羅奇志， 韓 仰， 李 威， 張 帆， 鄔力祥， 黃柏勝△

（中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1免疫學(xué)系，2生理學(xué)系，湖南長沙410008）

腦缺血可導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)退行性疾病甚至死亡，其可通過自由基釋放、線粒體反應(yīng)、神經(jīng)興奮毒性、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和炎癥反應(yīng)等多種機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)損傷[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是神經(jīng)元功能活動(dòng)的重要伙伴，與谷氨酸攝取、水和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)、維持血腦屏障、調(diào)節(jié)腦血流、分泌神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)因子及調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性密切相關(guān)[2-4]。研究顯示，腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性降低、功能受損，從而影響神經(jīng)元的功能活動(dòng)及生存轉(zhuǎn)歸[4-5]。因此，如何減輕腦缺血對星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷對保護(hù)神經(jīng)元具有重要意義。甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白9（methyltransferase-like protein 9，Mettl9）基因定位于大鼠染色體1q36，該基因編碼一種類甲基化轉(zhuǎn)移酶，屬于DREVI轉(zhuǎn)甲基酶基因家族[6]，它在人和小鼠的同源基因?yàn)镸ETTL9/PAP1基因，有關(guān)該基因的研究鮮見報(bào)道。研究報(bào)道，METTL9/PAP1基因在肺癌和小鼠胎肺的發(fā)育過程中呈特異性表達(dá)，且其表達(dá)信號的強(qiáng)弱與凋亡細(xì)胞的強(qiáng)弱成正相關(guān)[7-8]，其在胚胎發(fā)育過程中的作用很可能是通過參與細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的[7]。但Mettl9基因在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用尚未闡明。本研究建立Mettl9基因過表達(dá)的原代培養(yǎng)SD大鼠離體星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，通過氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模擬體內(nèi)腦缺血損傷過程，探討Mettl9基因過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠離體星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響及作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

高糖及無糖DMEM 培養(yǎng)液購自HyClone；胎牛血清及胰蛋白酶購自Gibco；多聚-D-賴氨酸、MTT 及DMSO 購自Sigma；RNA 抽提試劑Trizol 購自Invitrogen；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RT-qPCR 試劑購自TaKaRa；兔抗鼠Mettl9 Ⅰ抗購自Abcam；抗Bcl-2抗體、抗Bax 抗體及抗GAPDH 抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgGⅡ抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)級N2和CO2購自長沙曙光電子廠氣體分公司；慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

2 方法

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 原代SD 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞按照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行體外培養(yǎng)[9]。大致步驟如下，取新生48 h 內(nèi)的SD大鼠，無菌條件下分離大鼠雙側(cè)大腦皮層，以DHank"s 液沖洗3 次，再用吸管反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，經(jīng)直徑200 μm 的不銹鋼網(wǎng)過濾后轉(zhuǎn)移入離心管中，以230 ×g離心5 min。棄上清，加入適量DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，最后以終濃度為10%胎牛血清的DMEM 調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×109/L 接種于預(yù)先用多聚-D-賴氨酸包被過的培養(yǎng)瓶內(nèi)。每2～3 d 換液1次，待細(xì)胞生長融合成單層細(xì)胞后用0.25%胰酶消化傳代，選擇生長狀態(tài)良好的第4 次傳代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 慢病毒重組載體轉(zhuǎn)染 在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，更換新的培養(yǎng)基，分別將病毒滳度為1×109TU/L 的慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9 和相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞，建立正常對照（control，Con）組、空載體轉(zhuǎn)染（negative control，NC）組及慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9轉(zhuǎn)染（Mettl9）組。各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染6 h 后更換含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，分別采用RT-qPCR 及Western blot 檢測轉(zhuǎn)染效率。

2.3 OGD 損傷模型的建立 將缺氧密閉室置于培養(yǎng)箱內(nèi)，N2和CO2通過流量控制閥按照95∶5 比例進(jìn)入氣體混合器，混合氣體以（1.8～2）L/min 的流量進(jìn)入缺氧密閉室。細(xì)胞缺氧前將培養(yǎng)液換成預(yù)先通以混合氣體30 min 的無糖DMEM 培養(yǎng)液，立即置于37℃的缺氧密閉室內(nèi)，繼續(xù)通以混合氣體30 min 后立即封閉，即為缺氧培養(yǎng)模型，并開始計(jì)算OGD 處理時(shí)間，根據(jù)本研究前期工作以缺氧8 h 為OGD 處理時(shí)間。本研究將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為6 組，除上述3組外，另外設(shè)正常對照+OGD 處理（Con+OGD）組，慢病毒空載體轉(zhuǎn)染+OGD 處理（NC+OGD）組和慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9 轉(zhuǎn)染+OGD 處理（Mettl9+OGD）組。

2.4 LDH 漏出率的測定 收集各組細(xì)胞上清液至1.5 mL EP 管中，同時(shí)用PBS 洗滌細(xì)胞，然后加入等體積的0.5%TritonX-100，15 min 后收集細(xì)胞裂解液至另一1.5 mL EP 管中，4℃、900 ×g離心5 min。然后取EP 管中上清，按照LDH 試劑盒說明書操作步驟，用自動(dòng)生化分析儀分別測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞內(nèi)的LDH 活性。LDH 漏出率（%）=上清液LDH 活性/（上清液LDH活性+細(xì)胞內(nèi)LDH活性）×100%。

2.5 MTT 法檢測細(xì)胞活力 在OGD 8 h 后，各組細(xì)胞分別加入5 g/L 的MTT 20 μL（終濃度為0.5 g/L），于37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔加入200 μL DMSO，室溫震蕩20 min，置酶標(biāo)儀于波長570 nm 處測定吸光度（A）值。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，以正常組細(xì)胞活力為100%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力按以下公式計(jì)算：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

2.6 RT-qPCR 在OGD 8 h后，按照Trizol試劑說明書操作提取各組細(xì)胞總RNA，取4 μL RNA 模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RT-qPCR反應(yīng)各引物序列如下：Mett19的上游引物序列為5’-TCTGCTGGATCGCTGTGATC-3’下游引物序列為5’-AGGGATGAAAGGGCAAAACC-3’，產(chǎn)物長度為110 bp；Bcl-2的上游引物序列為5’-GGCATCTGCACACCTGGAT-3’，下游引物序列為5’-ATCAAACAGAGGTCGCATGCT-3’，產(chǎn)物長度為86 bp；Bax的上游引物序列為5’-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3’，下游引物序列為5’-TCTCCCCAGCCATCCTCTCT-3’，產(chǎn)物長度的88 bp；GAPDH 的上游引物序列為5’-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3’，下游引物序列為5’-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3’，產(chǎn)物長度為110 bp。反應(yīng)總體系50 μL 包括：5×SYBR Green I PCR Buffer 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板5 μL，ddH2O 33 μL。反應(yīng)條件：95 ℃3 min；然后95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。

2.7 Western blot 在OGD 8 h 后，用0.25%的胰酶消化收集各組細(xì)胞，230×g離心后棄上清；再分別用1 mL PBS重懸細(xì)胞，230×g離心棄上清，細(xì)胞沉淀用于提取蛋白。取一定量總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用含3%牛血清白蛋白的TBST（含0.05%Tween-20 的TBS）室溫封閉1 h，分別用稀釋的兔抗Mettl9，Bcl-2，Bax 和內(nèi)參照GAPDH Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測各蛋白的表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。RT-qPCR 數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算mRNA 表達(dá)的相對比值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率

1.1 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率 RT-qPCR結(jié)果表明，與Con 組比較，NC 組Mettl9的mRNA 表達(dá)無顯著差異，而Mettl9 組Mettl9的mRNA 表達(dá)顯著增高（P＜0.05），見圖1，結(jié)果顯示獲得了Mettl9 過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

Figure 1. The transduction efficiency of lentiviral vector pLenti6.3-Mettl9 in astrocytes was verified by RT-qPCR assay. Mean±SD.n=3. *P＜0.05 vs Con group.圖1 RT-qPCR 檢測慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率

1.2 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染效率 Western blot 結(jié)果表明，與Con 組比較，NC 組Mettl9 的蛋白表達(dá)無顯著差異，而Mettl9 組Mettl9 的蛋白表達(dá)顯著增高，見圖2，從蛋白水平進(jìn)一步證明獲得了Mettl9 過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

Figure 2. The transduction efficiency of lentiviral vector pLenti6.3-Mettl9 in astrocytes was verified by Western blot assay.圖2 Western blot 檢測慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率

2 Mettl9 過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH 漏出率的影響

與Con 組比較，NC 組細(xì)胞LDH 漏出率無顯著差異，而Mettl9 組星形膠質(zhì)細(xì)胞的LDH 漏出率顯著增高（P＜0.05）；與Con+OGD 組比較，NC+OGD 組細(xì)胞LDH 漏出率亦無顯著差異，而Mettl9+OGD 組星形膠質(zhì) 細(xì) 胞 的LDH 漏 出 率 進(jìn) 一 步 增 高（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. Effect of over-expression of Mettl9 gene on LDH leakage rate of astrocytes. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs Con+OGD group.圖3 Mettl9過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH漏出率的影響

3 Mettl9過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

與Con 組比較，NC 組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力無顯著差異，而Mettl9 組星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.05）；與Con+OGD 組比較，NC+OGD 組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力無顯著差異，而Mettl9+OGD 組星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力進(jìn)一步顯著降（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Effect of over-expression of Mettl9 gene on the viability of astrocytes. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs Con+OGD group.圖4 Mettl9過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

4 Mettl9 過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2 和Bax mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與Con 組比較，NC 組Bcl-2和Bax 的表達(dá)均無差異，而Mettl9 過表達(dá)組Bcl-2 的表達(dá)降低（P＜0.05），Bax 的表達(dá)增高（P＜0.05）；對Mettl9 過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)OGD 處理8 h 后，與Con+OGD 組比較，NC+OGD 組Bcl-2 和Bax 的表達(dá)均無顯著差異，而Mettl9+OGD 組Bcl-2 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Bax 的 表 達(dá) 顯 著 增 高（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. Effect of Mettl9 gene over-expression on Bcl-2 and Bax mRNA expression of astrocytes. A：relative mRNA expression of Bcl-2；B：relative mRNA expression of Bax. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs Con+OGD group.圖5 Mettl9 過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2 及Bax mRNA 表達(dá)的影響

5 Mettl9 過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Con組比較，NC組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)均無顯著差異，而Mettl9過表達(dá)組，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白的表達(dá)增高（P＜0.05）；在Mettl9過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)OGD 處理8 h后，與Con+OGD 組比較，NC+OGD 組Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)均無顯著差異，而Mettl9+OGD 組Bcl-2 蛋白的表達(dá)顯著下降、Bax 蛋白的表達(dá)顯著增高（P＜0.05），圖6。

討論

缺血性腦卒中為臨床常見的急重癥，腦缺血可影響各種腦功能區(qū)，涉及復(fù)雜的損傷反應(yīng)，腦缺血損傷時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活影響神經(jīng)元的存活和突觸重塑，因此，研究腦缺血損傷時(shí)如何有效干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活，對神經(jīng)元的生存和轉(zhuǎn)歸具有重要意義。星形膠質(zhì)細(xì)胞是重要的神經(jīng)細(xì)胞，對缺血耐受性較強(qiáng)，該細(xì)胞與突觸信號傳遞、能量代謝、氧化還原穩(wěn)態(tài)平衡、炎癥反應(yīng)及維持腦結(jié)構(gòu)功能等多種功能有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞終足與周圍毛細(xì)血管壁連接，參與血腦屏障維持，在腦缺血損傷中發(fā)揮重要作用[10-11]。腦缺血產(chǎn)生的損傷在本質(zhì)上主要是腦組織氧、糖缺乏而引發(fā)的一系列結(jié)果。OGD 損傷誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]，其機(jī)制可能與細(xì)胞自噬[5，13]、鈣超載、一氧化氮、線粒體功能障礙、轉(zhuǎn)錄信號的激活[14]及微小RNA（microRNA，miRNA）對靶基因的調(diào)控[15]等多種因素有關(guān)。

Figure 6. Effect of Mettl9 gene over-expression on the protein expression of Bcl-2 and Bax of astrocytes. Mean±SD.n=3. *P＜0.05 vs Con group；#P＜0.05 vs Con+OGD group.圖6 Mettl9過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Mettl9基因在人和小鼠的同源基因?yàn)镸ETTL9/PAP1，其在肺癌和小鼠胎肺發(fā)育過程中表達(dá)信號的強(qiáng)弱與凋亡細(xì)胞的強(qiáng)弱呈正相關(guān)，且在胚胎發(fā)育過程中的作用很可能是通過參與細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的[7]。METTL9基因編碼一種類甲基化轉(zhuǎn)移酶，屬于DREVI轉(zhuǎn)甲基酶基因家族，它作為p53的一個(gè)下游基因，與野生型P53蛋白結(jié)合，使DNA 上的多個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生高甲基化，從而導(dǎo)致腫瘤抑制因子等基因失活。由于DNA的S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶，最終導(dǎo)致DNA 甲基化，引起腫瘤的發(fā)生[16]。本研究通過慢病毒重組載體pLenti6.3-Mettl9 轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的SD 大鼠離體星形膠質(zhì)細(xì)胞并進(jìn)行OGD 處理，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞活力及損傷情況。RT-qPCR 及Western blot 結(jié)果顯示，與對照組比較，Mettl9慢病毒重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)組Mettl9 的mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著增高，結(jié)果表明獲得了Mettl9 過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。LDH 漏出率結(jié)果觀察到過表達(dá)Mettl9 組較Con 組的LDH 漏出率增高，而Mettl9+OGD 組較Mettl9 組LDH 漏出率進(jìn)一步增高，結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)的LDH 在外界刺激下分泌到細(xì)胞外，導(dǎo)致LDH 漏出率增加，此時(shí)細(xì)胞損傷加劇。MTT 結(jié)果觀察到Mettl9 過表達(dá)組細(xì)胞活力下降，而Mettl9+OGD 組較Mettl9 組細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Mettl9 促進(jìn)細(xì)胞損傷、活力下降，而OGD加劇細(xì)胞損傷。本研究表明，過表達(dá)Mettl9 增加了星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，而OGD 進(jìn)一步加劇了過表達(dá)Mettl9星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，推測Mettl9參與了OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD 損傷環(huán)境中的時(shí)間延長，其產(chǎn)生損害和活力降低逐漸明顯，除無氧代謝能量的生成效率降低，糖耗增加外[17]，較長時(shí)間的無氧代謝過程中產(chǎn)生的乳酸使細(xì)胞環(huán)境pH 下降，已有研究證實(shí)酸中毒能加重缺氧、缺糖造成的細(xì)胞損傷[18]。

Bcl-2/Bax 是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的分子開關(guān)[19]，細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展與Bcl-2 和Bax 的表達(dá)水平密切相關(guān)，其中Bcl-2 在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮抗凋亡作用，其表達(dá)量的增加抑制細(xì)胞凋亡，而Bax 在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促凋亡作用，其表達(dá)量的增加促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20-23]。基因表達(dá)水平的異?？梢養(yǎng)cl-2 及Bax表達(dá)的改變，本研究在分子水平探討了Mettl9基因過表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的機(jī)制，RT-qPCR 及Western blot 結(jié)果顯示，與Con 組比較，Mettl9 過表達(dá)組Bcl-2 的mRNA 及蛋白表達(dá)均降低，Bax 的mRNA及蛋白表達(dá)均增高；與Con+OGD 比較，Mettl9+OGD組Bcl-2 的mRNA 及蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，Bax 的mRNA 及蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高。從該研究結(jié)果可推測Mettl9 參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，Mettl9 過表達(dá)促進(jìn)OGD 大鼠離體星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能是通過調(diào)控Bcl-2/Bax信號通路的蛋白表達(dá)影響細(xì)胞活力和凋亡等方式實(shí)現(xiàn)的。

本研究采用原代培養(yǎng)的大鼠離體星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過OGD模擬體內(nèi)腦缺血損傷過程，探討了Met-tl9基因過表達(dá)對OGD 大鼠離體星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響及其可能的作用機(jī)制，但尚需從整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。