周向宇 潘 坤 劉 杰 王鋒尖*

（1漢江師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北十堰 442000；2 十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，湖北十堰 442000）

全世界約有側(cè)耳屬50種，目前我國(guó)包括野生及引種栽培的已知種類(lèi)為36種，是側(cè)耳屬真菌種類(lèi)資源較為豐富的國(guó)家之一[1]。肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）屬于蘑菇綱（Agaricomycetes）、蘑菇目（Agaricales）、側(cè)耳科（Pleurotaceae）、側(cè)耳屬（Pleurotus）[2]，我國(guó)廣東、廣西、河南、吉林、陜西、西藏、新疆等?。▍^(qū)）均有分布，夏季生長(zhǎng)在枯死的闊葉樹(shù)或倒木上[3]。研究表明，肺形側(cè)耳多糖具有抗癌活性[4]。目前肺形側(cè)耳已被列入第十一批《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)植物品種保護(hù)名錄》[5]。肺形側(cè)耳子實(shí)體形態(tài)受環(huán)境影響較大，從牛頭山采集的子實(shí)體形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道[3，6-8]存在一定差異，故對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)及出菇試驗(yàn)，為開(kāi)發(fā)利用該菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試肺形側(cè)耳菌株

圖1 野生肺形側(cè)耳子實(shí)體

野生肺形側(cè)耳子實(shí)體（圖1）于2015年采自湖北省十堰市牛頭山國(guó)家森林公園，采集人王鋒尖，采集時(shí)間2015 年9 月19 日，采集地東經(jīng)110°43′，51.7″、北緯32°36′04.7″，海拔439 m。采集標(biāo)本存放于漢江師范學(xué)院真菌標(biāo)本室（HMHNU），標(biāo)本號(hào)HMHNU1049。菌株由子實(shí)體組織分離得到，保存于漢江師范學(xué)院菌種庫(kù)。該菌株由漢江師范學(xué)院王鋒尖根據(jù)宏觀(guān)形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)特征初步鑒定為肺形側(cè)耳。經(jīng)ITS序列分析（圖2），并在Gen Bank運(yùn)用Blast進(jìn)行同源性比對(duì)，得出，與側(cè)耳屬的肺形側(cè)耳最大同源性高達(dá)99.84%，結(jié)合宏觀(guān)形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)鑒定為肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）。

圖2 采集野生肺形側(cè)耳菌株的ITS區(qū)域堿基序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L［9］。

取7 mm菌塊接入上述培養(yǎng)基平皿正中，每組4個(gè)平行，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。參照高洋等[10]的方法，每天觀(guān)察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)量，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。

1.2.2 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)

培養(yǎng)基配方同1.2.1。分別用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度，pH 分別為5、6、7、8、9，共5 組，每組4 個(gè)平行。接種后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)考察方法同1.2.1。

1.3 碳源試驗(yàn)

試驗(yàn)用碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、淀粉。培養(yǎng)基中其他成分同溫度試驗(yàn)，每組4個(gè)平行。接種后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)考察方法同1.2.1。

1.4 氮源試驗(yàn)

試驗(yàn)用氮源分別為酵母浸粉、尿素、蛋白胨、硝酸銨。培養(yǎng)基中其他成分同溫度試驗(yàn)，每組4 個(gè)平行。接種后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)考察方法同1.2.1。

1.5 栽培試驗(yàn)

栽培料配方為：木屑68%，棉籽殼20%，麩皮10%，白砂糖1%，石膏粉1%。料含水量為60%～65%。

取15 cm×30 cm 聚丙烯袋，裝入攪拌均勻的濕料約800g。共4 袋，121 ℃滅菌2 h。取5 個(gè)7 mm的菌塊接入料袋，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)袋后，移入溫室大棚，溫度20～25 ℃、空氣相對(duì)濕度95%催蕾。記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋的天數(shù)，采收子實(shí)體，計(jì)算生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1 可知，試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲在15～40 ℃均可生長(zhǎng)。不同試驗(yàn)溫度的菌絲平均生長(zhǎng)速度排序：25 ℃＞30 ℃＞35 ℃＞20 ℃＞40 ℃＞15 ℃。不同溫度培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)速度均呈現(xiàn)出顯著性差異。培養(yǎng)溫度為25 ℃、30 ℃時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)濃密?？梢?jiàn)在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)25 ℃為該肺形側(cè)耳菌株菌絲培養(yǎng)最適溫度，30 ℃次之。

表1 培養(yǎng)溫度對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 pH對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2 可知，在pH5～9 培養(yǎng)基上試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲均可生長(zhǎng)，供試pH 間菌絲平均長(zhǎng)速有差異。試驗(yàn)pH 培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速排序：pH6＞pH7＞pH8＞pH9＞pH5。pH6 與pH5，pH7 與pH5，pH8與pH5，pH6 與pH8，pH6 與pH9，pH7 與pH9 培養(yǎng)基中的菌絲平均長(zhǎng)速有顯著的差異，pH6 與pH7 培養(yǎng)基中的菌絲平均長(zhǎng)速差異不顯著。所有菌絲長(zhǎng)勢(shì)均較密?？梢?jiàn)在試驗(yàn)pH 范圍內(nèi)，培養(yǎng)基最適pH 為6～7。

表2 pH對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3 供試碳源對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表3 可知，試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株在試驗(yàn)用5 種碳源培養(yǎng)基上菌絲均可生長(zhǎng)，不同碳源的培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速有差異。試驗(yàn)碳源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度排序：淀粉＞蔗糖＞甘露醇＞葡萄糖＞乳糖。蔗糖與甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速差異不顯著。淀粉與其他4 種碳源，蔗糖與乳糖、葡萄糖，甘露醇與葡糖糖、乳糖，葡萄糖與乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速差異顯著；乳糖為碳源培養(yǎng)基上菌絲相比其他碳源稀疏?？梢?jiàn)試驗(yàn)最適碳源為淀粉，蔗糖、甘露醇次之。

表3 供試碳源對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 供試氮源對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4 可知，試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株在供試氮源培養(yǎng)基上菌絲均可生長(zhǎng)，不同氮源的培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速有差異。試驗(yàn)氮源培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速排序：蛋白胨＞酵母浸粉＞硝酸銨＞尿素。蛋白胨與酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速差異不顯著，硝酸銨與尿素，蛋白胨與尿素，酵母浸粉與尿素為氮源的培養(yǎng)基上菌絲平均長(zhǎng)速均呈顯著性差異；硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲比其他氮源稀疏。蛋白胨為試驗(yàn)最佳氮源。

表4 供試氮源對(duì)試驗(yàn)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 栽培結(jié)果

栽培袋接種28 d 后菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)袋，繼續(xù)培養(yǎng)3d后形成原基，5 d 后形成子實(shí)體，即可采摘（圖3）。第一潮子實(shí)體鮮重268.5 g，在50 ℃條件下烘干至恒重，得到子實(shí)體干重39.6 g，生物學(xué)效率為86.06%。肺形側(cè)耳野生子實(shí)體與人工袋栽子實(shí)體形態(tài)存在顯著差異，應(yīng)為野生環(huán)境刺激肺形側(cè)耳子實(shí)體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖3 人工栽培的肺形側(cè)耳子實(shí)體（左為背面，右為正面）

3 小結(jié)

野生肺形側(cè)耳菌株分離培養(yǎng)菌絲體結(jié)果表明，該菌株菌絲體最適生長(zhǎng)條件：培養(yǎng)溫度為25 ℃、培養(yǎng)基pH6～7、碳源為淀粉、氮源為蛋白胨。菌絲培養(yǎng)最適溫度、最適pH、最適氮源與蘭玉菲等[11]、鐘麗娟等[12]、王廣維等[13]結(jié)果較為一致。尿素作為唯一氮源時(shí)菌絲可以生長(zhǎng)，與鐘麗娟等[12]、王廣維等[13]試驗(yàn)結(jié)果不同。最適碳源與王廣維等[13]獲得結(jié)果一致，與蘭玉菲等[11]、鐘麗娟等[12]得到的結(jié)果不同。試驗(yàn)結(jié)果與前人研究有差異，可能與供試菌株以及基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方差異有一定關(guān)系。

人工栽培長(zhǎng)出的子實(shí)體與野生標(biāo)本子實(shí)體形態(tài)存在顯著差異，更具觀(guān)賞性。