劉宇寒，潘廣濤，尚羅銳，周方園，楊勝蘭

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結合科，武漢 430000

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種由新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒(SARS-Cov-2)引起的急性傳染病。該疾病具有傳染性強，潛伏期長、始發(fā)癥狀多樣化等特點，臨床癥狀早期可表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、乏力、納差、腹瀉等，隨病情進展可出現(xiàn)呼吸困難、胸悶胸痛等癥，危重者可進展為急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能衰竭、凝血功能障礙等[1]。截止2020年3月25日24時，我國累計報告確診病例81 285例，累計死亡病例3 287例[2]。目前尚無治療新型冠狀病毒肺炎的特效藥物，但中醫(yī)藥具有整體觀念、辨證論治的優(yōu)勢，可對不同患者制定個體化的中醫(yī)治療方案，在臨床治療中取得顯著療效。

當歸芍藥散出自《金匱要略》，由當歸、芍藥、川芎、白術、澤瀉、茯苓六味中藥組成，具有養(yǎng)血調肝，健脾利濕的功效。武漢協(xié)和醫(yī)院是新冠肺炎重癥患者救治定點醫(yī)院，本研究團隊在三因制宜原則及運氣學說指導下，應用當歸芍藥散治療COVID-19重癥患者100例，取得滿意療效。

為進一步闡明當歸芍藥散對COVID-19的作用機制，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的研究方法，篩選當歸芍藥散的活性活性成分，運用TCMSP、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索當歸芍藥散及COVID-19的相關靶點，構建“藥物-活性成分-疾病-靶點”的互作網(wǎng)絡，并對其交集靶點進行生物信息學分析，為當歸芍藥散治療COVID-19的分子機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采取回顧性分析方法，使用隨機數(shù)表法選取2020年1月20日到2020年3月20日在武漢協(xié)和醫(yī)院住院的100名COVID-19患者作為研究對象。其中男41例(41%)，女59例(59%)，年齡28～49歲，平均63.75±13.23歲；平均體溫38.30±0.62 ℃；心率91.51±16.73次/min；呼吸20.6±2.47次/min；氧飽和度92.9%±5.84%；既往病史中高血壓48例(48%)，糖尿病34例(34%)，冠心病29例(29%)，慢性肝病10例(10%)。

1.2 治療方案

新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案中基礎治療方案結合當歸芍藥散，每日一劑，水煎400 mL分兩到四次溫服。

1.3 觀察指標

觀察治療前及治療后10天體溫、心率、呼吸、氧飽和度的改善情況、主要癥狀的消失情況、核酸轉陰率、CT影像學好轉率、實驗室檢查指標包括白細胞(WBC)計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)(LYMPH)、C反應蛋白(CRP)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)的變化水平。

1.4 統(tǒng)計方法

1.5 當歸芍藥散中活性成分及其作用靶點信息的收集

將當歸芍藥散中涉及的中藥(當歸、芍藥、川芎、白術、澤瀉、茯苓)，其中芍藥根據(jù)原方義確定為白芍，分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺[3](TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)進行檢索，得到所有中藥活性成分及其作用靶點，按口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30%及類藥性(drug-like，DL)>0.18 進行篩選。利用Universal Protein數(shù)據(jù)庫[4](UniProt，https://www.uniprot.org/)檢索各靶點對應的基因名稱，利用Perl語言進行名稱轉換，得到藥物靶點基因列表，以便后續(xù)分析。

1.6 COVID-19疾病靶點的獲取及當歸芍藥散治療COVID-19的潛在作用靶點預測

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫[5](https://www.genecards.org/)，輸入疾病名稱“novel coronavirus pneumonia”，獲得該疾病對應靶點信息。利用Draw Venn Diagram網(wǎng)站對疾病靶點與藥物靶點分析，提取二者交集，為當歸芍藥散治療COVID-19的潛在作用靶點。

1.7 當歸芍藥散活性成分-COVID-19-疾病靶點的相互作用網(wǎng)絡

利用STRING網(wǎng)站[6](https://string-db.org/)，設定物種來源為“Homo sapiens”，輸入之前分析得到的藥物-疾病靶點交集，分析得到蛋白相互作用網(wǎng)絡。用Cytoscape3.6.1[7]對共同靶點進行統(tǒng)計，并對結果進行可視化展示，對該網(wǎng)絡圖而言，顏色越深，節(jié)點越大，節(jié)點自由度越高，重要性越強。

1.8 當歸芍藥散活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡構建

將之前得到的藥物及疾病對應的潛在作用靶點，藥物的活性成分信息，分別導入Cytoscape3.6.1軟件，繪制“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖，

1.9 當歸芍藥散活性成分-疾病靶點的GO功能富集分析

運用R語言及其后臺數(shù)據(jù)庫“org.Hs.eg.db”獲取此前得到的藥物相關疾病的潛在作用靶點的基因ID(entrezID)，再運用DAVID[8](https://david.ncifcrf.gov/)對潛在作用靶點進行GO(Gene Ontology)功能富集分析，包括以下三方面內容：生物學過程富集分析(biological process，BP)、細胞組成富集分析(cellular component，CC)、分子功能富集分析(molecular function，MF)，利用R語言對其進行可視化處理，設定pvalueCutoff = 0.05，qvalueCutoff = 0.05，按顯著性排序，將GO三部分各自前10條富集條目以柱狀圖展示。

1.10 當歸芍藥散活性成分-疾病靶點的KEGG通路富集分析

獲取基因ID步驟同GO分析，運用R語言clusterProfiler程序包對得到的進行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，設定pvalueCutoff = 0.05，qvalueCutoff = 0.05，按顯著性排序，將排名前20的富集條目以氣泡圖展示。

2 結果

2.1 COVID-19患者基本體征及主要癥狀改善情況

治療后10天，COVID-19患者基本體征包括體溫、心率較治療前明顯下降(P<0.05)，氧飽和度較前明顯上升(P<0.01)；且具有相關癥狀包括發(fā)熱、咳嗽咳痰、咽干咽痛、乏力、胸悶氣促的患者人數(shù)較治療前明顯減少(P<0.01)(見表1～2)。

表1 COVID-19患者基本體征改善情況

表2 COVID-19患者主要癥狀改善情況

2.2 COVID-19患者實驗室檢查及核酸、CT影像學改善情況

統(tǒng)計分析100例COVID-19患者的實驗室檢查結果發(fā)現(xiàn)，其治療后10天的淋巴細胞計數(shù)較治療前明顯上升(P<0.01)；白細胞數(shù)、LDH、CRP、AST較治療前明顯下降(P<0.05)； ALT較治療前無明顯差異。實驗室檢查復常率均在65%以上，治療后10天，患者的CT影像學好轉率為71%；核酸轉陰率為62%；見表3和4。

2.3 當歸芍藥散中活性成分篩選結果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索當歸芍藥散的活性成分，按照OB>30%及DL>0.18的標準篩選得到活性成分共51個(表5)，其中當歸2個，白芍12個，川芎6個，白術7個，茯苓15個，澤瀉9個。繼續(xù)使用TCMSP檢索51個活性成分的作用靶點共227個，利用UniPort數(shù)據(jù)庫進行轉換，獲得對應的基因名共227個，去重后，剩92個(部分信息見表6，全部信息見補充數(shù)據(jù))。

表3 COVID-19患者CT影像好轉、核酸轉陰情況比較

表4 COVID-19患者實驗室檢查結果

續(xù)表5(Continued Tab.5)

表6 當歸芍藥散活性成分的部分靶點信息

2.4 當歸芍藥散活性成分-COVID-19疾病靶點的預測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)COVID-19疾病相關靶點259個(部分信息見表7，全部信息見補充數(shù)據(jù))。利用Draw Venn Diagram網(wǎng)站，對當歸芍藥散及COVID-19的相關靶點進行分析，得到共同靶點18個，對應的基因詳細信息見表8。當歸芍藥散活性成分與COVID-19疾病相關靶點結果由韋恩圖展示，見圖1。

表7 COVID-19疾病相關的部分靶點信息

表8 當歸芍藥散活性成分與COVD-19相關的靶點信息

圖1 當歸芍藥散中活性成分作用靶點與COVID-19疾病靶點交集

2.5 當歸芍藥散活性成分與COVID-19疾病靶點的互作網(wǎng)絡分析

通過STRING網(wǎng)站，對此前分析得到的18個共同靶點進行分析，得到其蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)，利用Cytoscape3.6.1對STRING分析得到的數(shù)據(jù)進行可視化分析(見圖2)，對該網(wǎng)絡圖而言，顏色越深，節(jié)點越大，節(jié)點自由度越高，重要性越強。

2.6 當歸芍藥散復方-活性成分-COVID-19疾病靶點網(wǎng)絡的構建

將表8中的18個共同靶點及其對應的14個中藥活性成分輸入Cytoscape3.6.1中進行分析，構建當歸芍藥散治療COVID-19的靶點網(wǎng)絡圖(見圖3)，圖中節(jié)點間的連線，代表二者間的關系，連線越多的中藥活性成分或靶點，提示其可能為當歸芍藥散治療COVID-19的關鍵成分或主要靶點。

圖2 當歸芍藥散治療COVID-19的作用靶點的PPI網(wǎng)絡

圖3 當歸芍藥散-活性成分-作用靶點-COVID-19網(wǎng)絡圖Fig.3 Network diagram of Danggui Shaoyao Powder-active ingredients-target-COVID-19

2.7 當歸芍藥散活性成分-疾病靶點的GO生物功能富集分析

將表8中的18個共同靶點輸入DAVID網(wǎng)站，進行GO功能富集分析，包括生物學過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)三方面，共得到180個條目(P<0.05)，運用R語言對其顯著性進行排序，分別取BP、CC、MF排名前10個條目做可視化分析(見圖4)。在生物過程中主要涉及對脂多糖的反應，對氧化應激的反應，對抗生素的反應等；在細胞組分中主要涉及細胞膜，線粒體，微體等；在分子功能中主要涉及血紅素結合、蛋白磷酸酶結合、腫瘤壞死因子受體超家族結合等。圖4中橫坐標為GO功能富集條目名稱，縱坐標為富集于該條目的基因數(shù)量。以上數(shù)據(jù)提示，當歸芍藥散治療COVID-19的作用可能與上述生物功能密切相關。

2.8 當歸芍藥散活性成分-疾病靶點的KEGG通路富集分析

將表8中的18個共同靶點導入R語言，利用clusterProfiler程序包進行KEGG通路富集分析，共得到109個條目(P<0.05)，對其排名前20個條目做氣泡圖展示(見圖5)，條目主要為：結核病、AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、Epstein-Barr病毒感染、沙門氏菌感染、TNF信號通路、弓形蟲病、麻疹、甲型流感、人類免疫缺陷病毒1型感染、人巨細胞病毒感染、百日咳、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、小細胞肺癌、查加斯病(美國錐蟲病)、阿米巴病、凋亡通路。圖5中縱坐標為富集通路名稱，橫坐標為富集于該通路的基因個數(shù)所占比例。Count代表富集于該通路的基因個數(shù)。以上數(shù)據(jù)提示，當歸芍藥散治療COVID-19的作用可能與上述信號通路密切相關。

圖4 當歸芍藥散治療COVID-19的作用靶點的GO功能富集結果Fig.4 GO functional enrichment results of action targets of Danggui Shaoyao Powder in the treatment of COVID-19

圖5 當歸芍藥散治療COVID-19的作用靶點的KEGG通路富集結果Fig.5 KEGG pathway enrichment results of action targets of Danggui Shaoyao Powder in the treatment of COVID-19

4 討論

COVID-19屬于祖國醫(yī)學“疫病”范疇，其臨床癥狀多樣化，可出現(xiàn)多個不同臟腑的癥狀，中醫(yī)診療過程中，應注重整體觀念，結合實際時令運氣，對患者進行辨證施治。2020年中文括號庚子年) 歲運為金運太過，燥金之年?！端貑枴饨蛔兇笳摗费裕骸皻q金太過，燥氣流行，肝木受邪?！笨芍诖嗽锝鹬?，由于肺屬金，故極易出現(xiàn)咳、痰、喘等肺系疾病。金克木，故亦可出現(xiàn)木臟疾病。治療上應養(yǎng)陰潤燥、滋養(yǎng)肝血。新冠肺炎暴發(fā)于庚子年初之氣，病位在肺，累及肝脾，在清熱化濕解毒的基礎上，務必要結合金運太過之年運氣特點健脾氣、養(yǎng)肝血、護陰液，尤其是對于新冠肺炎重癥患者，由于病程較長，加之使用了大量耗氣傷陰之品，元氣大傷，治療上尤其如此。當歸芍藥散方中當歸、川芎、白芍養(yǎng)肝血、潤肺燥；白術健運脾土，兼燥濕；茯苓瀉肺之郁熱；澤瀉滲濕、瀉肺氣，全方具奏養(yǎng)、潤、運、清之功。

本研究團隊選用當歸芍藥散治療COVID-19重癥患者100例，取得良好療效。結果顯示，治療10天后，患者基本體征即體溫、心率較治療前明顯下降，氧飽和度較前明顯上升；主要癥狀具有發(fā)熱、咳嗽、咽干咽痛、乏力、胸悶氣促的患者人數(shù)較前明顯減少。住院天數(shù)為22.7±7.97天，核酸轉陰率為62%，CT影像好轉率為71%，實驗室檢查復常率均在65%以上。以上結果表明當歸芍藥散對于臨床治療COVID-19患者具有良好療效，因此，利用網(wǎng)絡藥理學進步探討其對于COVID-19的潛在作用機制尤為重要。

本次網(wǎng)絡藥理學篩選出當歸芍藥散可能作用于COVID-19疾病的活性成分14個，包括芍藥苷、山奈酚、β-谷甾醇、楊梅酮、豆甾醇等。芍藥苷可通過減輕炎癥細胞浸潤和改善肺微血管通透性來對脂多糖誘導的急性肺損傷起保護作用[9]。山奈酚可有效抑制脂多糖引起的急性肺損傷中的細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，進而減輕氣道炎癥，減輕肺組織損傷[10]；其還可通過抑制炎癥反、改善肝細胞凋亡，從而對D-氨基半乳糖/脂多糖誘導的小鼠急性肝衰竭起保護作用[11]。β-谷甾醇可明顯抑制病毒感染引起的炎癥反應，進而減輕肺損傷，可用于預防或治療甲流的抗病毒藥物制備[12]。楊梅酮可抑制EB病毒復制，進而減輕病毒感染[13]。豆甾醇可通過抑制活性氧(ROS)增加而發(fā)揮抗氧化作用，其還可明顯抑制LPS誘導的環(huán)氧合酶-2(COX-2)及前列腺素E2(PGE2)發(fā)揮抗炎作用[14]。由上可見，當歸芍藥散中諸多化合物具有抗病毒、抗炎、抗氧化等作用。提示其對新型冠狀病毒肺炎引發(fā)的肺損傷及肝損傷具有潛在的治療作用。

GO功能富集結果顯示，BP主要涉及對脂多糖的反應，對氧化應激的反應，對抗生素的反應等。脂多糖可通過激活CASP11，誘導肺上皮細胞出現(xiàn)細胞焦亡，即細胞死亡同時釋放大量炎性因子，進而引發(fā)急性肺損傷[15]。在機體肺損傷過程中，過度的氧化介質會加重肺組織的損傷[16]。過度使用抗生素可出現(xiàn)微生物群耗竭，進而引起肺損傷的加重，可表現(xiàn)為肺通透性增加，氧合指數(shù)增加，肺順應性降低，肺勻漿中細胞因子/趨化因子水平升高[17]。以上結果提示當歸芍藥散可能通過調節(jié)多種生物功能進而對COVID-19疾病起治療作用。

KEGG通路富集結果顯示，當歸芍藥散治療COVID-19疾病涉及的主要通路為結核病、AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染及EB病毒感染等。其中結核病通路上富集的靶點最多，分別為CD14、CASP8、CASP3、Bax、Bcl-2、NF-κB、IL-6、STAT、iNOS。結核病通路尤為復雜，涉及細胞凋亡、TLR、MAPK等多條信號通路。TLR及MAPK通路均為炎癥反應過程中的重要通路，TLR啟動結合后，可激活NF-κB、p38及JNK，進而引發(fā)IL-6、iNOS等多種炎癥介質大量釋放，發(fā)生炎癥級聯(lián)反應，進而對機體組織造成損傷[18]。肺損傷及肺纖維化中均可發(fā)生細胞凋亡，其中Bcl-2和Bax則是調控細胞凋亡的關鍵蛋白[19]。同時，當歸芍藥散可能通過乙肝病毒、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、EB病毒、IL-17等通路等發(fā)揮抗病毒、抗炎等作用，體現(xiàn)其對于COVID-19疾病的治療作用具有多靶點、多通路的特點。

綜上所述，當歸芍藥散治療COVID-19可能通過其有效活性成分芍藥苷、山奈酚、β-谷甾醇、楊梅酮、豆甾醇等作用于結核病、AGE-RAGE、乙型肝炎、IL-17及EB病毒感染等信號通路發(fā)揮抗病毒、抗炎、抗氧化作用，進而改善COVID-19患者的臨床癥狀。介于疫情期間醫(yī)療資源緊張，條件有限，本文中僅選取100例病例用于臨床研究，樣本量有限，統(tǒng)計結果只有一定的參考意義，且網(wǎng)絡藥理學本身具有一定的局限性，本研究分析獲取的結果可能存在一定偏差，需今后在臨床中進一步驗證。