤狀白流蘇菌和綠色白流蘇[（7～8）μm ×（2～3）μm]略小一些[4]，而側(cè)生白流蘇菌（A.lateralis）的分生孢子（4～6）μm×（2～4）μm，平均（5×3）μm，是分生孢子最小的種[2]。

綠色白流蘇是小龍蝦黑鰓病鰓組織上的一種真菌，是否是病原仍需進行致病性試驗才能確定。