陳怡飛，常 江，施杏芬，羅綺霞，楊 華，唐 標(biāo)*，夏效東

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州 310021；3.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 310020；4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310003)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)是引起畜禽感染發(fā)病的主要病原菌，常常給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失。畜禽大腸埃希氏菌的耐藥性不僅影響畜禽疾病的有效防控，更加劇了動(dòng)物性食品中抗菌藥物的殘留風(fēng)險(xiǎn)[1]。此外，畜禽致病性大腸埃希氏菌還可能通過食物鏈感染人體或?qū)⒛退幓蜣D(zhuǎn)移給人類病原菌，造成人用抗菌藥物療效下降或治療失敗[2-3]。畜禽糞便中分離的大腸埃希氏菌多為多重耐藥細(xì)菌。有研究對(duì)上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)分離的741株雞源大腸埃希氏菌做了藥敏檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雞源大腸埃希氏菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，多重耐藥菌株達(dá)到80%以上[4]。用抗菌藥物紙片對(duì)雞糞便來源的40株大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)40株大腸埃希氏菌的多重耐藥率(耐3種以上藥物)為100%[5]。用PCR對(duì)140株昆明農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分離的雞源大腸埃希氏菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有分離株都攜帶6個(gè)以上耐藥基因，90.71%的分離菌株同時(shí)攜帶10個(gè)以上的耐藥基因[6]。目前國(guó)內(nèi)的研究大多是對(duì)動(dòng)物源分離菌株進(jìn)行藥敏檢測(cè)，得到多重耐藥率數(shù)據(jù)，從全基因組完成圖的角度研究分離細(xì)菌的耐藥機(jī)制目前較少。本研究以2株分離自雞糞便的多重耐藥大腸埃希氏菌為研究對(duì)象，首先經(jīng)藥敏檢測(cè)獲得其耐藥表型，通過3代測(cè)序獲得其全基因組完成圖并進(jìn)行序列分析，解析了大腸埃希氏菌耐藥的產(chǎn)生機(jī)制，為養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2株大腸埃希氏菌ECCHD184和ECCWS199于2017年從浙江省寧波市某養(yǎng)殖場(chǎng)采集的肉雞糞便樣品中分離得到。經(jīng)Viteck?2 Compact細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和16S rRNA比對(duì)確定后，于250 mL/L甘油中保藏，置-80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑 革蘭氏陰性菌藥敏檢測(cè)板，上海星佰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；Mueller-Hinton肉湯(MHB)、LB瓊脂和伊紅美藍(lán)(EMB)培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶和S1核酸酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；硫酸慶大霉素、鹽酸四環(huán)素、恩諾沙星、氨芐青霉素鈉，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速微量離心機(jī)，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；脈沖場(chǎng)電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司產(chǎn)品；全自動(dòng)微生物分析儀，法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 用Biofosun?革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板(基于微量肉湯稀釋法)檢測(cè)2株大腸埃希氏菌對(duì)氨芐西林(AMP)、奧格門丁( A/C)、慶大霉素(GEM)、四環(huán)素(TET)、大觀霉素(SPT)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異惡唑(SF)、復(fù)方星諾明(SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)、安普霉素(APR)、黏菌素(CL)等15種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的相關(guān)藥敏折點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)判斷這兩株分離菌的是否耐藥，以R(耐藥)、S(敏感)表示。

1.2.2 基因組DNA的提取 分離株在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)12 h，挑單菌落于含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，再以10 mL/L的接種量接種于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h～4 h，4℃ 5 000 r/min離心10 min,收集菌體。參照上海捷瑞生物工程有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書的步驟提取基因組DNA。

1.2.3 全基因組測(cè)序與序列分析 用第3代測(cè)序儀PacBio RS Ⅱ?qū)?株大腸埃希氏菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，序列采用Celera Assembler組裝軟件進(jìn)行組裝，并且利用Quiver對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化?；蚪M通過NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline自動(dòng)注釋。將全基因組序列和注釋結(jié)果上傳至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫上，獲得登錄號(hào)分別為CP033250(染色體，ECCHD184)、CP033251(pTB211質(zhì)粒，ECCHD184)、CP033252(pTB212質(zhì)粒，ECCHD184)、CP032237(染色體，ECCWS199)、CP032238(pTB221質(zhì)粒，ECCWS199)、CP032239(pTB222質(zhì)粒，ECCWS199)。用PlasmidFinder 2.1[7]鑒定菌株攜帶的復(fù)制子類型，ResFinder 3.2[8]用于預(yù)測(cè)細(xì)菌染色體基因組及質(zhì)粒中的獲得性耐藥基因，VirulenceFinder 2.0[9]用于預(yù)測(cè)細(xì)菌染色體基因組及質(zhì)粒中的毒力因子,oriTfinder[10]用于預(yù)測(cè)菌株質(zhì)?；蚪M中的水平轉(zhuǎn)移元件。

1.2.4 S1-PFGE 以XbaⅠ 酶切沙門氏菌H9812作為Marker，將ECCHD184和ECCWS199菌株包埋于瓊脂糖凝膠中，隨后用S1核酸酶對(duì)包埋膠塊進(jìn)行處理，使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)分離質(zhì)粒。電泳的參數(shù)設(shè)定參考王翔宇[11]的方法。電泳后用EB對(duì)膠塊進(jìn)行染色，脫色后使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

1.2.5 細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力曲線的測(cè)定 根據(jù)1.2.1藥敏試驗(yàn)得到的2株菌的耐藥結(jié)果，各選取3種不同種類的抗菌藥物在1/4 MIC的濃度下下探究多種抗菌藥物對(duì)耐藥菌株生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。將凍存于-80℃的2株大腸埃希氏菌采用劃線法在LB平板上活化，挑取單菌落接種于5 mL LB肉湯中，37℃過夜培養(yǎng)后,4℃、5 000 r/min離心10 min。用生理鹽水洗滌菌體沉淀，洗滌2次后用MHB調(diào)整菌液濁度為0.50～0.53麥?zhǔn)蠞岫?約為1.5×108CFU/mL)，用MHB進(jìn)行稀釋100倍后加入百孔蜂窩板中。對(duì)于大腸埃希氏菌ECCHD184，選取青霉素類(氨芐西林128 μg/mL)、氨基糖苷類(慶大霉素4 μg/mL)、喹諾酮類(恩諾沙星4 μg/mL)作為抗菌藥物組合，并設(shè)置空白對(duì)照；對(duì)于大腸埃希氏菌ECCWS199，選取青霉素類(氨芐西林128 μg/mL)、四環(huán)素類(四環(huán)素32 μg/mL)、喹諾酮類(恩諾沙星1 μg/mL)作為抗菌藥物組合，并設(shè)置空白對(duì)照。加入抗菌藥物后將百孔板置于微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中37℃培養(yǎng)24 h，每隔1 h檢測(cè)600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，菌液OD 600 nm值作為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

ECCHD184菌株對(duì)氨芐西林、慶大霉素、大觀霉素、安普霉素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻呋10種抗菌藥物均表現(xiàn)出耐藥；ECCWS199菌株對(duì)氨芐西林、奧格門丁、大觀霉素、安普霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、頭孢噻呋、恩諾沙星、氧氟沙星11種抗菌藥物均表現(xiàn)出耐藥。2株菌對(duì)頭孢他啶、美羅培南和黏菌素均表現(xiàn)為敏感。2株菌的耐藥譜范圍較廣，均為多重耐藥大腸埃希氏菌(表1)，表1中“S”為敏感;“R”為耐藥。

2.2 全基因組測(cè)序結(jié)果分析

菌株ECCHD184全基因組序列全長(zhǎng)5 058.292 kb，平均覆蓋深度為188.0×，攜帶有2個(gè)質(zhì)粒，其中pTB211質(zhì)粒大小為164.062 kb，G+C含量為50.22%，復(fù)制子類型為IncFIB；pTB212質(zhì)粒大小為110.417 kb，G+C含量為49.38%，未預(yù)測(cè)到已知復(fù)制子。ECCWS199菌株全基因組序列全長(zhǎng)5 059.364 kb，平均覆蓋深度為194.0×，攜帶有2個(gè)質(zhì)粒，其中pTB221質(zhì)粒大小為162.1 63 kb，G+C含量為53.0%，復(fù)制子類型為IncA/C2；pTB222質(zhì)粒大小為159.756 kb，G+C含量為51.39%，復(fù)制子類型為IncN。2株菌的質(zhì)粒通過S1-PFGE驗(yàn)證，與全基因組測(cè)序結(jié)果相符(圖1)。

表1ECCHD184和ECCWS199菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn); 1.ECCHD184；2.ECCWS199M.DNA Marker；1.ECCHD184；2.ECCWS199

用ResFinder工具對(duì)2株大腸埃希氏菌進(jìn)行了耐藥基因預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示2株菌均預(yù)測(cè)到了獲得性耐藥基因。ECCHD184的基因組序列中共預(yù)測(cè)到了sul1、sul2、floR、fosA3、blaCTX-M-14、aadA5、aph(4)-la、aac(3)-VI、dfrA17、mph(A)等10個(gè)耐藥基因(表2)，且這些耐藥基因均位于pTB211質(zhì)粒上(圖2)，圖2中“A”為染色體，“B”為質(zhì)粒pTB221，“C”為質(zhì)粒pTB222。ECCWS199的基因組序列中共預(yù)測(cè)到20個(gè)耐藥基因(表3)，其中pTB221質(zhì)粒攜帶有11個(gè)耐藥基因tet(A)、sul2、blaCMY-2、blaOXA-10、dfrA14、mph(A)、floR、qnrVC4、aadA1、aph(3’)-lb、aph(6)-ld；pTB222質(zhì)粒攜帶9個(gè)耐藥基因tet(A)、sul2、sul3、blaTEM-1B、dfrA12、mph(A)、floR、aadA2、aph(3’)-la(圖3)，圖3中“A”為染色體，“B”為質(zhì)粒pTB221，“C”為質(zhì)粒pTB222。另外，在耐藥基因周圍發(fā)現(xiàn)了廣泛的IS序列，說明耐藥基因具有水平轉(zhuǎn)移的潛力。

表2ECCHD184菌株獲得性耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果

毒力因子VirulenceFinder預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，2株大腸埃希氏菌均只含有表達(dá)谷氨酸脫羧酶的毒力因子gad，且均位于各自的染色體上。對(duì)2株菌各自質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移元件預(yù)測(cè)，包括轉(zhuǎn)移區(qū)起點(diǎn)(oriT)，釋放酶(Relaxase)，Ⅳ型分泌系統(tǒng)基因(T4SS)和Ⅳ型偶聯(lián)蛋白(T4CP)。結(jié)果顯示，大腸埃希氏菌ECCHD184的質(zhì)粒pTB211僅含有oriT位點(diǎn)，缺乏釋放酶、T4SS和T4CP；質(zhì)粒pTB212僅含有T4CP。大腸埃希氏菌ECCWS199的質(zhì)粒pTB221含有釋放酶、T4SS和T4CP，無oriT位點(diǎn)；質(zhì)粒pTB222含有oriT位點(diǎn)和釋放酶，無T4SS和T4CP。

表3ECCWS199菌株獲得性耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 2株菌在不同抗菌藥物下的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，氨芐西林、慶大霉素和恩諾沙星對(duì)ECCHD184的MIC分別為>512、16、16 μg/mL。隨后測(cè)試了這3種抗菌藥物在128、4、4 μg/mL濃度下對(duì)ECCHD184生長(zhǎng)曲線的影響，探討菌株在多個(gè)抗菌藥物條件下的生存壓力(圖4A)。3種抗菌藥物均降低了菌體生長(zhǎng)密度，影響了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)3種抗菌藥物同時(shí)存在時(shí)，菌株ECCHD184仍能生長(zhǎng)且達(dá)到較高的菌體密度。菌株ECCWS199對(duì)氨芐西林、四環(huán)素和恩諾沙星的MIC分別為512、128、4 μg/mL，將3種抗菌藥物設(shè)置在128、32、1 μg/mL濃度下探究對(duì)ECCWS199生長(zhǎng)曲線的影響(圖4B)。發(fā)現(xiàn)氨芐西林和恩諾沙星對(duì)菌株的生長(zhǎng)幾乎沒有影響，而ECCWS199對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)的較為敏感，當(dāng)3種抗菌藥物同時(shí)存在時(shí)也大大延長(zhǎng)了菌株ECCWS199的遲滯期。對(duì)比2株菌發(fā)現(xiàn)在相同濃度氨芐西林作用下，ECCHD184的生長(zhǎng)活力比ECCWS199更強(qiáng)。

3 討論

本研究從雞糞便分離出的大腸埃希氏菌中篩選出2株多重耐藥菌株ECCHD184和ECCWS199，分別對(duì)藥敏試驗(yàn)的10種和11種不同抗菌藥物具有耐藥性。通過全基因組完成圖分析，2株菌所有的耐藥表型均可通過預(yù)測(cè)到的相應(yīng)的獲得性耐藥基因解釋，同時(shí)發(fā)現(xiàn)部分耐藥表型同時(shí)包含多個(gè)耐藥基因，如2株菌都含有多個(gè)磺胺類和氨基糖苷類耐藥基因。另外，在藥敏試驗(yàn)中，由于條件限制沒有對(duì)所有抗菌藥物進(jìn)行耐藥檢測(cè)，但是ECCHD184中預(yù)測(cè)到了磷霉素類耐藥基因fosA3，甲氧芐啶耐藥基因dfrA17和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mph(A)；ECCWS199中還預(yù)測(cè)到了甲氧芐啶耐藥基因dfrA14和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mph(A)，這表明2株多重耐藥大腸埃希氏菌的耐藥譜范圍更廣。

圖2菌株ECCHD184全基因組圈圖

圖3菌株ECCWS199全基因組圈圖

A.ECCHD184;B.ECCWS199圖4菌株的生長(zhǎng)曲線

本試驗(yàn)所用的全基因組測(cè)序技術(shù)可獲得基因組完成圖，預(yù)測(cè)了耐藥基因、毒力因子和轉(zhuǎn)移元件，是研究細(xì)菌耐藥性的重要技術(shù)手段[12]。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2株菌都攜帶有高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因，如blaCTX-M-14、blaOXA-10和blaTEM-1B可使大腸埃希氏菌產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。此外，菌株ECCWS199還攜帶可產(chǎn)生另一種β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因blaCMY-2。這2種酶均可導(dǎo)致大腸埃希氏菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。這表明了這2株多重耐藥的大腸埃希氏菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥問題的嚴(yán)重性。

動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的快速發(fā)展與重要耐藥基因及其可移動(dòng)載體(質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等)的傳播擴(kuò)散密切相關(guān)[13]。intl1(Ⅰ型整合子)不僅可以攜帶耐藥基因還可介導(dǎo)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[14]。intl1可能與磺胺類藥物耐藥基因的傳播擴(kuò)散有關(guān)[15]。雖然2株菌沒有預(yù)測(cè)到完整的水平轉(zhuǎn)移元件，但ECCHD184和ECCWS199所攜帶的質(zhì)粒中均發(fā)現(xiàn)了intl1和多個(gè)轉(zhuǎn)座子(Tn)，說明質(zhì)粒上的耐藥基因具有水平轉(zhuǎn)移的潛力。ECCHD184 和ECCWS199分別攜帶的質(zhì)粒類型IncFIB和IncN、IncA/C2都是在腸桿菌科中較為常見的攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的流行性質(zhì)粒[16]。IncN和IncA/C2型質(zhì)粒也是攜帶mcr-1耐藥基因的主要質(zhì)粒類型之一[17]。

因此，本研究中2株多重耐藥大腸埃希氏菌所攜帶的耐藥基因可能隨著雞糞的排出而在環(huán)境中廣泛傳播，在屠宰環(huán)節(jié)也可能會(huì)污染雞酮體，流入到銷售環(huán)節(jié)，給人類健康和公共衛(wèi)生安全帶來威脅。應(yīng)該警惕多重耐藥大腸埃希氏菌的出現(xiàn)，加強(qiáng)多重耐藥大腸埃希氏菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，掌握其主要耐藥機(jī)制。