浙江省醫(yī)療器械檢驗研究院 （浙江 杭州 310018）

內(nèi)容提要：闡述了對于動物源性醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)評價的思考。主要介紹了動物源性醫(yī)療器械的種類以及關(guān)于動物源性醫(yī)療器械的國內(nèi)外法規(guī)，同時詳細(xì)介紹分析了動物源性醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)評價的具體檢測方法，同時對動物源性醫(yī)療器械免疫學(xué)評價進(jìn)行總結(jié)和展望。

“動物源性醫(yī)療器械”顧名思義，說明其生產(chǎn)過程采用的材料是動物來源的。在醫(yī)療器械生產(chǎn)、制造、加工、設(shè)計中，動物源性醫(yī)療器械因其使用的材料都是動物組織及其衍生物來源的，而動物源性材料的來源便捷，其研發(fā)生產(chǎn)逐漸成為熱點，臨床使用也越來越常見[1]。雖然動物源性醫(yī)療器械材料相比非動物源性材料在生物相容性方面表現(xiàn)優(yōu)異，且動物源性醫(yī)療器械的使用也越來越常見，但在臨床應(yīng)用的安全性方面也不得不重視，因為其存在一定不可控風(fēng)險性，需要進(jìn)行評價思考，包括其中的微生物以及細(xì)胞類物質(zhì)的污染擴散，以及超敏熱原帶來的特殊刺激反應(yīng)和免疫相關(guān)的毒理學(xué)反應(yīng)等[2]。同時，動物源性醫(yī)療器械在生產(chǎn)加工過程中會出現(xiàn)殘留的組織蛋白、抗原和核酸等物質(zhì)，同時也可能會有其他特別的物質(zhì)影響人體免疫系統(tǒng)發(fā)揮其功能，這些物質(zhì)會引起的免疫系統(tǒng)反饋功能，也會發(fā)生排異反應(yīng)或者免疫毒理學(xué)反應(yīng)，如人體受刺激與功能損傷等。因此，動物源性醫(yī)療器械需要對其免疫毒理學(xué)進(jìn)行評價試驗。本文就動物源性醫(yī)療器械在免疫毒理學(xué)的評價做一思考與探討。

1.動物源性醫(yī)療器械

動物源性醫(yī)療器械材料是動物源性來源的，所以其種屬相對來說比較廣泛，包括鼠、兔、牛、羊、豬等動物。這些材料構(gòu)成的醫(yī)療器械主要有[2-4]：①心臟或組織等的修補材料，如豬心包膜、心臟以及組織補片等；②植入類材料：如人工骨組織、骨修復(fù)相關(guān)材料、骨填充相關(guān)材料等；③眼科類材料，如角膜（異體源）、眼內(nèi)充填動物源性材料等；④接觸式人工器官，如人工皮膚等；⑤可吸收性止血以及防粘連相關(guān)材料，如醫(yī)用生物蛋白膠、醫(yī)用透明質(zhì)酸等；⑥縫合線類材料，如醫(yī)用可吸收縫合線、羊腸線等。

同時動物源性醫(yī)療器械還包括醫(yī)療器械制造產(chǎn)品過程中使用的生物學(xué)涂層（如肝素、膠原等），或一些相關(guān)的生物性輔助材料（如牛脂、牛血清蛋白、新生牛以及胎牛血清、生物酶、培養(yǎng)基等）[2-4]。

2.動物源性醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)評價的相關(guān)法規(guī)

2.1 國外相關(guān)法規(guī)對動物源性醫(yī)療器械指導(dǎo)原則

美國FDA于1998年發(fā)布了醫(yī)療器械審評和行業(yè)指南，對動物源性醫(yī)療器械有一個指導(dǎo)性的行業(yè)指南[5]。又于1999年發(fā)布了《免疫毒理學(xué)試驗指導(dǎo)原則》[6]，針對各種材料在與人體接觸過程涉及的不同途徑和不同的時間，給出了免疫毒理學(xué)評價的指導(dǎo)原則和意見，并提出了可供參考的評價試驗方法。同時，ASTMF 1905[7]給出了材料免疫毒性檢測試驗的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)范，ASTM F 1906[8]也規(guī)定了以下免疫學(xué)試驗的技術(shù)規(guī)范的具體試驗方法，包括酶聯(lián)免疫吸附測定免疫球蛋白以及補體試驗、淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗以及淋巴細(xì)胞遷移試驗。而免疫毒理學(xué)指導(dǎo)原則中最重要的是ISO 10993-20[9]，該標(biāo)準(zhǔn)對免疫學(xué)評價試驗有了進(jìn)一步的完善，有了基本的免疫毒理學(xué)評價框架，各項指標(biāo)的指南指導(dǎo)意見，但是只含有一些技術(shù)評價參考圖，未給出具體的免疫學(xué)試驗方法。

2.2 國內(nèi)相關(guān)法規(guī)對動物源性醫(yī)療器械指導(dǎo)原則

我國于2009年，根據(jù)ISO 22442轉(zhuǎn)化的YY/T 0771[10-13]動物源性醫(yī)療器械系列對動物源性醫(yī)療器械的風(fēng)險分析和管理都做了嚴(yán)格的規(guī)定。其中，第1部分包含風(fēng)險管理應(yīng)用，第2部分包含來源、收集與處置的控制，第3部分包含病毒和傳播性海綿狀腦?。═SE）因子去除與滅活的確認(rèn)，第4部分包含TSE因子去除與滅活原則及其驗證試驗。然而這一系列標(biāo)準(zhǔn)僅在第一部分規(guī)定了鑒別動物源性醫(yī)療器械相關(guān)的危害與危害情況的判定，對所產(chǎn)生風(fēng)險的評價、控制和管理，以及在管理控制的基礎(chǔ)上進(jìn)行有效性的監(jiān)視，除此以外，其他幾部分都側(cè)重動物源性醫(yī)療器械在生產(chǎn)、制造、加工過程中微生物的去除以及防控管理的試驗方法確認(rèn)，對免疫毒理學(xué)試驗評價并未涉及。

同時我國于2014年，根據(jù)ASTM標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的免疫毒理學(xué)試驗方法，發(fā)布了YY/T 0606[14-16]組織工程醫(yī)療產(chǎn)品系列標(biāo)準(zhǔn)，其中第14、15、20部分，分別給出了用酶聯(lián)免疫吸附測定免疫球蛋白以及補體試驗、淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗以及淋巴細(xì)胞遷移試驗的具體方法。而YY/T 0606組織工程醫(yī)療產(chǎn)品系列標(biāo)準(zhǔn)的第25部分《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品—動物源性生物材料DNA殘留量測定法—熒光染色法》[17]該標(biāo)準(zhǔn)細(xì)闡述了動物源性醫(yī)療器械材料殘留DNA的定量檢測方法。

在2015年，我國發(fā)布的GB/T 16686.20《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第20部分：醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗原則和方法》[18]，其等同轉(zhuǎn)化自ISO 10993-20，該標(biāo)準(zhǔn)對免疫毒理學(xué)評價有進(jìn)一步的改善，對一些免疫學(xué)功能性和非功能性指標(biāo)的評價有了基本的框架，但未給出具體的試驗方法。

在2017年，我國又發(fā)布了YY/T 1465《醫(yī)療器械免疫原性評價方法》[19-22]系列標(biāo)準(zhǔn)，其中，第1、2、3、5部分分別規(guī)定了體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的MTT法和CFSE法，用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清免疫球蛋白和補體成分的方法，適用瓊脂固相法測定空斑形成細(xì)胞的方法，適用于評價醫(yī)療器械（或材料）對人體體液免疫功能的影響，α-Gal抗原清除率的方法，這一系列標(biāo)準(zhǔn)給出了免疫毒理學(xué)評價的具體方法，這一系列標(biāo)準(zhǔn)是對GB/T 16686.20補充以及免疫毒理學(xué)評價可參考的依據(jù)。

對于動物源性醫(yī)療器械，我國還在2017年發(fā)布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品動物源性支架材料的殘留α-Gal抗原檢測》（YY/T 1561-2017）[23]，該標(biāo)準(zhǔn)為進(jìn)一步評價免疫原性殘留物提供可參考的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

3.動物源性醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)評價具體試驗

3.1 DNA殘留量測定

我國于2014年頒布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品第25部分：動物源性生物材料DNA殘留量測定法：熒光染色法》（YY/T 0606.25-2014）[17]，該標(biāo)準(zhǔn)為動物源性醫(yī)療器械測定DNA殘留量提供方法。眾所周知，為了更好地去除異種免疫原性，同時減少免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)，動物源性醫(yī)療器械的材料所采用的組織基質(zhì)類材料大都是經(jīng)過脫細(xì)胞處理的。因此，DNA殘留量檢測是動物源性醫(yī)療器械組織基質(zhì)類生物材料進(jìn)行工藝評價的重要指標(biāo)之一[17]。藥典中雖有涉及可參考的DNA殘留量檢測方法，但不全適用于醫(yī)療器械檢測，因為動物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品大都是固體或者凝膠類的材料，這些材料只有經(jīng)過樣品前處理，處理完后，殘留的DNA得到釋放，釋放之后方可進(jìn)行含量檢測試驗。另外，由于組織基質(zhì)類材料的主要成分是基質(zhì)纖維蛋白，雖然經(jīng)過了充分的消化，但是基質(zhì)纖維蛋白一定仍有殘留，其殘留量對檢測DNA殘留量依舊有很大的干擾，因此需要通過純化提取殘留的DNA的方式，減少干擾之后再進(jìn)行DNA殘留量的測定[17]。因此常常采用的步驟是先用酶來分解組織基質(zhì)，釋放出基質(zhì)中含有的DNA，之后進(jìn)行DNA純化以及提?。ㄔ黾踊厥章蕦嶒灒?，最后在通過熒光染色法進(jìn)行DNA含量的測定[24]。

根據(jù)YY/T 0606.25-2014[17]可知，DNA殘留量是細(xì)胞基質(zhì)類生物材料進(jìn)行脫細(xì)胞工藝的評價指標(biāo)，為了降低DNA殘留不建議使用核酸分解酶，雖然異種來源的核酸本身會引起一些免疫排斥反應(yīng)，但不是主要的風(fēng)險因素。該方法雖降低了核酸的殘留，排除了核酸的免疫排斥反應(yīng)，但不能減少其他細(xì)胞成分的殘留，以及蛋白層面的殘留，達(dá)不到降低整體免疫排斥反應(yīng)的目的，反而有可能引入了核酸分解酶試劑中的一些其他風(fēng)險物質(zhì)。而對于DNA殘留量的安全限值制定，需要考慮很多因素，比如材料的來源、材料的成分、材料的劑量、材料與人體接觸的部位、材料是否易降解等，同時結(jié)合免疫原性殘留物的風(fēng)險評估和風(fēng)險控制等因素，共同來確定DNA殘留量限量值[17]。

因此，動物源性醫(yī)療器械把DNA殘留量測定作為一項必檢項目，用以評價產(chǎn)品生產(chǎn)、制造、加工、設(shè)計過程的有效性、安全性和質(zhì)量控制。

3.2 α-Gal抗原殘留檢測

動物源性材料在植入人體內(nèi)后，對于人體是一種異源性物質(zhì)，其表面的α-Gal抗原極易與人體內(nèi)已經(jīng)存在的抗α-Gal抗體結(jié)合，這種結(jié)合會立即激活人體免疫系統(tǒng)，引起嚴(yán)重的人體異源性排斥反應(yīng)，植入因此而失敗[25]。與此同時還會產(chǎn)生一些長期慢性的局部免疫反應(yīng)，導(dǎo)致了植入的動物源性材料會出現(xiàn)纖維化，形成包囊，最后以填充在局部組織的異物形式存在，使得組織再生和重塑變得不可能達(dá)成。

α-Gal抗原本質(zhì)上就是一種蛋白或脂類物質(zhì)，這種抗原在許多哺乳動物組織都有表達(dá)，如大鼠、兔、牛、羊和豬等[23,26-30]。國外在有研究報道于1984年，首次發(fā)現(xiàn)在正常人體血清中存在能與α-Gal特異結(jié)合的抗體，即抗α-Gal抗體，由于動物源性材料含有Gal抗原，當(dāng)人體接受含有Gal抗原的異種材料植入組織時，會導(dǎo)致一系列免疫排斥反應(yīng)或長期或慢性[31,32]。因此，把α-Gal抗原作為免疫毒理學(xué)評價指標(biāo)，用于評價動物源性醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險控制主要方法。

α-Gal抗原檢測方法主要有，免疫組織化學(xué)法和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量檢測兩種。而行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品動物源性支架材料的殘留α-Gal抗原檢測》（YY/T 1561-2017）規(guī)定了α-Gal抗原檢測試劑盒，同時采用的是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量檢測，減少評價過程中的風(fēng)險[23]。

3.3 其他免疫風(fēng)險指標(biāo)檢測

由于動物源性醫(yī)療器械易出現(xiàn)各個免疫指標(biāo)的殘留風(fēng)險，因此需對動物源性醫(yī)療器械的免疫毒理性殘留風(fēng)險進(jìn)行評價。采用免疫毒理學(xué)常用的評價方法。

3.3.1 免疫系統(tǒng)評價

主要觀察免疫系統(tǒng)中的組織，如胸腺和脾臟等的器官，細(xì)胞學(xué)（如B、T細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群分析）和免疫相關(guān)臟器重量變化。同時包括血常規(guī)檢測以及血生化指標(biāo)檢測。以上各個指標(biāo)用于評價總體的免疫系統(tǒng)功能[18]。

3.3.2 免疫功能學(xué)檢測

功能性檢測主要包括非特異性和特異性免疫功能，其中非特異性免疫包括NK細(xì)胞殺傷活性，特異性免疫包含體液免疫和細(xì)胞免疫[18]。具體如下：①NK細(xì)胞殺傷活性測定主要通過提取脾臟或者外周血NK細(xì)胞來進(jìn)行試驗，從而觀察其對敏感腫瘤細(xì)胞（小鼠YAC-1細(xì)胞株或人體K562細(xì)胞株)的殺傷作用。常用的方法有MTT法、乳酸脫氫酶（LDH）釋放法以及流式細(xì)胞檢測殺傷率的方法[33]。②體液免疫功能評價主要通過觀察抗體形成細(xì)胞數(shù)或抗體生成量來評價體液免疫功能，試驗方法有空斑形成細(xì)胞（Plaque Forming Cell，PFC）試驗、免疫電泳法、ELISA法等[14,20,21]。③細(xì)胞免疫功能評價主要以T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗進(jìn)行，其中的檢測方法主要采用MTT以及流式細(xì)胞CFSE染色法[15]。

4.小結(jié)與展望

本文介紹了對于動物源性醫(yī)療器械毒理學(xué)評價的一些國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)，以及具體的免疫毒理學(xué)評價試驗方法，為評價動物源性醫(yī)療器械有效性、安全性以及質(zhì)量控制評價提供可以參考的依據(jù)?，F(xiàn)頒布的標(biāo)準(zhǔn)仍然不足以充分地達(dá)到對動物源性醫(yī)療器械風(fēng)險與質(zhì)量控制，還需要考慮更全面評價，包括細(xì)胞膜成分如磷酸酯等物質(zhì)的含量檢測，殘留細(xì)胞核酸的染色，以及其他殘留的蛋白分子RNA等的定量檢測等。動物源性醫(yī)療器械還需要檢測微生物以及病毒指標(biāo)，從而更好地達(dá)到風(fēng)險控制的目的。同時在免疫毒理學(xué)評價方面，如非特異性免疫中的NK細(xì)胞殺傷作用也沒有具體可以參考的標(biāo)準(zhǔn)和具體可以實施的方法，因此對于動物源性醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)評價技術(shù)、方法、標(biāo)準(zhǔn)的完善道路依舊任重道遠(yuǎn)。