潘德鋒， 劉劍鋒

（南華大學附屬第二醫(yī)院兒科，湖南衡陽421001）

癲癇是一種慢性神經系統(tǒng)疾病，它影響著各個年齡段的人，并給患者家庭及社會帶來沉重的經濟和精神負擔。據估計，全球有1 050萬兒童患有癲癇病，80%的癲癇病患者生活在中低收入國家[1]。癲癇的病因復雜多樣，包括遺傳代謝因素、免疫異常、外傷、感染和系統(tǒng)性疾病等?？拱d癇藥可抑制癲癇發(fā)作或改善癥狀，而不能影響疾病的病理過程，并且約有30%的患者為難治性癲癇[2]。因而探討癲癇的發(fā)病機制，尋找新的抗癲癇藥物有著重要意義。

Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、炎癥、凋亡以及免疫調節(jié)等許多重要的生物學過程[3]。JAK 通過結合受體感受胞外的信號，如干擾素、白細胞介素和生長因子等，并將信息傳送到STAT。磷酸化的STAT 能夠從胞內轉移到細胞核并結合到啟動子DNA 序列上，引起DNA 轉錄與活性水平發(fā)生改變，進而影響細胞生長、分化及死亡等基本細胞功能[4]。JAK2 和STAT3 主要表達在腦組織，研究表明腦損傷后激活的JAK/STAT 通路促進了小膠質細胞的活化、增殖，在中樞系統(tǒng)疾病中參與了炎癥和凋亡等多種病理過程[5]。目前對JAK2/STAT3 信號通路的研究主要集中在缺氧缺血性腦病，血液腫瘤，免疫功能紊亂和心血管疾病中[6-7]，對于在發(fā)育期癲癇方面國內外很少有報道。

xyloketal B（Xyl-B）是一種新型的海洋天然產物，是結構新穎的苯并吡喃類化合物，最初從中國南海紅樹林內生真菌中分離得到。Xyl-B 被證明具有多種生物醫(yī)學活性，包括抗神經毒性，抗內皮細胞氧化作用，抗神經膠質瘤及動脈粥樣硬化斑塊形成，可用于神經心血管疾病的治療[8-9]。研究證實，Xyl-B可通過抑制TLR4/NF-κB 炎癥信號通路從而減少缺血引起的腦損傷[10]，可以通過防止氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）誘導的內皮氧化損傷，從而治療動脈粥樣硬化[11]。目前Xyl-B 是否在癲癇中有治療作用國內外尚未有報道。由于癲癇后腦損傷與炎癥反應及氧化應激有關，而JAK2/STAT3 信號通路在炎癥及氧化應激反應中扮演著重要的角色，因而我們猜想，Xyl-B 可能通過干預JAK2/STAT3 信號通路并對癲癇后腦損傷有保護作用。

本實驗旨在通過建立發(fā)育期大鼠癲癇模型，觀察癲癇后JAK2/STAT3 信號通路和凋亡相關因子的表達變化、神經元細胞的數(shù)量和小膠質細胞活化情況，探討Xyl-B能夠通過調控JAK2/STAT3信號通路，抑制紅藻氨酸（kainic acid，KA）誘導的發(fā)育期大鼠癲癇，對腦損傷起到保護作用。

材料和方法

1 實驗試劑

KA（Sigma）；Xyl-B（中山大學）；p-JAK2、p-STAT3、TNF-α、IL-1β 和Bax 抗體（Abcam）；caspase-3、Bcl-2 和β-actin 抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫熒光NeuN 和Iba-1 抗體（Sigma）；BCA 蛋白定量試劑盒、PVDF 膜和ECL 化學發(fā)光劑（上海碧云天公司）；cDNA 逆轉錄及RT-qPCR 試劑盒（Promega）；Trizol 試劑（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司）；蘇木素-伊紅染色液（浙江康泰生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠驚厥模型的建立及分組 40 只20 日齡健康SPF 級SD 雄性大鼠，體重60～80 g[南華大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2020-0002]，隨機分為4 組，即對照（control）組、KA 組、KA+Xyl-B（10 mg/kg）組及KA+Xyl-B（20 mg/kg）組，每組10只。通過腹腔注射KA（15 mg/kg）制作大鼠癲癇模型。參考Racine 分級標準[12]：0 級，無驚厥；Ⅰ級，呆立不動、眨眼，嘴和面部表現(xiàn)為抽動、咀嚼樣動作；Ⅱ級，節(jié)律性點頭，前肢和/或尾伸展；Ⅲ級：前肢陣攣，后退，刻板運動；Ⅳ級，前肢陣攣、抽搐伴后肢站立；Ⅴ級，四肢抽動、反復跌倒、全身陣攣。出現(xiàn)Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作為造模成功。參考Pan 等[10]相關研究，KA 誘導癲癇前30 min 腹腔注射Xyl-B 干預治療。control 組僅注射生理鹽水。造模時有2只未出現(xiàn)驚厥發(fā)作，2只出現(xiàn)驚厥持續(xù)狀態(tài)而導致死亡，造模成功率為90%。最終每組選取8 只大鼠用于后續(xù)實驗，大鼠癲癇后24 h斷頭取腦，收集海馬組織。

2.2 免疫熒光觀察神經元數(shù)量和活化的小膠質細胞 將大鼠用異氟烷麻醉，固定頭和四肢，暴露心臟，灌流針插入左心尖，右心耳剪個小口，先予生理鹽水后予4%多聚甲醛灌流，直至肝臟變白，取出腦組織于4%多聚甲醛中浸泡24 h，后置于30%蔗糖溶液脫水，予OCT 包埋劑，在冰凍切片機上切成5 μm厚度組織片。組織片置于0.5%Triton X-100 室溫通透20 min；用含5%山羊血清室溫封閉切片1 h 以消除非特異性染色；分別加入NeuN 抗體和Iba-1 抗體（兔抗大鼠1∶250），4℃孵育過夜。將組織片用PBS洗3 次，加入熒光標記的Ⅱ抗（1∶200），37℃避光孵育2 h，PBS 洗3 次后進行封片，通過熒光顯微鏡觀察結果。鏡下對每張切片隨機選取5 個面積相同的高倍視野（×400 倍），計數(shù)每個視野NeuN 或Iba-1 染色陽性細胞數(shù)，取平均值即為成熟神經元細胞數(shù)或活化的小膠質細胞。

2.3 Western blot 檢測p-JAK2、p-STAT3、TNF-α、IL-1β、caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白水平 大鼠癲癇后24 h 斷頭取腦，分離海馬組織，用玻璃棒充分勻漿。加入RIPA 裂解液與PMSF 蛋白酶抑制劑，再次勻漿直到組織充分破碎。4℃、8 000×g離心10 min，離心的上清液即是總蛋白。取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。按說明書配制分離膠和濃縮膠并放至電泳槽內。樣品與5×Loading Buffer 按體積4∶1 混合，98℃煮沸5 min；上樣時蛋白總量保持一致。向電泳槽中先加入電泳液，恒壓電泳，蛋白從濃縮膠移動到分離膠；電泳結束后取出電泳架，切去多余的分離膠及濃縮膠；在轉膜槽中加入轉膜液，將蛋白轉移到PVDF膜；轉膜結束后用PBS浸泡PVDF膜，后用5%脫脂牛奶封閉，室溫下水平搖床封閉2 h；棄去封閉液，分別加入Ⅰ抗[兔抗大鼠p-JAK2（1∶5 000）、兔抗大鼠p-STAT3（1∶3 000）、兔抗大鼠TNF-α（1∶1 000）、小鼠抗大鼠IL-1β（1∶1 000）、兔抗大鼠caspase-3（1∶1 000）、兔抗大鼠Bax（1∶1 000）和兔抗大鼠Bcl-2（1∶1 000）抗體]，4℃孵育過夜；用PBST洗膜3次；敷Ⅱ抗：辣根過氧化物酶標記的小鼠或兔Ⅱ抗（1∶5 000）在室溫下孵2 h，再次用PBST 清洗3 次；將ECL 發(fā)光劑中A 液和B 液按1∶1 等體積混合后滴加至PVDF 膜；用ImageQuant?LAS 4000 顯影儀掃描條帶；用ImageJ軟件分析蛋白條帶光密度。

2.4 RT-qPCR 檢 測JAK2、STAT3、TNF-α、IL-1β、caspase-3、Bax 和Bcl-2 mRNA 表達量 取分離的大腦海馬組織，加入Trizol 裂解液和氯仿，樣本分離為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。將水相上層RNA 轉移到無RNA 酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀RNA。每1 mL Trizol 試劑裂解的樣品中加入1 mL 的75%乙醇，清洗RNA 沉淀。離心后吸去乙醇溶液，使RNA 沉淀在室溫中干燥后得到總RNA。用無RNA 酶的水溶解RNA，紫外吸收法測定RNA 濃度和純度。按照cDNA 合成試劑盒（Thermo Scientific）的說明，加入樣本RNA、逆轉錄酶、上游引物和下游引物合成模板cDNA。按照RTqPCR 試劑盒的要求，加入cDNA、上游引物和下游引物在PCR 儀上進行DNA 擴增。RT-qPCR 循環(huán)擴增條件如下：變性95℃，45 s；退火56℃，45 s；延伸72℃，1 min；30 個循環(huán)，循環(huán)結束后4℃冷卻。所用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 免疫熒光觀察神經元數(shù)量和活化的小膠質細胞

發(fā)育期大鼠癲癇后24 h，免疫熒光觀察海馬CA1 區(qū)成熟神經元數(shù)量和活化的小膠質細胞。結果顯示，control 組可見較多的成熟神經元（NeuN 陽性細胞；圖1A）和少許活化小膠質細胞（Iba-1 陽性細胞；圖2A）；KA組神經元數(shù)量顯著減少（P＜0.05），活化的小膠質細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05），胞體肥大，突起增粗或融合，見圖1B 和圖2B；與KA 組比較，KA+Xyl-B（10 mg/kg）組神經元數(shù)量增多（P＜0.05），活化小膠質細胞數(shù)量減少，見圖1C和圖2C；與KA組比較，KA+Xyl-B（20 mg/kg）組神經元數(shù)量顯著增多（P＜0.05），而活化小膠質細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），細胞胞體瘦小，突起纖細，分布稀疏，見圖1D和圖2D。

Figure 1. Mature neurons were observed by immunofluorescence for NeuN. The red arrows indicate NeuN positive cells. Scale bar =100 μm. A：control group；B：KA group；C：KA+Xyl-B（10 mg/kg）group；D：KA+Xyl-B（20 mg/kg）group. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs KA group；△P＜0.05 vs KA+Xyl-B（10 mg/kg）group.圖1 免疫熒光觀察成熟的神經元

Figure 2. Activated microglia were observed by immunofluorescence for Iba-1. The blue arrows indicate Iba-1 positive cells，and the area marked by the yellow arrows is a partially enlarged image. Scale bar=100 μm. A：control group；B：KA group；C：KA+Xyl-B（10 mg/kg）group；D：KA+Xyl-B（20 mg/kg）group. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs KA group；△P＜0.05 vs KA+Xyl-B（10 mg/kg）group.圖2 免疫熒光觀察活化的小膠質細胞

2 Xyl-B 減少p-JAK2、p-STAT3、TNF-α 和IL-1β蛋白水平

為了探討Xyl-B 對JAK2/STAT3 信號通路的影響，我們采用Western blot 測定了大鼠癲癇后24 h 大腦海馬p-JAK2、p-STAT3、TNF-α和IL-1β蛋白表達水平。結果如下：（1）癲癇后KA 組p-JAK2、p-STAT3、TNF-α 和IL-1β 蛋白水平較對照組顯著升高（P＜0.05）；（2）Xyl-B 干預組能抑制KA 誘導的蛋白表達增 加，其 中KA+Xyl-B（20 mg/kg）組p-JAK2、p-STAT3、TNF-α 和IL-1β 蛋白水平顯著低于KA 組（p＜0.05）；（3）進一步比較顯示，KA+Xyl-B（20 mg/kg）組p-STAT3、TNF-α 和IL-1β 蛋白顯著低于KA+Xyl-B（10 mg/kg）組（P＜0.05），見圖3。

3 Xyl-B 減少JAK2、STAT3、TNF-α 和IL-1β 的mRNA表達量

為了進一步探討Xyl-B 對JAK2/STAT3信號通路的影響，我們采用RT-qPCR 測定了發(fā)育期大鼠癲癇后24 h 海馬JAK2、STAT3、TNF-α 和IL-1β 的mRNA表達水平。結果如下：（1）癲癇后KA 組JAK2、STAT3、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達較對照組顯著增高（P＜0.05）；（2）Xyl-B 干預治療能抑制KA 誘導的mRNA 表達增加，其中KA+Xyl-B（10 mg/kg）組JAK2和IL-1β 顯著低于KA 組，而KA+Xyl-B（20 mg/kg）組JAK2、STAT3、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達均顯著低于KA 組（P＜0.05）；（3）進一步比較顯示，KA+Xyl-B（20 mg/kg）組STAT3 和TNF-α mRNA 表達顯著低于KA+Xyl-B（10 mg/kg）組（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The mRNA expression of JAK2，STAT3，TNF-α and IL-1β in the hippocampus after epilepsy was detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs KA group；△P＜0.05 vs KA+Xyl-B（10 mg/kg）group.圖4 RT-qPCR檢測癲癇后海馬區(qū)JAK2、STAT3、TNF-α和IL-1β的mRNA表達量

4 Xyl-B對caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

為了探討Xyl-B 對細胞凋亡相關蛋白的影響，我們采用Western blot 測定了caspase-3、Bax 和Bcl2 蛋白表達水平。結果如下：（1）癲癇后KA 組caspase-3和Bax 蛋白表達顯著增加（P＜0.05），而Xyl-B（10 mg/kg 或20 mg/kg）干預能顯著抑制蛋白的增加（P＜0.05）；（2）癲癇后KA 組Bcl-2 蛋白表達顯著減少（P＜0.05），而Xyl-B（10 mg/kg 或20 mg/kg）干預能顯著增加Bcl-2 蛋白的表達（P＜0.05）；（3）KA+Xyl-B（20 mg/kg）組caspase-3 蛋白表達顯著低于KA+Xyl-B（10 mg/kg）組（P＜0.05），見圖5。

5 Xyl-B 對caspase-3、Bax 和Bcl2 mRNA 表 達 的影響

為了進一步探討Xyl-B 對細胞凋亡相關蛋白的影響，我們采用RT-qPCR 測定了caspase-3、Bax 和Bcl-2 的mRNA 表達水平。結果如下：（1）與control組比較，癲癇后KA 組caspase-3 和Bax mRNA 表達顯著增加（P＜0.05）；（2）與KA 組比較，Xyl-B（10 mg/kg）干預組Bax 表達顯著降低（P＜0.05），而Xyl-B（20 mg/kg）干預組caspase-3、Bax 和Bcl2 表達均顯著降低（P＜0.05）；（3）進一步比較顯示，KA+Xyl-B（20 mg/kg）組caspase-3 和Bax mRNA 表達顯著低于KA+Xyl-B（10 mg/kg）組（P＜0.05），見圖6。

討論

癲癇是常見的神經系統(tǒng)疾病，具有突發(fā)性、反復發(fā)作和暫時性腦功能紊亂等特征。目前癲癇的發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)有的抗癲癇藥物主要通過調節(jié)神經遞質受體（如谷氨酸、γ-氨基丁酸和乙酰膽堿受體）或離子通道從而抑制神經元興奮性[13-14]，而不能從癲癇的發(fā)病機制去治愈該病。在本實驗中，我們選擇了KA 誘導大鼠癲癇模型，因為該模型類似于人類顳葉癲癇模型，重復性好，且該模型與小膠質細胞的活化和炎癥通路的激活有關[15]，因而其病理過程及干預治療對臨床有指導作用。

Figure 5. The protein expression levels of caspase-3，Bax and Bcl-2 in the hippocampus after epilepsy were detected by Western blot. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs KA group；△P＜0.05 vs KA+Xyl-B（10 mg/kg）group.圖5 Western blot檢測癲癇后海馬區(qū)caspase-3、Bax和Bcl2蛋白表達量

Figure 6. The mRNA expression of caspase-3，Bax and Bcl-2 in the hippocampus after epilepsy was detected by RTqPCR. Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs KA group；△P＜0.05 vs KA+Xyl-B（10 mg/kg）group.圖6 RT-qPCR 檢測癲癇后海馬區(qū)caspase-3、Bax 和Bcl-2的mRNA表達量

小膠質細胞占神經膠質細胞總數(shù)的5%～20%，是中樞神經系統(tǒng)中免疫應答的關鍵調節(jié)因子。在正常情況下，小膠質細胞處于靜止狀態(tài)，受到異常刺激時可被激活，迅速增殖并遷移到受傷的部位，介導神經炎癥以及誘導神經元凋亡[16]。因此，抑制小膠質細胞的激活和增殖可能是減輕癲癇后損傷的有效措施。在本實驗中，我們用KA 誘導大鼠癲癇模型，免疫熒光結果顯示癲癇后活化的小膠質細胞數(shù)量明顯增多，而成熟的神經元細胞明顯減少，證實了小膠質細胞的活化參與了癲癇的病理過程。具體機制考慮激活后的小膠質細胞可以分泌大量的炎癥因子和神經毒性化合物，包括一氧化氮、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），會導致細胞毒性作用，破壞神經細胞和血腦屏障，引起中樞神經系統(tǒng)的局部或廣泛損傷[17]。有研究顯示，TNF-α轉基因小鼠會出現(xiàn)嚴重的神經炎癥并表現(xiàn)出神經退行性疾病癥狀[18]，同時炎癥因子的產生可以進一步激活小膠質細胞，促進中樞神經系統(tǒng)疾病的病理過程，可引起癲癇發(fā)作并加重癲癇后腦損傷[19]。

JAK2/STAT3 是一條重要的炎癥反應相關通路，該通路的激活可進入細胞核內啟動基因轉錄，調控炎性反應和凋亡因子表達。JAK2 是非受體型酪氨酸蛋白激酶家族的一種，STAT3 是一種脫核苷酸結合蛋白，是JAK2 的底物和下游因子[20]。JAK2 和STAT3 廣泛分布在整個中樞神經系統(tǒng)，可以被許多細胞因子和生長因子（如白細胞介素、集落刺激因子、生長激素等）所激活，活化后的JAK2 可激活STAT3，通過各種靶蛋白的酪氨酸殘基使膜外刺激信號傳導入細胞內，導致JAK2 和STAT3 磷酸化，p-STAT3 二聚化并轉移到細胞核中，可結合特異性啟動子序列并調控基因的轉錄[21]。本研究Western blot和RT-qPCR結果顯示，癲癇后JAK2/STAT3信號通路及凋亡蛋白caspase-3 和Bax 表達顯著增高，說明JAK2/STAT3 信號通路參與癲癇的病理過程。具體機制考慮如下：（1）JAK2/STAT3 信號激活可促進下游炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的表達，同時TNF-α 和IL-1β 的高表達可結合它的受體，反過來進一步激活JAK2 和STAT3 并導致其磷酸化，p-JAK2 和p-STAT3與DNA 的結合增加了細胞因子基因的表達并產生更多的細胞因子，這種惡性循環(huán)可以導致難以控制的持續(xù)炎癥[22]。（2）JAK2/STAT3 調控的下游信號也包括細胞凋亡靶點caspase-3、Bax 和Bcl-2 家族蛋白，因而JAK2/STAT3 的激活可以導致神經元的凋亡，減少神經元數(shù)量，并加重腦損傷的病理過程[23]。（3）JAK2/STAT3 信號通路可介導小膠質細胞活化，而活化的小膠質細胞可分泌TNF-α 和IL-1β，導致神經炎癥及癲癇后腦損傷。Yang 等[24]的研究表明，在新生鼠的缺氧缺血性腦病中，JAK2/STAT3 信號通路可通過增加IL-1β 的表達從而導致腦損傷和行為異常；Liu 等[25]的研究表明，抑制JAK2/STAT3 信號通路可以減少驚厥性腦損傷。這些研究結果與本研究保持一致。

Xyl-B 是從中國南海紅樹林真菌Xylariasp. 中分離的天然化合物，具有抗氧化、保護血管內皮、抗炎和抗凋亡能力，如抑制NADPH 氧化酶、上調血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、抑制L 型鈣離子通道、增加Bcl-1/Bax比值、下調TLR4受體等[26]。目前，對Xyl-B 的研究主要集中在缺血性腦卒中、動脈粥樣硬化、新生兒缺氧缺血性腦病等，國內外還沒有關于癲癇方面的報道。在本實驗中，觀察到癲癇后KA 組活化的小膠質細胞顯著增多，而神經元數(shù)量顯著減少；JAK2/STAT3炎癥通路、凋亡蛋白caspase-3 和Bax 表達顯著增多，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著減少；而Xyl-B 能逆轉這些病理過程，從而對癲癇后腦損傷起到保護作用。具體作用機制考慮如下：（1）Xyl-B 通過抑制JAK2/STAT3 信號通路來降低炎癥因子表達和小膠質細胞的活化；在大鼠缺血模型中，注入了JAK2 磷酸化抑制劑AG490，減少了梗死面積及細胞凋亡細胞，并改善了神經功能[27]，這表明阻斷JAK2 和下游STAT3 的磷酸化作用具有神經保護作用，與本文的研究一致。（2）通過增加抗凋亡蛋白的合成來抑制線粒體損傷和凋亡程序的啟動，從而增加存活神經元的數(shù)量[28]。（3）通過抗氧化應激通路徑提高抗氧化蛋白酶的表達；Zhou 等[29]的研究表明，Xyl-B 可以通過多種途徑抑制活性氧ROS 和活性氮RNS的生成，抑制NADPH 氧化酶和內源性抗氧化劑，從而減少癲癇所致的氧化損傷過程。（4）還有報道指出，Xyl-B可以在發(fā)作期間阻斷過多的鈣離子內流，從而減少癲癇的發(fā)作。由于實驗的局限性，沒有對鈣離子通道的作用進行研究。同時從本研究實驗結果顯示，Xyl-B 在劑量為20 mg/kg 時比10 mg/kg治療效果更好，說明Xyl-B減輕癲癇后腦損傷的作用可能有劑量依賴性。

總之，Xyl-B 能抑制大鼠癲癇后JAK2/STAT3 炎癥通路的激活，抑制小膠質細胞活化和凋亡蛋白的表達，增加抗凋亡蛋白和存活的神經元。本研究揭示了Xyl-B 能抑制KA 誘導的發(fā)育期大鼠癲癇，減輕癲癇后腦損傷，也為臨床上新的抗癲癇藥物的開發(fā)提供了參考資料。