王 強，周真江，曾維友，索化夷*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市江津區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，重慶 402260）

生物胺是一類具有生物活性且含氮的低分子質(zhì)量有機化合物[1]，主要由微生物的氨基酸脫羧酶對氨基酸（組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）的脫羧作用而形成的有機化合物（組胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺）[2]。生物胺對人體具有重要意義，但是攝入過量的生物胺會使得血管擴張，導(dǎo)致人體產(chǎn)生痙攣、腹瀉、心悸、嘔吐、頭痛、血壓不穩(wěn)、呼吸紊亂等不良反應(yīng)，嚴(yán)重時可引起人體中毒[3]，而且部分生物胺過量會危害人體健康。所有生物胺中以組胺毒性最大，酪胺次之，本身毒性不高的尸胺能夠增強前兩者的毒性，其原因在于其可以抑制組胺/酪胺代謝酶[4]。因此，對食品中生物胺進行防控是極為必要的。

生物胺廣泛存在于各類食品中，尤其是在發(fā)酵食品中占比更高[5]。目前對食品中的生物胺進行防控主要從兩方面入手：一是控制食品在生產(chǎn)過程中生物胺的形成，如生產(chǎn)工藝控制[6]、食品添加劑控制[7]、超高壓控制[8]、輻照控制[9]等；二是降解食品在生產(chǎn)過程中已經(jīng)產(chǎn)生的生物胺，如開發(fā)添加具有生物胺氧化酶活性微生物的新型發(fā)酵劑等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，存在許多具有生物胺氧化酶活性的微生物，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）等，同時也有研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物對食品中生物胺進行防控的方法相比其他方法更加切實可行，并且穩(wěn)定安全[11]。生物胺的生物降解技術(shù)已經(jīng)在多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中進行應(yīng)用，如利用植物乳桿菌可以抑制香腸中生物胺的積累[12]，能顯著降低泰國香腸中的生物胺含量[13]；通過添加植物乳桿菌降解葡萄酒發(fā)酵過程中生成的生物胺[14]。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品多為高鹽高酸性食品，本研究擬通過對乳酸菌的生物胺產(chǎn)生活性、降解能力以及對高鹽高酸性環(huán)境耐受能力的篩選，最終得到可以用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的生物胺降解菌株，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品安全性提升提供可靠的備選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實驗中所用的41株乳酸菌為實驗室前期分離純化、鑒定并保藏的菌株，編號為1～41，保藏在西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in the study

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MRS肉湯（固體）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；顯色培養(yǎng)基[15]：NB培養(yǎng)基54 g，磷酸吡哆醛0.05 g，溴甲酚紫0.06 g，6種氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、酪氨酸、精氨酸）各5 g，去離子水1 000 mL，調(diào)pH值至5.2，于121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

磷酸吡哆醛（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；溴甲酚紫（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：重慶川東化工有限公司；尸胺、組胺、酪胺（純度均≥98%）：美國Sigma公司；苯甲酰氯（純度≥98%）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸（純度均≥98%）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；LDZM-60KCS-II型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機械廠；SW-CJ-2F型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GHP-9160型恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；5810型高速低溫離心機：德國Eppendorf公司；PGC-21D型氮吹儀：北京中諾遠東公司；SYNERGYH1MG型全波長酶標(biāo)儀：美國基因公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的活化、鏡檢

將保藏在安瓿管中的乳酸菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min條件下活化24 h，活化后劃線于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察平板上的菌落形態(tài)，并挑取單菌落于載玻片上均勻涂布，革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定菌株為純培養(yǎng)。

1.3.2 菌懸液的制備

試驗所用菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，取10 mL乳酸菌培養(yǎng)液于4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，棄去上清液，用滅菌生理鹽水洗滌兩次，并將其OD600nm值調(diào)節(jié)為0.8，備用[16]。

1.3.3 生物胺合成活性篩選

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液接入到顯色培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，記錄培養(yǎng)基顏色（若為紫色，則菌株初步判定為陽性；若為黃色即不變色，則菌株初步判定為陰性），空白培養(yǎng)基（不接入菌懸液的培養(yǎng)基）作對照組，選取陰性菌株進行進一步研究。

1.3.4 生物胺降解菌株的篩選

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液接種于含三種生物胺（酪胺、腐胺、組胺）各500 μg/mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，以空白培養(yǎng)基（不接入菌懸液的培養(yǎng)基）為對照組，分別取1 mL菌液加入4 mL 0.1 mol/L HCl溶液中斷菌株生長繁殖后，測定生物胺的含量，計算各菌株的生物胺降解率[17]，其計算公式如下：

式中：W0為對照組中生物胺的含量，μg/mL；W1為實驗組中生物胺的含量，μg/mL。

1.3.5 生物胺含量的測定[18]

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確稱取尸胺、組胺、酪胺各50 mg，用0.1 mol/L HCl溶液定容至50 mL，制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別取上述生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1 mol/L HCl溶液配制成質(zhì)量濃度分別為1.0 μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的3種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后進行柱前衍生處理后上機檢測，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）柱前衍生

2 mL三種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液、10 μL苯甲酰氯標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后旋渦振蕩30 s，30 ℃水浴條件下避光反應(yīng)40 min，期間每隔10 min振蕩一次。反應(yīng)結(jié)束后用2 mL飽和NaCl溶液中斷反應(yīng)。然后用3 mL乙醚萃取，1 200 r/min離心10 min，用移液槍移取乙醚層，重復(fù)萃取操作兩次，35 ℃氮氣吹干，最后用1 mL甲醇（色譜級）溶解，微濾（0.22 μm）后置于1 mL的液相小瓶中，于4 ℃下保存、待測。

（3）HPLC分析

對比濃縮前后鹵水和透過液的組成，透過液的K，Na，Mg含量占原鹵水含量的百分比分別為0.020 8%，0.016 70%，0.008 45%，說明膜蒸餾對鹵水濃縮有顯著的影響，鹵水中的鹽幾乎截留在了膜的進料側(cè)。測得鹵水濃縮后的透過液的電導(dǎo)率是0.048～1.682 ms/cm，對比純凈水的電導(dǎo)率是 0～10 μs/cm，飲用水的電導(dǎo)率是 0～50 μs/cm，一般家用自來水的電導(dǎo)率為125～1 250 μs/cm，實驗表明：膜蒸餾實驗得到的透過液達到生活用水的標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)錢茜茜等[19]的實驗方法略作修改，色譜柱為Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為超純水，流動相B為甲醇，紫外檢測波長為254 nm，進樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min，采用梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.3.6 生物胺降解菌株耐鹽性能測定

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液接種于含不同NaCl（0、5%、7%、9%、11%）的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值），以不含NaCl且不接種菌的MRS肉湯培養(yǎng)基為空白對照，計算各菌株在不同NaCl含量條件下的生長效率[16]，其計算公式如下：

式中：A0為空白對照組的OD600nm值；A1為不含NaCl培養(yǎng)液的OD600nm值；A2為含不同濃度NaCl培養(yǎng)液的OD600nm值。

1.3.7 pH值對生物胺降解菌株生長的影響

以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液分別接入到pH分別為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值），以不接種菌的MRS肉湯培養(yǎng)基為空白對照，以O(shè)D600nm值評價菌株的耐酸能力[20]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3次測定，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”（X±SD）表示，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有無生物胺合成活性乳酸菌的確認(rèn)

在不利于自身生長繁殖的環(huán)境（即酸度略高、營養(yǎng)匱乏等環(huán)境）下，為了維持自身生長繁殖，具有氨基酸脫羧酶活性的乳酸菌受脅迫機制調(diào)控將氨基酸脫羧形成相應(yīng)的生物胺（一種堿性物質(zhì)）來改善環(huán)境，從而有利于自身生長繁殖[21]。溴甲酚紫在酸性條件下顯示黃色，可初步判斷菌株不具有氨基酸脫羧酶活性即為不產(chǎn)生物胺的陰性菌株，在堿性條件下顯示紫色，可初步判斷菌株具有氨基酸脫羧酶活性即為產(chǎn)生物胺的陽性菌株[22]。根據(jù)液體培養(yǎng)基的顯色情況從41株乳酸菌株中初步篩選出了9株陰性菌株，分別為菌株2、4、10、21、27、28、29、30、40，其余32株菌株均為陽性菌株。

2.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)液的高效液相色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

3種生物胺（組胺、酪胺、尸胺）標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

圖1 3種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 3 biogenic amines standard

由圖1可知，3種生物胺（組胺、酪胺、尸胺）在高效液相色譜上出峰速度快，分離明顯，20 min內(nèi)全部出峰，分別為尸胺在7.1 min左右出峰，組胺在16.7 min左右出峰，酪胺在18.9 min作左右出峰，故此方法對分離檢測生物胺具有良好的效果。

表3 3種生物胺的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear regression equation and correlation coefficient of 3 biogenic amines

由表3可知，3種生物胺（組胺、酪胺、尸胺）的峰面積與其對應(yīng)質(zhì)量濃度分別呈現(xiàn)良好正相關(guān)的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.992 0，說明該方法能夠可靠的定量分析這3種生物胺。

2.3 生物胺降解菌株的篩選

在顯色實驗初步篩選的基礎(chǔ)上，采用HPLC法定量檢測生物胺，從而保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性，對菌株降解生物胺的能力做出準(zhǔn)確的評價。根據(jù)9株陰性菌株的生物胺含量測定結(jié)果，計算出3種生物胺的降解率，結(jié)果見表4。

表4 9株乳酸菌菌株對生物胺的降解作用Table 4 Degradation of biogenic amines by 9 strains of lactic acid bacteria

由表4可知，9株陰性菌株降解生物胺的能力各不相同，且差異較大，其中菌株40（嗜酸乳桿菌）對組胺和酪胺無降解能力，有組胺和酪胺合成能力，說明菌株40產(chǎn)酸能力強于生物胺生成能力。菌株27（戊糖乳桿菌）對尸胺的降解能力最強，達到了63.11%；菌株2（發(fā)酵乳桿菌）對組胺的降解能力最強，達到了82.95%；菌株30（植物乳桿菌）對酪胺的降解能力最強，達到了89.97%。菌株2、4、27、28、30對3種生物胺的降解能力均＞50%，其中，菌株30（植物乳桿菌）對3種生物胺均有較好的降解能力，分別為62.42%（尸胺）、74.32%（組胺）、89.97%（酪胺），是一株較理想的高效生物胺降解菌株。生物胺測定實驗結(jié)果表明，同一種屬不同菌株的乳酸菌，其生物胺降解能力不同，因此，其生物胺降解能力僅具有菌株特異性，而不具有種屬特異性[23]。故選取菌株2、4、27、28、30進行后續(xù)實驗。

2.4 生物胺降解菌株的耐鹽性能篩選

我國大部分發(fā)酵食品具有高鹽高滲透壓的環(huán)境，因此若想將生物胺降解菌株運用于發(fā)酵食品中就需要菌株能夠適應(yīng)高鹽高滲透壓的環(huán)境[24]。對5株生物胺降解效果較好的菌株進行耐鹽試驗，測定其在不同鹽含量下的生長效率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，對于5株菌，其環(huán)境中的NaCl含量與生長情況呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)NaCl含量為7%時，菌株4和27幾乎不生長；當(dāng)NaCl含量為9%時，菌株2幾乎不生長；當(dāng)NaCl含量為11%時，菌株28、30仍有一定的耐鹽能力，生長效率分別為4.50%和4.31%。故選取菌株28、30進行后續(xù)實驗。

圖2 5株菌株在不同鹽含量下的生長效率Fig.2 Growth efficiency of 5 strains under different salt concentrations

2.5 pH值對生物胺降解菌株生長的影響

合適的pH值是乳酸菌正常生長代謝以及降解生物胺的必備條件[25]，因為只有在一定的pH環(huán)境下生物胺氧化酶才能夠有效的發(fā)揮作用，因此若想將生物胺降解菌株運用于發(fā)酵食品中生長良好就需要探究菌株適宜的pH環(huán)境?？疾靝H值對2株優(yōu)良乳酸菌（菌株28、30）生長的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株28的最佳生長pH值為5.5～7.5，菌株30的最佳生長pH值為5.5～8.5；當(dāng)pH值為4.5時，兩株菌仍具有良好的生長能力，菌株30的生長能力強于菌株28。因此，菌株30的耐酸性最好。

圖3 篩選菌株不同pH值下的生長情況Fig.3 Growth situation of selected strains in different pH conditions

3 結(jié)論

從41株乳酸菌中篩選得到5株高效降解生物胺的菌株，其中以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）30的生物胺降解能力最好，其對3種生物胺的降解率分別為74.32%（組胺）、89.97%（酪胺）、62.42%（尸胺），在含鹽量0～9%和pH值為4.5～8.5環(huán)境中能夠較好的生長繁殖。該菌株無生物胺生成活性，并同時具備生物胺降解能力和耐鹽耐酸能力，可以作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品生物胺降解備選菌株，用于提高傳統(tǒng)發(fā)酵食品安全性。