李東明，張健東(通信作者)

天津市第三中心醫(yī)院·天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心·天津市肝膽研究所 (天津 300170)

微生物感染性疾病具有起病急、進(jìn)展快的特點(diǎn)，延遲治療、療程不足或抗感染治療不當(dāng)均可影響患者預(yù)后。以往臨床對(duì)微生物感染性疾病患者多采用經(jīng)驗(yàn)性治療，但抗菌藥物的大量使用導(dǎo)致微生物對(duì)抗生素的耐藥性不斷增強(qiáng)，極大地增加了臨床治療難度。早期精準(zhǔn)識(shí)別微生物病原體對(duì)治療和控制疾病具有十分重要的意義。微生物病原體鑒定是臨床微生物檢驗(yàn)中最基礎(chǔ)的內(nèi)容，但傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)方法操作復(fù)雜，要求檢驗(yàn)人員具備較高的專業(yè)水平及豐富的檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，且檢驗(yàn)過程耗時(shí)較長，在臨床推廣應(yīng)用中具有一定的局限性。近年來，隨著微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)、分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)、生物分子傳感器技術(shù)、生物基因芯片技術(shù)等逐漸在臨床檢驗(yàn)中得到應(yīng)用，并取得了一定的效果。基于此，本文將微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)的臨床研究進(jìn)展綜述如下。

1 免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已逐漸成為快速檢驗(yàn)微生物最常用的方法之一，且有研究表明，該技術(shù)可有效簡化檢驗(yàn)步驟，加快檢驗(yàn)速度，提高檢驗(yàn)準(zhǔn)確度[1]。經(jīng)分析，其原因?yàn)?，免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是將免疫學(xué)原理作為理論依據(jù)，在對(duì)檢驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行敏感標(biāo)識(shí)操作后，利用“示蹤技術(shù)”對(duì)各類生理免疫學(xué)指標(biāo)及病理免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行特異檢驗(yàn)，可省略掉進(jìn)行病毒和細(xì)菌培養(yǎng)的過程，故可節(jié)省檢驗(yàn)用時(shí)，提升檢驗(yàn)效率。

目前，臨床常用的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)為熒光免疫分析技術(shù)及酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。其中，熒光免疫分析技術(shù)是將熒光素作為抗原標(biāo)志物，利用抗原抗體反應(yīng)在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出的熒光特異性抗原抗體復(fù)合物檢測(cè)微生物的存在。呂治林[2]使用炭疽桿菌細(xì)胞壁及莢膜抗原特異的熒光對(duì)單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，可快速準(zhǔn)確鑒別炭疽桿菌。由此可見，熒光免疫分析技術(shù)具有特異性強(qiáng)、檢驗(yàn)速度快等優(yōu)點(diǎn)，在微生物快速檢驗(yàn)中起到重要的作用。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)是一種將酶的催化放大作用與特異性抗原抗體免疫反應(yīng)相結(jié)合的微量分析技術(shù)。使用酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢測(cè)抗原或抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，會(huì)產(chǎn)生有酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，之后在反映液中加入底物，酶可催化底物水解顯色，因顏色變化可反映酶量的改變，故通過檢測(cè)吸光度的變化，可計(jì)算出待檢測(cè)微生物抗原或抗體的濃度。劉洋等[3]在篩查急診艾滋病病毒抗體時(shí)分別采用了膠體層析法、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，發(fā)現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對(duì)低、高值質(zhì)控血清的檢出率高于膠體層析法，且該技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確度、靈敏度及特異度均高于膠體層析法。龔亞東等[4]對(duì)兒童肺炎支原體感染進(jìn)行檢驗(yàn)的結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫檢測(cè)法可獲得較好的檢出效果。由此可見，應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)進(jìn)行微生物檢驗(yàn)具有一定的臨床價(jià)值，且隨著全自動(dòng)免疫分析儀的推廣應(yīng)用，將兩者聯(lián)用，可使微生物檢驗(yàn)更加準(zhǔn)確、快速。

2 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

分子生物學(xué)的迅速發(fā)展使微生物臨床檢驗(yàn)不再局限于研究微生物的外部特征及生理特征，也能對(duì)微生物的分子結(jié)構(gòu)，甚至核酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。對(duì)微生物分子結(jié)構(gòu)和核酸結(jié)構(gòu)的研究可推動(dòng)微生物檢驗(yàn)從生化免疫法轉(zhuǎn)變?yōu)榛驒z測(cè)法。當(dāng)前，分子生物學(xué)技術(shù)中的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是在特定的環(huán)境條件下對(duì)DNA片段進(jìn)行分析，實(shí)施體外酶擴(kuò)增處理，并經(jīng)由檢驗(yàn)擴(kuò)增物質(zhì)實(shí)現(xiàn)快速檢驗(yàn)微生物的目的，因具有快速、敏捷特異等優(yōu)點(diǎn)，其逐漸被用于微生物的臨床快速檢驗(yàn)中。嚴(yán)維花等[5]的研究表明，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)可為大腸埃希菌的快速準(zhǔn)確定量檢測(cè)提供支持。左樂等[6]的研究表明，應(yīng)用多重?zé)晒饩酆厦告湻磻?yīng)技術(shù)對(duì)15種沙門菌的血清學(xué)分型進(jìn)行鑒定具有操作快速、準(zhǔn)確度及特異度高等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.97%。李玲和楊麗瑋[7]的研究指出，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、多重聚合酶鏈反應(yīng)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)等聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在微生物的臨床檢驗(yàn)中均具有檢測(cè)快速及準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度高的特點(diǎn)，其中熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在微生物臨床檢驗(yàn)中的準(zhǔn)確度更高，可將該技術(shù)作為常規(guī)的微生物檢驗(yàn)技術(shù)予以推廣。

3 生物分子傳感器技術(shù)

生物分子傳感器技術(shù)是一項(xiàng)融合了多種現(xiàn)代學(xué)科理論知識(shí)、借助電化學(xué)及生物化學(xué)原理進(jìn)行微生物檢測(cè)的技術(shù)。與其他的微生物檢驗(yàn)技術(shù)相比，該技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)越性[8]。相關(guān)研究顯示，新型的生物分子傳感器可在20 s內(nèi)檢驗(yàn)出SARS病毒、天花病毒、炭疽桿菌等微生物，滿足臨床快速準(zhǔn)確檢驗(yàn)微生物的要求[9]。楊趁霞[10]的研究指出，生物分子傳感器技術(shù)組的檢驗(yàn)結(jié)果與臨床微生物培養(yǎng)結(jié)果(金標(biāo)準(zhǔn))的符合率為94.00%。由此可見，應(yīng)用生物分子傳感器技術(shù)檢驗(yàn)微生物快速便捷、準(zhǔn)確度較高，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)分析，其原因?yàn)?，生物分子傳感器技術(shù)是一種將傳感器技術(shù)與分子診斷技術(shù)有效結(jié)合的檢驗(yàn)技術(shù)，該技術(shù)可將電信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯磻?yīng)信號(hào)，并可放大電信號(hào)及進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換，故可準(zhǔn)確檢測(cè)出被測(cè)物質(zhì)的濃度，有效檢出相應(yīng)的微生物。

4 生物基因芯片技術(shù)

生物基因芯片技術(shù)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，可一次性檢測(cè)上萬個(gè)基因，被認(rèn)為是基因功能研究中最重大的發(fā)明之一。該技術(shù)以眾多特定的寡核苷酸片段或基因片段為基因探針，有規(guī)律地排列并固定在固相介質(zhì)(如硅片、玻璃片、尼龍膜等)上，然后形成相應(yīng)的生物分子點(diǎn)陣，可實(shí)現(xiàn)一次試驗(yàn)同時(shí)檢驗(yàn)多種微生物的目的，特點(diǎn)是檢驗(yàn)效率高、樣品需求量少，故為臨床微生物檢驗(yàn)注入了新的活力[11-12]。有研究表明，生物基因芯片技術(shù)具有微型化、高通量、可平行性地分析基因表達(dá)等優(yōu)勢(shì)，在微生物病原體檢驗(yàn)、種類鑒別、耐藥基因檢驗(yàn)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[13]。當(dāng)前已完成多種細(xì)菌、病毒等微生物的基因組測(cè)序，并將能反映微生物的特殊基因制作成一張芯片，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄處理后，通過檢驗(yàn)樣本中有無微生物基因的存在及其表達(dá)水平，便可明確患者感染微生物的情況、當(dāng)前的感染進(jìn)程及宿主的反應(yīng)等，從而利于不斷提高微生物檢驗(yàn)的效率。也有研究表明，生物基因芯片技術(shù)作為前沿的生物微量分析技術(shù)，其自動(dòng)化程度高、重復(fù)性好，且具有檢驗(yàn)結(jié)果可靠、快速靈敏等特點(diǎn)，可被用于進(jìn)行臨床微生物檢驗(yàn)[14]。經(jīng)分析，其原因?yàn)?，在?yīng)用生物基因芯片技術(shù)檢驗(yàn)微生物的過程中，需先制備已知微生物的特異性堿基序列基因探針，然后利用核酸分子對(duì)其有高度精確性的特點(diǎn)進(jìn)行分析操作，從而在特定的條件下使被檢驗(yàn)的微生物生成雙鏈核酸分子。由此可見，該技術(shù)的穩(wěn)定性較高，可精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)微生物，且近年來微生物的耐藥性不斷提高，多重耐藥率也隨之升高，應(yīng)用生物基因芯片技術(shù)進(jìn)行微生物檢驗(yàn)可有效檢測(cè)出耐藥基因，提高檢測(cè)效率[15]。然而，生物基因芯片技術(shù)的檢驗(yàn)成本相對(duì)較高，且其具有無法有效識(shí)別未制備基因探針的微生物等不足，在微生物檢驗(yàn)的臨床應(yīng)用中仍受到限制。未來需不斷加強(qiáng)對(duì)生物基因芯片技術(shù)的研究，并不斷為新發(fā)現(xiàn)的微生物制備特異性堿基序列基因探針，以推動(dòng)生物基因芯片技術(shù)的發(fā)展。

5 小結(jié)

微生物感染性疾病的快速傳播嚴(yán)重影響人們的身體健康。為了有效控制微生物感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展，需采用科學(xué)的微生物檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行微生物檢驗(yàn)，以便為后期治療提供參考。隨著微生物檢驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展，已出現(xiàn)的快速微生物檢驗(yàn)技術(shù)包括免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)、生物基因芯片技術(shù)、分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)及生物分子傳感器技術(shù)等，臨床需依據(jù)微生物的流行病學(xué)特征選取最為適宜的檢驗(yàn)技術(shù)。目前，微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)不斷向高通量、微型化方向發(fā)展，且越來越多的智能化、自動(dòng)化微生物檢驗(yàn)設(shè)備被研發(fā)，并被應(yīng)用于臨床，使微生物檢驗(yàn)更加快速準(zhǔn)確、微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)得以長足發(fā)展。