朱銀川，王豐云，楊雁華，宿東升，湯建民

心肌細(xì)胞凋亡參與了多種心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展，如心肌梗死、心力衰竭及心律失常等；因此抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)正常心肌細(xì)胞功能對治療多種心血管疾病有重要意義[1,2]。研究表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）與心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)[3]。研究報道LINC00265是缺血性卒中重要的lncRNAs生物標(biāo)志物[4]。LINC00265在急性心肌梗死患者中上調(diào)表達(dá)[5]。LINC00265通過使miR-let-7a變海綿促進(jìn)血管炎癥和腹主動脈瘤的形成[6]。然而LINC00265對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、增殖的影響及其機(jī)制尚不清楚。微小RNA（miRNA）是一類有調(diào)控功能的小分子非編碼RNA，miRNA與心血管疾病密切相關(guān)，參與了心肌肥厚、心肌纖維化、動脈粥樣硬化等，可作為一種生物標(biāo)記物，為疾病診斷與治療提供新依據(jù)[7]。研究報道m(xù)iR-485-5p過表達(dá)可阻止苯腎上腺素誘導(dǎo)的線粒體裂變和心肌肥大[8]。因此本實驗旨在研究LINC00265對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、增殖的影響及其機(jī)制是否與miR-485-5p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 心肌細(xì)胞H9C2購自無錫欣潤生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本Takara公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司；抗體購自武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司。

1.2 分組 將H9C2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細(xì)胞H9C2，將其置于含95%N2和5%CO2的培養(yǎng)箱中缺氧處理3 h，然后于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，記為模型組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。將LINC00265干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理，記為模型組+si-LINC00265組；將LINC00265干擾質(zhì)粒陰性對照轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理，記為模型組+si-NC組；將miR-485-5p模擬物轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理，記為模型組+miR-485-5p組；將miR-485-5p模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理，記為模型組+NC組。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測LINC00265和miR-485-5p的表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明配制反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR，循環(huán)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達(dá)量用 2-△△Ct法計算。LINC00265和miR-485-5p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，LINC00265上游引物序列：5"-GG AAGAGAGACTGACTGGGC-3"，下游引物序列：5"-GTTTCGCTGTCACCCCTCTG-3"；GAPDH上游引物序列：5"-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3"，下游引物序列：5"-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCA GT-3"；miR-485-5p上游引物序列：5"-ACACTCC AGCTGGGAGAGGCTGGCCGTGATGAATTC-3"，下游引物序列：5"-CTCGATTCGTCACTCACA-3"；U6上游引物序列：5"-CGCTTCGGCAGCACATATACT A-3"，下游引物序列：5"-CGCTTCACGAATTTGCG TGTCA-3"。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，離心沉淀細(xì)胞，棄上清；然后重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷的80%乙醇，4℃固定過夜；用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入核糖核酸酶A（RNase A），37℃孵育30 min，加入碘化啶（PI）染色液，4℃染色15 min，上機(jī)檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染48 h后生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，PBS漂洗細(xì)胞2次，吸棄PBS液，加1～2 ml胰酶消化細(xì)胞使之脫壁，然后加入結(jié)合緩沖液終止消化，制成細(xì)胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，輕搖混勻，常溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測Ki67、Caspase3蛋白表達(dá) 用放射免疫沉淀分析裂解液（RIPA）提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照40 μg/孔上樣蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，洗膜，加入稀釋好的一抗（1:500），室溫?fù)u床孵育2 h，倒掉一抗，加入按照1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，暗室下顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.7 雙熒光素酶報告實驗驗證LINC00265和miR-485-5p的靶向關(guān)系 使用PCR擴(kuò)增包含miR-485-5p結(jié)合位點的LINC00265序列片段，并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得LINC00265野生型載體（WT-LINC00265），將LINC00265序列 CAGCCTCT突變?yōu)镚CCAAGAA，獲得LINC00265突變型載體（MUT-LINC00265），將WTLINC00265、MUT-LINC00265分別與miR-NC、miR-485-5p用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差χ2表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測LINC00265和miR-485-5p的表達(dá) 與對照組比較，模型組LINC00265表達(dá)水平升高，miR-485-5p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組+si-NC組比較，模型組+si-LINC00265組LINC00265表達(dá)水平降低，miR-485-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組+miR-NC組比較，模型組+miR-485-5p組LINC00265表達(dá)水平降低，miR-485-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05）（表1）。

表1 LINC00265和miR-485-5p在缺氧誘導(dǎo)的H9C2中的表達(dá)（±s，n=3）

表1 LINC00265和miR-485-5p在缺氧誘導(dǎo)的H9C2中的表達(dá)（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與模型組+si-NC比較，cP＜0.05；與模型組+miR-NC比較，dP＜0.05

分組 LINC00265 miR-485-5p對照組 0.98±0.07 1.00±0.06模型組 3.23±0.11a 0.23±0.02a模型組+si-NC 3.27±0.11a 0.23±0.02a模型組+si-LINC00265 1.84±0.09abc 0.62±0.04abc模型組+miR-NC 3.26±0.09a 0.24±0.02a模型組+miR-485-5p 1.43±0.08abd 0.83±0.04abd F值 378.171 262.328 P值 0.000 0.000

2.2 細(xì)胞周期的檢測 與對照組比較，模型組G0-G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低（P＜0.05）；與模型組+si-NC組比較，模型組+si-LINC00265組G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高（P＜0.05）；與模型組+miR-NC組比較，模型組+miR-485-5p組G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高（P＜0.05）；各組間G2-M期細(xì)胞所占比例無顯著變化（P＞0.05）（表2）。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響 與對照組比較，模型組G0-G1期細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組+si-NC組比較，模型組+si-LINC00265組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與模型組+miR-NC組比較，模型組+miR-485-5p組G0-G1期細(xì)胞細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）（圖1，表3）。

2.4 Western Blotting檢測干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2中Ki67、Caspase3的影響 與對照組比較，模型組G0-G1期Ki67表達(dá)水平降低，Caspase3表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組+si-NC組比較，模型組+si-LINC00265組Ki67表達(dá)水平升高，Caspase3表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組+miR-NC組比較，模型組+miR-485-5p組Ki67表達(dá)水平升高，Caspase3表達(dá)水平降低（P＜0.05）（圖2，表4）。

表2 干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

表2 干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

注： G1：DNA合成前期；S：DNA合成期；G2：DNA合成后期；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與模型組+si-NC比較，cP＜0.05；與模型組+miR-NC比較，dP＜0.05

分組 G0-G1 S G2-M對照組 33.58±1.03 33.50±0.94 32.92±1.03模型組 44.22±0.96a 23.36±0.63a 32.42±1.11模型組+si-NC 44.37±0.87a 23.29±0.64a 32.34±0.91模型組+si-LINC00265 38.45±0.84abc28.85±0.75abc32.70±0.75模型組+miR-NC 44.53±0.70a 23.27±0.59a 32.20±0.64模型組+miR-485-5p 36.41±0.69abd31.13±0.58abd32.46±0.87 F值 92.653 126.651 0.252 P值 0.000 0.000 0.931

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9C2凋亡率

表3 干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響（ ±s，n=3）

表3 干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響（ ±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與模型組+si-NC比較，cP＜0.05；與模型組+miR-NC比較，dP＜0.05

分組 凋亡率（%）對照組 7.47±0.48模型組 22.53±1.03a模型組+si-NC 22.60±0.98a模型組+si-LINC00265 images/BZ_113_1690_1559_1690_1564.png16.16±0.70abc模型組+miR-NC 22.62±0.87a模型組+miR-485-5p 11.84±0.58abd F值 198.473 P值 0.000

圖2 Western Blotting檢測Ki67、Caspase3蛋白的表達(dá)

2.5 LINC00265靶向miR-485-5p Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示LINC00265與miR-485-5p存在互補(bǔ)的核苷酸序列（圖3）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，WT-LINC00265與miR-485-5p共轉(zhuǎn)染后，與miR-NC共轉(zhuǎn)染后相比，細(xì)胞熒光活性降低（P＜0.05）；MUT-LINC00265與miR-485-5p共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光活性無顯著變化（P＞0.05）（表5）。

3 討論

表4 干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2中Ki67、Caspase3的影響（±s，n=3）

表4 干擾LINC00265和過表達(dá)miR-485-5p對缺氧誘導(dǎo)的H9C2中Ki67、Caspase3的影響（±s，n=3）

注：Ki67：核增殖抗原；Caspase3：半光酰天冬氨酸特異性蛋白酶3；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與模型組+si-NC比較，cP＜0.05；與模型組+miR-NC比較，dP＜0.05

分組 Ki67 Caspase3對照組 0.70±0.05 0.19±0.01模型組 0.15±0.02a 0.69±0.04a模型組+si-NC 0.14±0.02a 0.70±0.05a模型組+si-LINC00265 0.42±0.03abc 0.34±0.02abc模型組+miR-NC 0.14±0.01a 0.70±0.04a模型組+miR-485-5p 0.57±0.03abd 0.25±0.02abd F值 210.415 162.264 P值 0.000 0.000

圖3 LINC00265靶向miR-485-5p

表5 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=3）

表5 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=3）

注：WT-LINC00265：野生型LINC00265；MUT-LINC00265：突變型LINC00265

分組 WT-LINC00265 MUT-LINC00265 miR-NC 0.96±0.07 0.98±0.08 miR-485-5p 0.29±0.02 0.97±0.04 t值 15.940 0.194 P值 0.000 0.856

缺氧是造成心肌細(xì)胞凋亡的重要原因，而心肌細(xì)胞凋亡引起的心肌損傷是缺血性心肌病發(fā)生的重要機(jī)制；深入研究缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，對相關(guān)疾病的治療具有一定參考意義[9,10]。研究表明lncRNA可參與調(diào)控缺血性心肌病的發(fā)生和發(fā)展，有望成為心血管疾病的新型診斷學(xué)標(biāo)記物或藥物治療靶點[11]。已有研究表明，LINC00265與心肌梗死的發(fā)生有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚[5]。本實驗用缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，缺氧的確可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；且缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中LINC00265表達(dá)水平升高；干擾LINC00265表達(dá)后，G0-G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞凋亡率降低，Ki67表達(dá)水平升高，Caspase3表達(dá)水平降低。Ki67是一種細(xì)胞增殖抗原，其可作為細(xì)胞增殖活性的檢測指標(biāo)[12]。Caspase3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。本實驗結(jié)果表明干擾LINC00265可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

lncRNA與miRNA間存在著相互調(diào)控關(guān)系，兩者間的相互作用參與了眾多疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。本實驗通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與LINC00265相關(guān)的miRNA，結(jié)果顯示LINC00265與miR-485-5p存在互補(bǔ)的核苷酸序列，雙熒光素酶報告實驗進(jìn)一步證實LINC00265靶向調(diào)控miR-485-5p。研究報道m(xù)iR-485-5p通過靶向Rac1/Notch2信號傳導(dǎo)保護(hù)了神經(jīng)細(xì)胞免受腦缺血/再灌注損傷[15]。miR-485-5p通過調(diào)控腫瘤壞死因子受體1型相關(guān)的DEATH結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD）保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免于腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導(dǎo)的凋亡[16]。本實驗結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-485-5p表達(dá)水平降低，過表達(dá)miR-485-5p可降低細(xì)胞凋亡率，提高Ki67表達(dá)水平，降低Caspase3表達(dá)水平。表明表達(dá)miR-485-5p可減弱缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，干擾LINC00265可能通過上調(diào)miR-485-5p的表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖。