潘振華 杜麗敏 王舉 陳軍

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點實驗室，300052；2天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院300070

0 引言

煙堿受體（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs）是乙酰膽堿（acetylcholine,ACh）的主要受體之一，屬于配體門控離子通道蛋白超家族，該家族成員還包括γ-氨基丁酸受體、甘氨酸受體和五羥色胺受體等。與其它成員一樣，nAChRs由五個同源亞基圍繞中央離子通道形成近似對稱的五聚體蛋白，每個亞基由一段長度為200個氨基酸（aminoacid,AA）左右的細胞外氨基末端、四段跨膜螺旋（M1-M4）、一段短的羧基末端和M3-M4之間細胞內(nèi)環(huán)（intracellular domain,ICD）組成。目前在人類基因組中已經(jīng)鑒定到5個肌肉型nAChR亞基（α1，β1，γ，δ，ε）和11個神經(jīng)型nAChR亞基（α2-α7，α9，α10，β2-β4），它們廣泛地分布于神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)中，發(fā)揮著重要的生理功能[1-5]。

越來越多的蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)數(shù)據(jù)給出了煙堿受體除ICD之外的結(jié)構(gòu)信息，研究者們不僅能夠清晰描繪出經(jīng)典的配體結(jié)合口袋，還證實了nAChRs的變構(gòu)蛋白特征，鑒定到變構(gòu)調(diào)節(jié)分子的結(jié)合和調(diào)控位點，并研究和開發(fā)出了選擇性更高的激動劑、拮抗劑和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑分子，以實現(xiàn)在戒煙、鎮(zhèn)痛、增強認知和抗抑郁等過程中對nAChRs功能的靶向調(diào)控[1-8]。然而，ICD部分的結(jié)構(gòu)與功能仍有待研究。不同于其它結(jié)構(gòu)區(qū)間，ICD在亞基之間存在很大差異，序列長度為78～259 AA不等，但同一個亞基的ICD在物種進化過程中卻高度保守，提示了該序列的功能重要性。大量研究證據(jù)表明，調(diào)控亞基細胞內(nèi)表達、代謝及下游信號功能的主要位點分布在ICD，如，將蛋白嵌合體中α7亞基的ICD替換為α3或者α4亞基的ICD，能直接改變受體的組織分布[9]。

互作蛋白分子及蛋白之間的相互作用關(guān)系往往有助于推導(dǎo)特定蛋白的功能及功能位點信息。如，通過對神經(jīng)遞質(zhì)N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）的研究，發(fā)現(xiàn)它們能夠集合成由多達186個蛋白分子組成的復(fù)合物，而將復(fù)合物中這些分子進一步富集，能拓展到1 124種蛋白分子。通過這個研究結(jié)果，可推測到由谷胱甘肽或其它NMDAR的配體分子能夠激活一系列不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括基因轉(zhuǎn)錄、細胞骨架重排，以及蛋白合成、降解和轉(zhuǎn)運[10]。繼NMDARs之后，在過去的幾十年里，對于nAChRs互作蛋白的研究不斷有報道；同時，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，逐漸呈現(xiàn)出nAChRs相關(guān)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而對nAChRs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的解析，將有助于進一步闡述nAChRs的生物學(xué)功能以及與其相關(guān)的疾病機制。

1 煙堿受體的細胞內(nèi)代謝調(diào)控

新合成的煙堿受體亞基在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）中折疊和組裝為成熟的受體，繼而由ER轉(zhuǎn)運到高爾基體，再由高爾基體轉(zhuǎn)運到細胞膜上表達并發(fā)揮功能。細胞膜上的受體在細胞內(nèi)吞作用下，進入蛋白酶體發(fā)生降解，而未組裝的亞基和錯誤折疊的亞基可經(jīng)ER相關(guān)降解（ER-associated degradation,ERAD）途徑降解與回收。在此過程中，煙堿受體會受到多種蛋白分子的調(diào)控，而研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些調(diào)控分子與受體的結(jié)合位點主要在ICD[9,11-12]。

1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白調(diào)控受體的折疊與組裝

ER伴侶蛋白BiP、Calnexin和ERp57會迅速與新合成的亞基多肽結(jié)合，以輔助亞基之間進行組裝。BiP與亞基結(jié)合時間短，而Calnexin和ERp57與亞基的結(jié)合持續(xù)時間較長，以維持亞基在ER內(nèi)的滯留。Calnexin具有凝集素結(jié)合域，一般與N-糖基化的天冬氨酸通過凝集素結(jié)合域互作，但近期研究發(fā)現(xiàn)，Calnexin與nAChR亞基的互作并不依賴于N-糖基化，進一步實驗鑒定到，Calnexin與ERp57往往同時出現(xiàn)在與nAChR亞基結(jié)合的蛋白復(fù)合體中，而ERp57可通過短暫的分子間二硫鍵結(jié)合到亞基上，由此推測Calnexin與煙堿受體亞基的結(jié)合很可能是通過復(fù)合蛋白中ERp57等其它成員與亞基的相互作用[11,13]。

拮抗膽堿酯酶蛋白RIC-3也是ER分布的跨膜蛋白，與ER中未組裝的nAChR亞基結(jié)合，促進亞基的折疊和組裝。與BiP、Calenxin不同，RIC-3與nAChR亞基的結(jié)合是高度選擇性的，特別是對α7受體的成熟具有非常重要的促進作用[14-15]。

富含半胱氨酸和表皮生長因子樣區(qū)域蛋白CRELD2被發(fā)現(xiàn)在ER中與α4β2受體共定位，且特異性調(diào)控α4β2的組裝和細胞膜表達。酵母雙雜交實驗證實，α4-ICD的331-381肽段是CRELD2β結(jié)合的主要位點[10,16]。

在一些哺乳動物細胞系中，煙堿受體亞基的折疊效率依賴于正確二硫鍵的形成，不恰當?shù)亩蜴I會阻礙亞基的有效折疊。在爪蟾卵母細胞中發(fā)現(xiàn)，α7亞基的折疊效率受到脯氨酰異構(gòu)酶（Cyclophilin）的調(diào)控[17]。

1.2 成熟受體的轉(zhuǎn)運

鈣離子感受蛋白VILIP-1，是在腦組織中以α4為誘餌蛋白進行酵母雙雜交鑒定到的互作蛋白，其參與調(diào)控?zé)焿A受體的運輸。VILIP-1包含3個功能型鈣離子結(jié)合EF-hand結(jié)構(gòu)域，其中α4-ICD（302-339肽段）是α4與VILIP-1互作的必要序列結(jié)構(gòu)。VILIP-1與α4的互作能夠上調(diào)α4β2型受體在細胞表面的表達，并增加對ACh的敏感性[17]。

在肌肉型受體、β2和β4亞基的ICD鑒定到了控制ER輸出的結(jié)構(gòu)域。在人類β2和β4亞基中，靠近跨膜區(qū)域M3的LFM-motif被鑒定為受體從ER轉(zhuǎn)運出的標識序列；而位于β2-ICD中段的RRQR-motif被鑒定為ER滯留信號。研究者們在少數(shù)漸凍癥患者基因組中鑒定到β4亞基靠近ER輸出結(jié)構(gòu)域的R349C位點突變，該突變可引起ER輸出位點的減少以及受體在細胞膜的表達量降低，這與疾病的發(fā)生直接相關(guān)。對尼古丁分子的研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁分子能夠促進α3β4受體以（α3）2（β4）3的形式聚合，從而增加了β4的數(shù)量以及相應(yīng)的ER輸出結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，這個結(jié)果解釋了慢性尼古丁誘導(dǎo)增加了表面受體的現(xiàn)象[9,11]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，在α1亞基ICD存在兩個相鄰的堿性氨基酸位點，這兩個位點能夠被COPI復(fù)合體識別，從而促進成熟受體由ER輸出轉(zhuǎn)運到高爾基體[18]；而位于高爾基體的跨膜蛋白UNC-50能夠選擇性地調(diào)控一些煙堿受體亞型從高爾基體向細胞膜的轉(zhuǎn)運，并且這種調(diào)控作用是必不可少的[10,19]。與成熟受體不同，未組裝完全的nAChRs會受到ER膜蛋白Rer1等的結(jié)合和約束，以阻止其從ER逃逸到胞漿中[20]。

1.3 受體的降解與回收

除了ERAD，煙堿受體蛋白也受到蛋白酶體-泛素降解機制（ubiquitin-proteasome system,UPS）的調(diào)控。接頭蛋白Ubiquitin-1可通過結(jié)合到α3亞基，將其轉(zhuǎn)運到蛋白酶體，繼而限制亞基的組裝和向細胞膜的轉(zhuǎn)運，最終降低α3β2受體在細胞膜的表達[21-22]。

另外，兩種接頭蛋白UBXD4和UBXN2A被證實可阻斷α3亞基的降解。其中UBXD4在神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織中都有表達，細胞內(nèi)主要分布于ER和高爾基體。有證據(jù)表明，UBXD4可能通過阻斷α3亞基的降解，從而增加其在細胞表面的表達以及增強對ACh的應(yīng)答。在UBXN2A與α3的結(jié)合蛋白復(fù)合體中，還鑒定到VCP/p97、HSC70/HSP70和CHIP；進一步研究證實，UBXN2A可通過干預(yù)具有E3連接酶活性的CHIP蛋白與α3亞基的結(jié)合，從而抑制亞基的降解，并促進α3受體的成熟和轉(zhuǎn)運[23-24]。

2 膜蛋白和骨架蛋白調(diào)控受體的聚集與穩(wěn)定性

通過構(gòu)建嵌合體和免疫沉淀實驗，驗證了骨架蛋白Rapsyn能與β1亞基直接互作，它們之間的互作關(guān)系，能夠調(diào)控肌肉型受體在神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscular junction,NMJ）的聚集和穩(wěn)定；同時，它們之間的互作關(guān)系，依賴于β1-ICD酪氨酸位點的磷酸化[17]。Rapsyn蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中也得到了鑒定，但研究發(fā)現(xiàn)，Rapsyn并不參與α3β2或者α4β2受體在細胞表面的表達調(diào)控。此外，Rapsyn在內(nèi)耳中也有表達，并且與α9-ICD互作，能夠增強α9型受體在細胞表面的聚集[25]。

骨架蛋白PSD-95家族成員包括PSD-93、PSD-95、SAP97和SAP102，它們都被證實能與煙堿受體互作。PSD-95家族蛋白結(jié)構(gòu)中都含有PDZ結(jié)合域，一般情況下，PDZ結(jié)構(gòu)域主要是和蛋白分子的細胞內(nèi)C末端區(qū)域結(jié)合；而越來越多的研究結(jié)果指出，該家族蛋白也可通過PDZ-domain與nAChRs的ICD發(fā)生相互作用，如PSD-93與小鼠神經(jīng)組織中的煙堿受體互作，以維持受體穩(wěn)定性。在HEK293細胞模型中，PSD-93能與含有α3和α5的受體以及α4β2受體結(jié)合，而SAP102只和含有α5的受體結(jié)合。在HEK293細胞和雞的纖毛神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，PSD-95與α3和α5亞基結(jié)合，而不與α4β2或α7受體結(jié)合[17]。

酵母雙雜交和Co-IP研究結(jié)果證實，α3-ICD和α4-ICD都具有接頭蛋白14-3-3的結(jié)合位點，在α3-ICD是RSSSSES肽段，在α4-ICD是RSLSVQ肽段。它們之間的結(jié)合能夠調(diào)控受體的穩(wěn)定性和細胞內(nèi)的運輸，以增加特定亞型的受體在細胞膜的表達[9,26]。Co-IP實驗還鑒定到，肌肉細胞細胞膜微囊的蛋白組分caveolin-3與α1亞基互作，從而影響肌肉型受體在NMJ的聚集與穩(wěn)定性，并推測它們之間可能是通過caveolin結(jié)合域連接[27]。此外，還有一些研究者們發(fā)現(xiàn)，α7受體、α4β2受體的ICD區(qū)域都可與支架蛋白β-arrestin1互作，并調(diào)控酪氨酸激酶Src的活化[28-29]。

3 下游信號調(diào)控

傳統(tǒng)研究認為nAChRs在體內(nèi)發(fā)揮的是陽離子通道功能，在內(nèi)源性配體ACh和外源性配體尼古丁分子等的激活下，將Na+、K+和Ca2+等電流信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)化學(xué)信號。近期，更多的研究開始關(guān)注nAChRs非離子通道依賴型的下游信號調(diào)控，即代謝型受體功能。這些下游信號的改變，能直接影響細胞的骨架結(jié)構(gòu)、增殖與分化、存活和多種細胞因子的分泌?，F(xiàn)有證據(jù)表明，nAChRs對細胞內(nèi)下游信號的調(diào)控，主要是由通過其ICD構(gòu)象改變以及與其它蛋白分子之間的相互作用關(guān)系來介導(dǎo)的[9,30]。

3.1 Wnt信號通路

已知腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白APC可通過接頭蛋白14-3-3與α3亞基結(jié)合，APC參與經(jīng)典Wnt通路的調(diào)控，并且Wnt通路的配體蛋白Wnt-7a可調(diào)節(jié)大鼠海馬區(qū)突觸神經(jīng)元中APC與α7受體的共聚，以有效增強α7受體在前突觸位點的聚集。研究者們由此推斷，nAChRs信號通路與Wnt通路之間存在相互調(diào)控關(guān)系[31-33]。

3.2 G蛋白信號通路

蛋白組學(xué)研究鑒定到多種nAChRs受體復(fù)合物中存在G蛋白成分，如通過對β2亞基的組學(xué)實驗鑒定到，β2可能通過與Goα的互作調(diào)控下游G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10,34]。定點突變實驗證實α7受體的ICD具有能與Gαq發(fā)生結(jié)合的序列區(qū)域（345-348肽段），α7受體可在不依賴離子通道開放的狀態(tài)下通過直接與G蛋白互作，來調(diào)控下游包括鈣離子在內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2,30,35]。

3.3 基于α7受體的發(fā)現(xiàn)

α7受體是近年來最受關(guān)注的煙堿受體類型之一，α7受體不僅在大腦中含量豐富，同時也是迷走神經(jīng)調(diào)控的膽堿能抗炎信號通路中的重要調(diào)節(jié)分子，其參與JAK2/STAT3信號通路、NF-κB的活性調(diào)控。α7-ICD結(jié)構(gòu)在所有nAChR亞基蛋白中是最保守的，通過真核生物蛋白短序列功能肽分析，鑒定到α7-ICD區(qū)間存在多個絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸化功能位點、MAPK信號家族調(diào)控位點以及與接頭蛋白復(fù)合物的互作位點[9,36-37]。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)研究

幾項大規(guī)模蛋白組學(xué)研究分別針對α7受體、α4β2受體的互作蛋白進行了鑒定和分析，且主要是針對腦組織，包括人腦和小鼠神經(jīng)組織。其主要方法均是采用特異性親和力配體（α-bgtx）或抗體進行結(jié)合與分離；對比亞基敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠組織或細胞。有團隊較Paulo團隊改進了α7的分離和純化方法，由Paulo團隊鑒定的55種互作蛋白，豐富到了121種α7互作蛋白，包括α7本身。通過STRING和KEGG富集分析，α7在神經(jīng)組織中的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)既包括其細胞內(nèi)代謝相關(guān)調(diào)控蛋白，也包括與AD、PD等神經(jīng)疾病相關(guān)的蛋白分子。此外，還鑒定到α7的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)中，有一部分蛋白分子與NMDARs的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)重合，研究者們推測可能與NMDARs存在競爭結(jié)合關(guān)系[38-39]。

McClure-Begley等[40]鑒定到78種與β2受體互作的蛋白，并給出了這些蛋白分子的細胞內(nèi)亞分布，同時還采用iTRAQ定量比較了尼古丁誘導(dǎo)下的互作蛋白譜系改變；Miller等[41]通過質(zhì)譜鑒定到α4亞基ICD上8個重要的磷酸化位點，證實與PKA、PKC及CaMKII的相互作用，以及對下游信號的影響。

質(zhì)譜研究可較全面地鑒定到與特定亞基存在互作關(guān)系的蛋白分子，iTRAQ還可實現(xiàn)一定程度的定量。不過，對于蛋白復(fù)合物的分離和純化，特別是非特異性蛋白分子的污染，是提高質(zhì)譜鑒定結(jié)果的關(guān)鍵。

5 結(jié)語

nAChRs在細胞膜的表達和功能以及在細胞內(nèi)的代謝和下游信號傳遞，受到多種互作蛋白的調(diào)控，而這些互作蛋白與nAChRs的結(jié)合位點主要集中在ICD區(qū)間，并且受到ICD位點磷酸化、糖基化、棕櫚化以及二硫鍵等的影響。包括Src家族在內(nèi)的酪氨酸激酶、PKA及PKC在內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸激酶等，被證實與不同亞型的nAChRs結(jié)合，并且在受體表達與功能的平衡中起到重要的調(diào)節(jié)作用[1-2,9,42-44]。

目前，對煙堿受體ICD的結(jié)構(gòu)以及細胞內(nèi)的功能尚缺乏明確的闡述，通過對煙堿受體互作蛋白的研究，有助于探討煙堿受體的生理功能及相關(guān)疾病機制。比如，最初研究者們鑒定到肌肉型煙堿受體的突變與先天肌無力綜合征（congenital myasthenic syndrome,CMS）相關(guān)，而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，除煙堿受體自身突變之外，nAChRs互作蛋白Rapsyn等的突變同樣也會引起CMS的發(fā)生[10]。

同時，通過對互作蛋白結(jié)構(gòu)與互作位點特征的研究，有助于進一步解析煙堿受體ICD部分的結(jié)構(gòu)。由于nAChRs的ICD序列對于每個亞基具有更高的特異性，因此靶向這個區(qū)域的調(diào)控對于特異性調(diào)節(jié)亞基功能具有很大的潛力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突