張棟鑫 肖麗玲

暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，廣州510000

0 引 言

組織工程是一個(gè)新興的學(xué)科，融合了工程、生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，其研究對(duì)象主要包括細(xì)胞、生物材料和生物反應(yīng)器三個(gè)部分。三者相結(jié)合可構(gòu)建三維人造組織和器官，用于增強(qiáng)、修復(fù)或更換受損或患病的組織。2001年，Zuk[1]首次從人脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），并指出ADSCs具有多向分化潛能，可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞等。后來，研究者又證實(shí)ADSCs能分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）、人類生長(zhǎng)因子（human growth factor，HGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血小板生長(zhǎng)因子（polypeptide growth factor，PGF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor-binding protein，IGFBP）、血管緊張素（angiotensin，Ang）等[2-3]。此外，由于ADSCs具有容易獲取、增殖速度快、細(xì)胞同源性好等特性，近年來成為組織工程中比較理想的種子細(xì)胞。水凝膠（hydrogel）是一類包含大量水分的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)材料，這類材料具有優(yōu)異的生物相容性、良好的彈性、可預(yù)測(cè)的降解率以及可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能，且水凝膠的性質(zhì)可以被任意調(diào)整以提升其細(xì)胞黏附或促進(jìn)細(xì)胞功能（遷移、增殖和分化）的性能。上述優(yōu)點(diǎn)使水凝膠成為一種優(yōu)秀的生物醫(yī)學(xué)材料[4]。本文中，對(duì)ADSCs聯(lián)合水凝膠材料在組織工程中的研究進(jìn)展和應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)其未來的研究重點(diǎn)做出展望。

1 皮膚組織工程

皮膚再生是各種燒傷和慢性創(chuàng)面愈合的重要過程，在創(chuàng)面缺血微環(huán)境的影響下，皮膚組織工程中種植在支架上的ADSCs很容易凋亡。為了解決這個(gè)問題，研究者提出了ADSCs-水凝膠系統(tǒng)。間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行自發(fā)脂肪分化，促進(jìn)表皮和真皮在傷口愈合過程中修復(fù)和生成皮膚的基本結(jié)構(gòu)[5]，生成的脂肪細(xì)胞可以與巨噬細(xì)胞協(xié)同清除傷口床上的細(xì)胞碎片，并分泌與傷口愈合相關(guān)的各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子[6]，可見脂肪細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中起著關(guān)鍵作用。血管形成是皮膚組織工程治療創(chuàng)面中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Eke等[7]利用明膠、透明質(zhì)酸設(shè)計(jì)了一種包含ADSCs的光交聯(lián)水凝膠，并將其作為真皮替代物植入大鼠創(chuàng)面中；其觀察到的血管生成表明，該水凝膠系統(tǒng)促進(jìn)了創(chuàng)面愈合并提高了組織工程皮膚存活率。Tan等[8]的研究結(jié)果表明，脫細(xì)胞脂肪組織水凝膠負(fù)載ADSCs可誘導(dǎo)創(chuàng)面脂肪細(xì)胞生成，并促進(jìn)創(chuàng)面愈合。水凝膠不僅可以在受傷早期對(duì)傷口提供暫時(shí)的保護(hù)，避免感染，還可以通過刺激ADSCs釋放VEGF來促進(jìn)缺血損傷模型中的血管生成，提高創(chuàng)面的愈合率，減少瘢痕攣縮。Lin等[9]制備出溫敏型Pluronic F-127水凝膠，包封ADSCs后注射入糖尿病鼠模型的創(chuàng)面，結(jié)果證實(shí)這種水凝膠系統(tǒng)具有良好的生物相容性，其能使大量細(xì)胞黏附在凹陷部，有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合。Chang等[10]報(bào)道了一種可注射 的1-氨 基-3，3-二 乙 氧 基 丙 烷-透 明 質(zhì) 酸（hyaluronic acid，HA）-殼聚糖（chitosan，CS）水凝膠，這些包裹ADSCs的凝膠具有良好的生物相容性，并能促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移、促進(jìn)肉芽組織的形成、促進(jìn)創(chuàng)面毛細(xì)血管的形成，從而加速創(chuàng)面愈合。Zeng等[11]制備了可注射的明膠微冰膠（gelatin microcryogels，GMs）負(fù)載ADSCs的水凝膠系統(tǒng)并作用于皮膚創(chuàng)面，GMs為ADSCs提供了功能化的微生態(tài)位，以保持細(xì)胞的增殖，提高干細(xì)胞的基因表達(dá)和生物活性因子的分泌，同時(shí)保護(hù)細(xì)胞免受炎癥刺激，最終顯著提高促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的效果。Dong等[12]將超支化聚乙二醇二丙烯酸酯[hyperbranched poly-（poly-（ethylene glycol）diacrylate，HB-PEGDA]聚合物、一種商業(yè)上可用的硫醇功能化透明質(zhì)酸（HA-SH）和一個(gè)短rgd肽組成一個(gè)水凝膠體系，這種凝膠溶液可在進(jìn)入體內(nèi)后5 min內(nèi)形成凝膠，避免了ADSCs的流失，同時(shí)rgd肽增強(qiáng)了水凝膠體系對(duì)細(xì)胞的黏附能力，將這種體系植入大鼠燒傷創(chuàng)面模型后加速了創(chuàng)面愈合，減少了瘢痕形成。Samberg等[13]利用聚乙二醇[poly（ethylene glycol），PEG]改性富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）使其凝膠化，形成的水凝膠體系不僅可作為ADSCs支架，而且可長(zhǎng)期釋放生長(zhǎng)因子，促進(jìn)創(chuàng)面血管化和愈合。綜上，水凝膠支架包裹ADSCs形成的體系可以被認(rèn)為是治療各種類型皮膚缺損的一種很有前途的方法。

2 脂肪組織工程

當(dāng)正常軟組織外觀因慢性疾病、創(chuàng)傷或腫瘤切除而受損時(shí)，脂肪組織工程便成為一種可行的解決方法。然而，由于脂肪是一種高度血管化的組織，因此脂肪組織重建的結(jié)局在很大程度上取決于植入后血管化的情況。ADSCs除了有較強(qiáng)的脂肪分化能力、抗凋亡能力外，其還可通過旁分泌效應(yīng)分泌VEGF等，使其在血管化脂肪組織工程中有著良好的前景。Zhang等[14]將己二酰肼交聯(lián)PLGA成水凝膠，凍干后形成多孔結(jié)構(gòu)，使ADSCs在結(jié)構(gòu)中聚集成球狀體，較高的細(xì)胞密度造成了微缺氧環(huán)境，增強(qiáng)了ADSCs的旁分泌效應(yīng)，在ADSCs分化為脂肪細(xì)胞的同時(shí)促進(jìn)了血管生成，促進(jìn)血管化脂肪組織的形成。棕色脂肪組織具有很強(qiáng)的耗能及產(chǎn)熱能力，是治療肥胖和代謝性疾病的潛在靶點(diǎn)，但其在體內(nèi)含量有限。Vaicik等[15]將ADSCs在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝膠中誘導(dǎo)分化為像棕色脂肪組織一樣活動(dòng)的“米色”脂肪組織，為移植到體內(nèi)改善代謝活動(dòng)提供了可能。

3 骨組織工程

骨組織工程是指通過誘導(dǎo)ADSCs向成骨細(xì)胞分化，從而促進(jìn)骨的修復(fù)和形成過程。為了達(dá)到這個(gè)過程，可將包裹ADSCs的水凝膠作為物理穩(wěn)定劑，在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)原位干細(xì)胞分化。

Debnath等[16]報(bào)道了一種可促進(jìn)ADSCs成骨分化的交聯(lián)殼聚糖凝膠，該水凝膠的疏松多孔結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，增加了氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。2019年，Pal等[17]研制了負(fù)載有人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogentic protein-2，rhBMP-2）和強(qiáng)力霉素的膠原-彈性蛋白樣多肽（elastin-like polypeptide，ELP）的骨再生水凝膠，ADSCs在其中成功附著和增殖，堿性磷酸酶和骨鈣素等成骨標(biāo)記物大量表達(dá)，同時(shí)負(fù)載的強(qiáng)力霉素也表現(xiàn)出對(duì)多種細(xì)菌的抗性，展示了藥物負(fù)載膠原-ELP水凝膠在抗細(xì)菌感染和促進(jìn)引導(dǎo)骨再生方面良好的應(yīng)用前景。并不是所有水凝膠支架都需要在成骨誘導(dǎo)劑作用下促進(jìn)ADSCs的成骨分化，例如，在2015年，Lyu等[18]發(fā)現(xiàn)自支撐石墨烯水凝膠（self-sustaining graphene hydrogel，SGH）膜能單獨(dú)刺激ADSCs的成骨分化，而這種良好的骨誘導(dǎo)性能與其獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)、較強(qiáng)的細(xì)胞黏附性、合理的表面親水性和高蛋白吸收等優(yōu)異的物理性能密切相關(guān)。

4 軟骨組織工程

在軟骨分化的早期，HA是間質(zhì)中一種關(guān)鍵的糖胺聚糖，在軟骨生物力學(xué)中起著重要作用，HA能提高滑膜液的黏度和潤(rùn)滑性能。之前的研究結(jié)果表明，HA作為微環(huán)境因子可促進(jìn)ADSCs的細(xì)胞聚集和軟骨分化，最終促進(jìn)透明軟骨基質(zhì)的形成[19]。Wang等[20]合成HA改性熱敏聚（N-異丙基丙烯酰胺）[HApoly（N-isopropylacrylamide）-CL，HA-PNIPAAm-CL]水凝膠，增強(qiáng)了ADSCs的細(xì)胞相容性和軟骨形成能力，成功為以ADSCs為基礎(chǔ)的關(guān)節(jié)軟骨組織工程提供了軟骨誘導(dǎo)的微環(huán)境。Morrison等[21]將ADSCs與軟骨細(xì)胞在透明質(zhì)酸-膠原水凝膠中共培養(yǎng)，并將其置于3D打印的聚己內(nèi)酯支架孔隙中，短期內(nèi)成功誘導(dǎo)了軟骨產(chǎn)生。ADSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)、水凝膠結(jié)合3D打印的生物可吸收支架，減小了傳統(tǒng)軟骨組織工程方法對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)或外源性生長(zhǎng)因子暴露的限制，是一次良好的嘗試。Bhattacharjee等[22]開發(fā)出以羊膜（amnia，AM）組織為基礎(chǔ)的可注射水凝膠，發(fā)現(xiàn)其不僅能支持支持ADSCs生存和增殖，還能與ADSCs協(xié)同發(fā)揮抗炎和軟骨保護(hù)作用，展示了兩者聯(lián)合在治療骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）方面的潛力。

5 肌組織工程

骨骼肌損傷及萎縮是常見的肌肉組織疾病。盡管骨骼肌具有一定的再生能力，但仍有某些因素阻止其正常的修復(fù)過程，最終導(dǎo)致肌肉萎縮、功能喪失。干細(xì)胞療法近年來已成為治療此類疾病的熱點(diǎn)方法[23]。2015年，F(xiàn)orcales[24]回顧性分析了ADSCs在肌肉再生中的應(yīng)用，指出了它在肌肉組織工程中的廣泛前景。在針對(duì)骨骼肌等一些較厚組織的組織工程中，主要限制因素是血管化。Kim等[26]將ADSCs與體內(nèi)呈凝膠態(tài)的甲氧基聚乙二醇-聚己內(nèi)酯[monomethoxyl poly（ethylene glycol）-b-poly（εcaprolactone），MPEG-PCL]結(jié)合作為肌肉再生基質(zhì)，然后再加入VEGF，形成的水凝膠體系不僅增強(qiáng)了血管生成功能，而且提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保證了細(xì)胞的活力和肌肉組織的再生。Hwang等[25]提出了一種由人脂肪干細(xì)胞（h-ADSCs）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BFGF）、明膠-聚乙二醇-酪胺（gelatinpolyethylene glycol-tyramine，GPT）構(gòu)成的水凝膠體系，并證明了其在促進(jìn)肌肉再生過程中的協(xié)同作用。雖然單獨(dú)使用ADSCs可在一定程度上促進(jìn)肌肉愈合，但將ADSCs與水凝膠和生物活性物質(zhì)結(jié)合后，所構(gòu)成的體系表現(xiàn)出了更顯著的作用，包括增強(qiáng)新生肌肉組織的收縮力、增加血管生成以及減少局部纖維化。這些例子表明，包裹在水凝膠中的ADSCs是促進(jìn)肌肉再生的一種有效的治療方式。隨著水凝膠設(shè)計(jì)的改進(jìn)，這些組合系統(tǒng)可以不斷改善優(yōu)化，從而在肌肉組織工程中得到更廣泛的應(yīng)用。

6 心臟組織工程

心肌梗死對(duì)心臟的損害是不可逆轉(zhuǎn)的，只有通過組織再生才能完全治愈。ADSCs是心臟組織再生的良好選擇。可注射的纖維蛋白膠、基質(zhì)凝膠、膠原、海藻酸鈉凝膠，以及可注射的生物聚合物和自組裝肽是心臟治療常用的注射材料，這些材料有時(shí)也與ADSCs聯(lián)用。例如，Wang等[27]用殼聚糖水凝膠將攜帶熒光素酶和Fluc基因-單聚紅色熒光蛋白（Fluc-monomeric red fluorescent protein，F(xiàn)luc-MRFP）雙融合報(bào)告基因的棕色脂肪干細(xì)胞（brown adiposederived stem cells，BADSCs）移植到梗死大鼠心臟內(nèi)，體內(nèi)縱向生物發(fā)光成像和組織學(xué)染色結(jié)果顯示，殼聚糖能提高移植BADSCs的存活率，并顯著提高BADSCs向心肌細(xì)胞的分化率。此外，殼聚糖水凝膠給藥的BADSCs可防止基質(zhì)重塑，增加血管生成，保護(hù)心臟。該結(jié)果提示，以殼聚糖水凝膠和BADSCs為基礎(chǔ)的可注射心肌組織工程是一種有效的心肌再生策略。內(nèi)源性和外源性硫化氫（H2S）已經(jīng)被證明對(duì)心血管系統(tǒng)可以產(chǎn)生抗炎、線粒體功能保存、血管擴(kuò)張和抗氧化應(yīng)激等廣泛的保護(hù)作用，而2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺（2-aminopyridine-5-thiocarboxamide，APTC）是臨床試驗(yàn)中最常用的硫化氫供體藥物之一，但其有水溶性差、清除率高和有毒性等缺點(diǎn)。心肌梗死后，心肌細(xì)胞間的電脈沖信號(hào)傳導(dǎo)被阻斷，而導(dǎo)電水凝膠可通過促進(jìn)梗死區(qū)的電脈沖傳導(dǎo)，恢復(fù)心臟的同步收縮和舒張，有利于心臟功能的恢復(fù)。Liang等[28]將APTC置入部分氧化的海藻酸鈉（alginate-catechol，ALG-CHO）中，以模擬內(nèi)源性H2S的緩慢持續(xù)釋放，此外又進(jìn)一步引入導(dǎo)電低聚物四苯胺和ADSCs，通過ALG-CHO與明膠之間的希夫堿反應(yīng)，形成一種載有干細(xì)胞的導(dǎo)電H2S釋放水凝膠。該水凝膠具有較強(qiáng)的黏附性，能穩(wěn)定地錨定在潮濕和跳動(dòng)的心臟上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADSC負(fù)載的導(dǎo)電H2S釋放水凝膠能顯著提高對(duì)心肌梗死的治療效果，提供了一種很有前途的治療策略。

7 神經(jīng)組織工程

神經(jīng)軸突斷裂后無法恢復(fù)的特性限制了神經(jīng)損傷的治療效果[4]。ADSCs經(jīng)表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FGF-2）適當(dāng)誘導(dǎo)后，可分化為神經(jīng)細(xì)胞。提示ADSCs在干細(xì)胞治療神經(jīng)再生中具有較高的潛能。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）也可促進(jìn)干細(xì)胞的存活和神經(jīng)元分化。Burgers等[29]證明了NGF具有促進(jìn)大鼠海綿狀神經(jīng)再生的作用。Kim[30]將ADSCs和神經(jīng)生長(zhǎng)因子-透明質(zhì)酸水凝膠結(jié)合，成功改善了海綿狀神經(jīng)損傷大鼠的勃起功能。Dong等[31]制備出一種導(dǎo)電微孔水凝膠并將ADSCs接種于微孔中形成細(xì)胞球，經(jīng)過電刺激（electrical stimulation，ES）之后，發(fā)現(xiàn)ADSCs的神經(jīng)元性分化能力顯著提高。總之，在精心設(shè)計(jì)的水凝膠支架幫助下，ADSCs有望在神經(jīng)損傷和疾病的治療中發(fā)揮更重要的作用。

8 其他組織工程

除上述幾大領(lǐng)域外，研究者也將ADSCs聯(lián)合水凝膠材料在其他組織工程中做出嘗試。Wang等[32]開發(fā)出胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-likegrowth factor-1，IGF-1）固定的殼聚糖-透明質(zhì)酸（CS-HA）水凝膠，并將此生物活性水凝膠聯(lián)合ADSCs注入缺血損傷肢體后，成功促進(jìn)了細(xì)胞基礎(chǔ)上的血液灌注恢復(fù)和肌肉細(xì)胞再生。該研究是以血供喪失為主要病理生理特征的外周動(dòng)脈疾病在組織工程治療方案上的一次重要探索。De Moor等[33]利用3D生物打印技術(shù)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）、人包皮成纖維細(xì)胞（human foreskin fibroblast，HFF）和ADSCs共培養(yǎng)于水凝膠中，構(gòu)建出具有良好生物相容性的自組織血管化微球體，這些微球體可以相互融合，為更大型的血管組織工程提供基礎(chǔ)。Zhu等[34]發(fā)現(xiàn)Kartogenin（KGN）共軛水凝膠具有支持ADSCs分布和相關(guān)因子傳遞的潛力，并能促進(jìn)其向髓核細(xì)胞的分化。Zhou[35]等制備了以genipin為交聯(lián)劑的Ⅱ型膠原/硫酸軟骨素復(fù)合水凝膠 狀 ADSCs（typeⅡcollagen/chondroitin sulfate composite hydrogel-like ADSCs，CCSA）傳遞系統(tǒng)，應(yīng)用于髓核退行性變的大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠的椎間盤高度、含水量、細(xì)胞外基質(zhì)合成和結(jié)構(gòu)均有部分恢復(fù)。上述兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，干細(xì)胞組織工程在治療髓核退行性疾病方面的潛力。直到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)結(jié)直腸組織工程的研究還很少。Denost[36]曾嘗試制備一種纖維蛋白和殼聚糖組成的復(fù)合生物凝膠，負(fù)載ADSCs后植入豬體內(nèi)的缺損結(jié)腸壁中，觀察到了修補(bǔ)部位結(jié)腸壁平滑肌細(xì)胞的再生以及植入物整體良好的抗炎作用，首次驗(yàn)證了組織工程結(jié)腸替代術(shù)的可行性。

9 結(jié) 語

本綜述中，總結(jié)了ADSCs聯(lián)合水凝膠在組織工程方面的進(jìn)展。盡管這是一個(gè)新興領(lǐng)域，但近年來研究者已經(jīng)做了大量的研究。研究者根據(jù)皮膚、骨、軟骨、心臟等組織工程的不同要求，用物理、化學(xué)等方法對(duì)各種不同特點(diǎn)的水凝膠進(jìn)行處理，通過加入抗生素、生長(zhǎng)因子、多肽等小分子物質(zhì)，對(duì)水凝膠材料的孔徑、溶脹率、抗菌性能、力學(xué)性能、降解性能進(jìn)行調(diào)整與修飾。修飾后的水凝膠不僅保證了與ADSCs有良好的結(jié)合性能，而且能促進(jìn)ADSCs良好存活、增殖并發(fā)揮出定向分化、分泌多種生長(zhǎng)因子等作用。除了傳統(tǒng)的方法外，3D打印技術(shù)也被引入該領(lǐng)域并得到發(fā)展。3D打印技術(shù)極大地克服了由于細(xì)胞密度有限、接種位置不可控以及支架內(nèi)組織分布不均勻等原因，難以有效再生高度復(fù)雜組織的障礙[37]。因此，ADSCs聯(lián)合水凝膠在組織工程和細(xì)胞治療方面具有無限的潛力。

然而，若要使ADSCs聯(lián)合水凝膠材料在組織工程中的應(yīng)用更加廣泛和成熟，仍然面臨著一些挑戰(zhàn)。例如，目前的3D打印技術(shù)僅能利用ADSCs和水凝膠構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)單的器官，但形成像肝內(nèi)膽管、腎小球之類的復(fù)雜器官仍需要更多的研究和探索。此外，水凝膠支架在體內(nèi)分解前后，脂肪干細(xì)胞的長(zhǎng)期命運(yùn)需要進(jìn)一步明確。最后，水凝膠的力學(xué)形態(tài)特征與接觸材料后細(xì)胞產(chǎn)生行為之間的相互作用也需要進(jìn)一步闡明。相信隨著ADSCs聯(lián)合水凝膠材料在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中研究的深入，其在組織工程中的應(yīng)用前景將更加光明。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突