王楚彪, 李敖彬, 潘松海, 盧萬鴻, 林彥, 羅建中*

7種桉樹花粉微觀形態(tài)及其親緣關(guān)系分析

王楚彪1,2, 李敖彬3, 潘松海4, 盧萬鴻1, 林彥1, 羅建中1*

(1. 國家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心, 廣東 湛江 524022; 2. 南京林業(yè)大學(xué), 南京 210037; 3. 中國林業(yè)集團有限公司, 北京 100026; 4. 中林集團雷州林業(yè)局有限公司, 廣東 湛江 524043)

為了解我國常用桉樹樹種的親緣關(guān)系，利用掃描電鏡觀察7種桉屬()樹種的花粉形態(tài)。結(jié)果表明，粗皮桉()、窿緣桉()的7個花粉性狀大多處于前2位，其中粗皮桉花粉的赤道面長、寬和面積最大，分別為17.522、17.090m和300.830m2，而窿緣桉花粉的萌發(fā)溝長、寬和大小最大，分別為6.576、0.720m和4.718m2；赤桉()花粉的赤道面最小，韋塔桉()花粉的萌發(fā)溝最小。聚類分析表明，在信息保留87.5%時，7樹種可以分為3組, 粗皮桉和窿緣桉聚在一組，韋塔桉和巨桉()聚在一組，其余聚在一組。粗皮桉、窿緣桉的花粉外壁紋飾較光滑，細(xì)葉桉()和赤桉屬常規(guī)，尾葉桉()、韋塔桉和巨桉較粗糙。從花粉形態(tài)分析，粗皮桉和窿緣桉的親緣關(guān)系較近，韋塔桉、尾葉桉的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，細(xì)葉桉、赤桉和巨桉的親緣關(guān)系與傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。因此，7種桉樹花粉形態(tài)反映了一些新的親緣關(guān)系，對桉樹的雜交育種有指導(dǎo)意義。

桉樹; 花粉；掃描電鏡；親緣關(guān)系；形態(tài)

花粉是單細(xì)胞雄配子體，主要執(zhí)行繁殖任務(wù),花粉由孢粉蛋白組成[1–2]?；ǚ圩鳛橹参锏纳硢挝?，其外形、大小及萌發(fā)孔溝特征以及外壁紋飾等都反映了植物的進化特征，因而孢粉形態(tài)研究較早應(yīng)用于植物分類和系統(tǒng)演化研究中，是植物分類學(xué)的一個重要研究方法[3–5]。

研究植物種間親緣關(guān)系需要通過各種表型特征或基因差異進行綜合考慮，而花粉形態(tài)是其中一個重要參考因素。花粉形態(tài)特征有助于了解植物品種、種源間的譜系，并確定其在不同分類群中的地位[6–7]。從花粉形態(tài)分析親緣關(guān)系具有獨特優(yōu)勢, 花粉形態(tài)受外界環(huán)境影響很小，具有較強的遺傳保守性和穩(wěn)定性[8–9]，植物代際間的花粉形態(tài)基本不變，所以花粉形態(tài)特征是辨別植物品種的主要依據(jù)之一[10–11]，可見通過分析對比花粉形態(tài)鑒定種間親緣關(guān)系具有可行性。被子植物花粉的大小為4.5~200m[12]，由于形態(tài)較小，必須在顯微鏡下觀察研究[13]。

桉樹隸屬于桉屬()、杯果木屬()和傘房屬()，大多數(shù)種類自然分布于澳大利亞，是我國南方重要的造林樹種，為造紙和生產(chǎn)人造板的主要原料。但目前國內(nèi)外對桉樹花粉形態(tài)的研究較少，本研究對我國應(yīng)用較廣的7種桉屬樹種的花粉形態(tài)進行觀察測量，并對其親緣關(guān)系進行綜合分析，探討這7種桉樹的親緣關(guān)系與其花粉形態(tài)關(guān)系是否具有一致性，以期更深入地了解這7種桉樹的親緣關(guān)系并為進一步的雜交育種等提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

研究對象為7種國內(nèi)常見的桉屬()樹種(表1)，每樹種采集3個種源單株花粉，共采集21個種源的單株花粉。其中窿緣桉()花粉采自云南昆明?？诹謭鲨駱浞N質(zhì)資源試驗林，巨桉()花粉采自廣東廣寧縣桉樹種質(zhì)資源試驗林，其他樹種花粉均采自廣東遂溪縣南方國家級林木種苗示范基地?；ǚ鄄杉笥霉枘z干燥、過篩、密封，儲存在-24℃冰箱中備用。

表1 試驗材料

1.2 方法

花粉用4%戊二醛固定液固定，之后用0.3 mol/L磷酸緩沖液(PBS)清洗3次，每次20 min；用1%鋨酸(Os04)固定4 h，0.1 mol/L PBS清洗3次, 每次20 min；依次用30%、50%、70%和90%乙醇脫水，每次15 min，再用100%乙醇脫水3次，每次15 min；使用界點干燥儀干燥；花粉黏臺，用離子濺射儀噴金，在蔡司EVO MA15掃描電鏡(SEM, 德國)下觀察[14–17]，SEM工作電壓5.0 kV。

每個種源隨機選擇20顆花粉粒分別在7k倍和15k倍下觀察整體和局部形態(tài)并測量。參照國際慣用做法[18]，測量花粉赤道面長、赤道面寬，萌發(fā)溝的長度、寬度和深度，花粉形態(tài)描述參照《孢粉學(xué)手冊》[19]。赤道面面積為赤道面長×赤道面寬，萌發(fā)溝大小為萌發(fā)溝的長度×寬度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，采用STATISTICA 8.0和SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 花粉性狀

桉樹花粉的赤道面接近正三角形。從表2可見，粗皮桉花粉的赤道面長、寬都最大，赤道面面積也最大；窿緣桉的次之, 赤桉的最小, 尾葉桉的較小。多重分析表明，粗皮桉和窿緣桉的赤道面長差異不顯著，但與其他樹種的差異極顯著。赤道面寬尾葉桉、韋塔桉、細(xì)葉桉差異沒有達到極顯著。粗皮桉和窿緣桉的赤道面面積和其他樹種比較都達到差異極顯著，說明這2種桉樹花粉的赤道面積與其他樹種有明顯不同。

窿緣桉花粉萌發(fā)溝的長、寬最大，粗皮桉的次之；韋塔桉花粉萌發(fā)溝寬度最小，萌發(fā)溝長度較小，其萌發(fā)溝最??；巨桉花粉的萌發(fā)溝長度最小。多重分析表明，窿緣桉和粗皮桉的萌發(fā)溝寬度差異不顯著，但與其他樹種差異極顯著。萌發(fā)溝長方面窿緣桉自成一組，與其他樹種差異極顯著。各樹種的萌發(fā)溝深差異達不到極顯著水平。

從表2可知，粗皮桉、窿緣桉花粉性狀相近,粗皮桉花粉的赤道面長、寬的變異系數(shù)較小，說明粗皮桉花粉大小變化不大；韋塔桉、細(xì)葉桉花粉的赤道面長的變異系數(shù)也較小；赤桉花粉的赤道面長、寬的變異系數(shù)較大，說明赤桉花粉大小不一。窿緣桉花粉的萌發(fā)溝長、寬的變異系數(shù)較小，說明萌發(fā)溝長、寬變化不大；巨桉花粉萌發(fā)溝長、寬的變異系數(shù)數(shù)據(jù)也較小；韋塔桉花粉萌發(fā)溝長的變異系數(shù)數(shù)據(jù)較小，但萌發(fā)溝寬的變異系數(shù)較大，說明其萌發(fā)溝形態(tài)差異較大。

表2 7種桉樹花粉性狀

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異極顯著(<0.01)。

Data followed different letters indicate significant differences at 0.01 level.

2.2 聚類分析

基于花粉的赤道面長、寬和萌發(fā)溝長、寬、深，采用Sorensen方法進行聚類分析(圖1)，若信息保留75%，7種樹種的花粉可以分為2組, 其中粗皮桉、窿緣桉聚為一組，其余樹種聚在一組, 說明粗皮桉、窿緣桉的花粉與其余樹種有明顯差異。若信息保留87.5%，7種樹種可分為3組, 粗皮桉、窿緣桉聚在一組，韋塔桉、巨桉聚在一組，其余樹種聚在一組，且韋塔桉和巨桉的花粉性狀相似。若信息保留接近100%，尾葉桉和細(xì)葉桉仍聚在一組，說明這2樹種的花粉性狀差異非常小。

2.3 花粉外壁紋飾的比較

按照埃爾特曼[19]的孢粉NPC系統(tǒng)分類，7種的花粉都屬于N3P4C5型(圖2)，這也是桃金娘科(Myrtaceae)植物花粉較典型的形態(tài)類型。

圖1 基于花粉形態(tài)的7種桉樹聚類分析

桃金娘科花粉外壁紋飾有8種類型[18]，本研究的7種樹種花粉外壁紋飾可分為3類。粗皮桉與窿緣桉花粉外壁紋飾相似，比較光滑，同時花粉整體比較飽滿，形態(tài)性狀也比較接近，體積較大。細(xì)葉桉和赤桉的花粉外壁紋飾是桃金娘科常見的皺波狀，介于粗糙和光滑之間。尾葉桉、韋塔桉和巨桉的花粉外壁紋飾比較粗糙，尾葉桉的非常粗糙。

從筆者以往桉樹種間雜交的實踐結(jié)果看，這7種樹種的外壁紋飾類型與他們之間的雜交成功率有一定關(guān)聯(lián)。細(xì)葉桉和赤桉的雜交成功率較高，尾葉桉、韋塔桉和巨桉間的雜交也較容易，粗皮桉與窿緣桉間的雜交研究報道較少，但是粗皮桉花粉外壁紋飾與其他種的不同，作為母本與細(xì)葉桉、尾葉桉、巨桉等的雜交成功率不高，這說明花粉外壁紋飾與親緣關(guān)系有一定的關(guān)系。而且除粗皮桉、窿緣桉外，其余樹種的親緣關(guān)系都與桉樹分類系統(tǒng)吻合，進一步說明通過花粉外壁紋飾分析桉樹種間親緣關(guān)系是可行的，但親緣關(guān)系分析不能只考慮外壁紋飾類型。

窿緣桉的萌發(fā)溝比較寬，其次是粗皮桉，兩者相近，而韋塔桉萌發(fā)溝狹窄，這與花粉外壁紋飾的分類結(jié)果相同。大部分樹種的花粉萌發(fā)孔有突起, 只有赤桉的突起不明顯(圖2)。

3 結(jié)論和討論

3.1 粗皮桉和窿緣桉的親緣關(guān)系

植物分類方法有很多種，如形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、化學(xué)和分子標(biāo)記等分類法[20], 隨著研究手段的發(fā)展，對某物種的分類研究也不斷有新的數(shù)據(jù)補充，對植物的科學(xué)分類通常采用多種方法。

本研究的7種樹種在桉樹分類系統(tǒng)中都屬于桉屬雙蒴蓋亞屬(subgen.)，粗皮桉、尾葉桉、韋塔桉和巨桉屬于橫脈組(sect. Transver- saria), 而細(xì)葉桉、赤桉、窿緣桉屬于窿緣組(sect. Exsertaria)[21]，韋塔桉是從尾葉桉分出來的種，傳統(tǒng)上認(rèn)為兩者的親緣關(guān)系較近；細(xì)葉桉、赤桉表型特征比較接近，也認(rèn)為親緣關(guān)系較近。

粗皮桉和窿緣桉處于不同的組，理論上可雜交，親緣關(guān)系不遠(yuǎn)不近。本研究結(jié)果表明，他們的花粉均比較大，形態(tài)性狀也相近，在聚類分析中也聚在一組，且花粉外壁紋飾也類似，均較光滑，說明兩者花粉的相似性，值得一提的是，很多學(xué)者認(rèn)為在花粉的比較研究中，外壁紋飾比體積大小更可靠[22–25]。生物地理學(xué)分析表明，兩者的自然分布有重疊，在澳大利亞昆士蘭州都有分布，且都喜熱[26]。表型上看，兩者樹皮都有條狀縱裂，但葉子形態(tài)差異明顯。因此，兩者的親緣關(guān)系應(yīng)該比現(xiàn)在公認(rèn)要更親近，兩者在葉片形態(tài)上的明顯差異，可能是其分在不同組的原因[27]。本研究對兩者親緣關(guān)系的補充，在桉樹育種研究中有一定的指導(dǎo)意義，后續(xù)可以嘗試兩者的雜交育種。

3.2 其他5種桉樹的親緣關(guān)系

細(xì)葉桉、赤桉的花粉外壁紋飾比較接近，屬于桃金娘科常規(guī)類型[18]，且都屬于窿緣組，比較耐干旱、貧瘠，在澳大利亞自然分布較廣，葉形相似,雜交成功率較高，這體現(xiàn)了他們的親緣關(guān)系較近,與傳統(tǒng)分類基本吻合。但在花粉形態(tài)性狀上卻有差異，赤桉花粉較小，因此不能以單個性狀來判定種間的親緣關(guān)系。

尾葉桉、韋塔桉、巨桉的花粉外壁紋飾都屬于粗糙的，尾葉桉和細(xì)葉桉的花粉形態(tài)性狀非常相近，韋塔桉和巨桉的比較相近。韋塔桉是從尾葉桉分出來的種，他們的親緣關(guān)系應(yīng)該非常近，但他們的花粉形態(tài)有明顯差異，尾葉桉成齡葉闊披針形,韋塔桉為窄披針形；尾葉桉蒴果直徑<10 mm，韋塔桉的可達15 mm[26]。因此，尾葉桉、韋塔桉的親緣關(guān)系可能沒有想象中那么近，理論上認(rèn)為韋塔桉與尾葉桉的親緣關(guān)系應(yīng)該比巨桉和尾葉桉的關(guān)系更近，本研究結(jié)果初步表明3者的親緣關(guān)系在一個水平。巨桉、韋塔桉和尾葉桉間雜交較容易，且巨桉花粉紋飾與尾葉桉、韋塔桉相似，所以傳統(tǒng)分類系統(tǒng)上歸為一組是合理的。

圖2 7種桉樹的花粉形態(tài)和外壁紋飾。標(biāo)尺=2 μm

3.3 花粉形態(tài)和親緣關(guān)系

從本研究結(jié)果表明，花粉形態(tài)是親緣關(guān)系的重要判斷依據(jù)，武海霞等[28]的研究表明，桉樹花粉形態(tài)差異可作為桉樹種間鑒別的重要依據(jù)；夏騫等[29]也采用花粉形態(tài)來分析雞血藤屬和崖豆藤屬的系統(tǒng)學(xué)意義，可見花粉形態(tài)與系統(tǒng)分類關(guān)系緊密?；ǚ坌螒B(tài)分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類系統(tǒng)物種間親緣關(guān)系不一定完全吻合，但不會完全偏離原有分類系統(tǒng), 而是有助于完善傳統(tǒng)分類系統(tǒng)。雖不能完全依照花粉形態(tài)來分析親緣關(guān)系，但能為傳統(tǒng)分類系統(tǒng)提供更多補充，從而對種間關(guān)系有更深入了解。

粗皮桉、窿緣桉花粉形態(tài)相似，花粉赤道面長、寬相近，萌發(fā)溝形態(tài)也相近，花粉外壁紋飾都較光滑，其親緣關(guān)系可能較近，但他們在傳統(tǒng)分類中歸為不同的組，因此還有待于更深入研究。細(xì)葉桉、赤桉的花粉形態(tài)基本體現(xiàn)了他們在分類系統(tǒng)中的位置。尾葉桉、韋塔桉的花粉形態(tài)反映的親緣關(guān)系沒有之前認(rèn)為的那么近。而從巨桉花粉形態(tài)看，傳統(tǒng)分類系統(tǒng)將巨桉、尾葉桉、韋塔桉分在一組是合理的。本研究補充完善了這7種常見桉樹的親緣關(guān)系，對后期的雜交育種研究有一定的指導(dǎo)意義。

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Analysis of Pollen Micro-morphology and Phylogenetic Relationship among Seven Species of

WANG Chu-biao1,2, LI Ao-bin3, PAN Song-hai4, LU Wan-hong1, LIN Yan1, LUO Jian-zhong1*

(1. China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China; 2. Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 3. China Forestry Group Corporation,Beijing 100026, China; 4. China Forestry Group Leizhou Forestry Bureau Co. Ltd., Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

In order to understand the phylogenetic relationship ofspecies common in China, the pollen morphology of 7 species was observed under scanning electron microscopy. The result showed that the 7 pollen characters ofandwere mostly in the top 2. Among 7 species, the equatorial length (EL), width (EW) and area ofpollen were the largest with 17.522, 17.090m and 300.830m2, respectively; the colpus length (CL), width (CW) and size ofpollen were the largest with 6.576, 0.720m and 4.718m2, respectively; and the equatorial area ofpollen was the smallest, colpus size ofpollen was the smallest. According to cluster analysis based on pollen characters, 7species could be divided into 3 groups under 87.5% of information remaining, includingand,and, and the others. The pollen wall ornamentation ofandwere smooth, whichandwas conventional, and that of,andwas rough.From pollen morphology analysis, the phylogenetic relationship betweenandwas closer, which betweenandwas farther, and that among,andwas consistent with traditional classification. Therefore, there were new interspecies relationships amongspecies from pollen morphology, which had guiding significance to the hybridization breeding of.

; Pollen; SEM; Phylogenetic relationship; Morphology

10.11926/jtsb.4258

2020–06–01

2020–08–20

中國林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項(CAFYBB2017MB028); 廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目(2017KJCX031, 2019KJCX014)資助

This work was supported by the Basic Research Funds of Chinese Aacdemy of Forestry (Grant No. CAFYBB2017MB028); and the Innovation Project for Forestry Scientific Technology in Guangdong (Grant No. 2017KJCX031, 2019KJCX014)

王楚彪(1982~ )，男，助理研究員，從事林木遺傳育種研究。E-mail:scauwcb@163.com

E-mail: 969170789@qq.com