陳 旋 胡 穎 孫明升 賈 婕 楊章旗

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 南寧 530002； 2.貴州省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院 貴陽(yáng) 550003； 3.廣西大學(xué)林學(xué)院 南寧 530004；4.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南京 210037； 5.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南寧 530002)

植物在自然環(huán)境中常受到干旱、低溫和重金屬等脅迫； 此外，環(huán)境污染和極端氣候加劇了非生物脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的影響。土壤中許多重金屬是植物生長(zhǎng)所必需的微量元素，但其含量過(guò)高會(huì)破壞植物的生物膜，干擾植物正常代謝和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致植物死亡(劉鈴等，2018； Ciarmielloetal.，2011)。非生物脅迫下，植物會(huì)改變自身形態(tài)和生理機(jī)能以提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性(Taizetal.，2015)。鉛(Pb)脅迫時(shí)，植物可以將土壤中的鉛活化，利用根細(xì)胞表面進(jìn)行吸附，并通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜將Pb2+轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部分； 但只有少量Pb2+可借助共質(zhì)體通路進(jìn)行轉(zhuǎn)載，大多數(shù)仍在土壤中累積并毒害植物，導(dǎo)致膜透性改變、酶活性擾亂、光合作用受限、呼吸作用受抑、有絲分裂受阻、內(nèi)源激素紊亂等生理過(guò)程的改變，從而增加植物在萌發(fā)和出苗階段的死亡率(Küpper，2017； 段德超等，2014)。環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示：中國(guó)土壤重金屬總超標(biāo)率高達(dá)16.1%，其中林地點(diǎn)位超標(biāo)率為10.0%，中國(guó)南方地區(qū)是重要的鉛礦區(qū)，部分地區(qū)土壤鉛含量嚴(yán)重超出國(guó)家《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值，直接對(duì)植物的生存造成不利影響。因此，了解植物對(duì)鉛脅迫的響應(yīng)機(jī)制以探尋修復(fù)鉛污染土壤的途徑具有重要意義。

添加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)控植物代謝生理是緩解鉛脅迫造成植物損傷的有效方法。甜菜堿(betaine，BT)是細(xì)胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與逆境脅迫下穩(wěn)定植物細(xì)胞內(nèi)酶、蛋白結(jié)構(gòu)和維持膜結(jié)構(gòu)完整的生理過(guò)程(王三根等，2015)，BT通過(guò)提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性，降低氧化脅迫并提高植物光合作用從而有效地緩解鉛脅迫對(duì)玉米(Zeamays)(劉慧等，2017)和草棉(Gossypiumherbaceum)(Bharwanaetal.，2014)幼苗的傷害。茉莉酸甲酯(methyle jasmonate，MeJA)作為參與調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育的信號(hào)分子，可以應(yīng)對(duì)干旱、高鹽、重金屬等非生物脅迫(楊華庚等，2011)。Bali等(2018)認(rèn)為，MeJA通過(guò)降低Pb2+的吸收改善番茄(Lycopersiconesculentum)植株的生長(zhǎng)、光合特性、抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)活性、增加滲透物質(zhì)和金屬螯合化合物的含量，從而緩解鉛脅迫的毒性效應(yīng)。水楊酸(salicylic acid，SA)是能夠激活植物過(guò)敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性的內(nèi)源信號(hào)分子，Kohli等(2018)研究發(fā)現(xiàn)SA處理的芥菜(Brassicajuncea)幼苗通過(guò)促進(jìn)生長(zhǎng)、提高色素含量、調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗Pb2+的不良影響。鈣作為植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)特定基因表達(dá)以防止膜損傷和滲漏的作用，施加鈣可以導(dǎo)致離子間的拮抗作用來(lái)降低植物對(duì)污染物的吸收，增強(qiáng)抗氧化酶活性、植物細(xì)胞膜的選擇性吸收能力和光合產(chǎn)物的合成，從而降低鉛(王芳等，2016)、鎘(石貴玉等，2010)等重金屬脅迫對(duì)植物的傷害。

格木(Erythrophleumfordii)屬豆科(Leguminosae)，分布于廣東、福建、臺(tái)灣以及廣西欽州、合浦、小明山等地，是中國(guó)南方主要用材珍貴造林樹(shù)種之一。格木木材質(zhì)硬而亮，紋理致密，是著名硬木之一，可用于房屋建筑和高檔家具(黃忠良等，1997)； 同時(shí)其具有較高的藥用價(jià)值(Lietal.，2004)，是中國(guó)二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)珍稀瀕危植物之一。目前對(duì)格木的研究主要集中在播種育苗、栽培措施、造林技術(shù)等方面，對(duì)其抗逆性研究較少。鑒于此，本文以格木幼苗為材料，通過(guò)添加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)，探討鉛脅迫下格木生理特性的變化及其響應(yīng)機(jī)制，為格木栽培與引種及重金屬污染土壤的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1年生格木幼苗為廣西林業(yè)科學(xué)研究院培育的實(shí)生容器苗，容器上下口徑15 mm，高20 mm，基質(zhì)為蛭石與營(yíng)養(yǎng)土按1∶3混合而成的土壤(pH6.5～7.8)。2018年6月將幼苗移至廣西大學(xué)林學(xué)院實(shí)驗(yàn)苗圃基地(108°22′E，22°48′N)，大棚規(guī)格長(zhǎng)50 m、寬8 m、高3 m。移苗后采用相同的水肥管理和栽培措施培育1個(gè)月，選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致，無(wú)病蟲(chóng)害的幼苗[苗高(50±5) cm]進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將培植于基質(zhì)中的格木幼苗以20株為1個(gè)處理，分為14個(gè)處理，其中CK1正常培育，CK2進(jìn)行鉛脅迫處理，B1、B2和B3分別用100、500和1 000 mg·L-1的BT處理后再進(jìn)行鉛脅迫處理，S1、S2和S3分別用25、100和200 mg·L-1的SA處理后再進(jìn)行鉛脅迫處理，J1、J2和J3分別用0.1、1和3 mmol·L-1的MeJA處理后再進(jìn)行鉛脅迫處理，C1、C2和C3分別用5、20和40 mmol·L-1的CaCl2處理后再進(jìn)行鉛脅迫處理。外源調(diào)節(jié)物質(zhì)處理采取葉面噴施法，噴施時(shí)間為每日早上9:00，噴施以葉片正反面浸濕并剛有液體下滴為宜，連續(xù)噴施3日后，將12組外源調(diào)節(jié)物質(zhì)處理的幼苗及CK2連同其營(yíng)養(yǎng)杯同時(shí)浸入10 mmol·L-1的PbSO4溶液中持續(xù)鉛脅迫處理10天，期間補(bǔ)充溶液以保證浸泡液的濃度。于脅迫后的第1、3和10天分別采樣，各處理中隨機(jī)選擇10～15株幼苗均勻摘取同一部位葉片，用打孔器分別打取葉面中心3個(gè)相近點(diǎn)位的葉片(即3次重復(fù))作為實(shí)驗(yàn)材料并保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3 試驗(yàn)方法

采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性，紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性，酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸(proline，PRO)含量，蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖(soluble sugar，SS)含量，二辛可寧酸法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)(soluble protein，SP)含量，硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。上述指標(biāo)的測(cè)定和計(jì)算按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒及說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。吸光值用酶標(biāo)儀(INFINITE 200 PRO，Tecan Austria GmbH)測(cè)量。利用日產(chǎn)SPAD-502葉綠素儀參照李合生(2000)的方法測(cè)定SPAD值。參照史樹(shù)德等(2011)采用外滲電導(dǎo)法測(cè)定RC(DDB-303A型便攜式電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司)。各指標(biāo)均進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，(處理C3在脅迫第10天時(shí)由于幼苗受害嚴(yán)重導(dǎo)致樣本不足，僅測(cè)定其SPAD值)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel整理數(shù)據(jù)制表，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 23.0中的one way ANOVA進(jìn)行方差分析、Duncan’s法進(jìn)行多重比較、Pearson線性相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。Fuzzy綜合評(píng)價(jià)法根據(jù)模糊數(shù)學(xué)綜合決策原理，采用加權(quán)平均和最大原則。公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗抗氧化酶活性的影響

2.1.1 對(duì)格木幼苗SOD活性的影響 脅迫1天時(shí)，CK1的SOD活性顯著高于CK2(P<0.05)，此時(shí)B2、J1、J3、C1、C3的SOD活性顯著高于CK2(P<0.05)，具有較敏感的SOD激活能力； 第3天時(shí)，CK2的SOD活性比CK1稍高，且較1天時(shí)顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明此時(shí)格木已改變體內(nèi)代謝提升SOD活性以應(yīng)答鉛脅迫； 10天時(shí)，CK2的SOD活性顯著高于CK1(P<0.05)，S1、S2、J1和C1顯著高于CK2(P<0.05)(表1)。

2.1.2 對(duì)格木幼苗POD活性的影響 由表1可知，CK1和CK2的POD活性隨時(shí)間延后而逐漸升高，且CK2始終顯著高于CK1(P<0.05)，這說(shuō)明鉛脅迫時(shí)POD觸發(fā)敏感、活性高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是格木抗鉛脅迫生理的重要指標(biāo)。脅迫1天時(shí)的B1、S1處理，脅迫3天時(shí)的B1、B2、S2、C2和MeJA處理，及脅迫10天時(shí)的S1處理表現(xiàn)出顯著高于CK2的POD活性(P<0.05)。

2.1.3 對(duì)格木幼苗CAT活性的影響 CK1的CAT活性隨時(shí)間明顯增加，CK2則明顯降低，脅迫1天和3天時(shí)，CK2顯著高于CK1(P<0.05)；脅迫10天時(shí)，CK2顯著低于CK1(P<0.05)。以上結(jié)果表明，脅迫初期格木幼苗CAT酶活增強(qiáng)以響應(yīng)外部脅迫，但CAT隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而活性逐漸降低。B2、S1和S3在3天時(shí)表現(xiàn)顯著高于CK2的CAT活性(P<0.05)，J2在脅迫10天時(shí)有較強(qiáng)的CAT激活能力，S2在中期及后期均表現(xiàn)高度活性的CAT，B1、B3在中后期表現(xiàn)較CK2高的CAT活性，C2在1天和10天時(shí)的CAT活性顯著高于CK2(P<0.05)(表1)。

表1 鉛脅迫下不同處理對(duì)格木幼苗抗氧化酶活性的影響①Tab.1 Effects of different treatments on the activities of antioxidant enzymes in Erythrophleum fordii seedlings under lead stress

2.2 鉛脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)格木幼苗PRO含量的影響 由表2可知，CK1和CK2的PRO含量隨時(shí)間延后先降低后升高，CK2始終顯著低于CK1(P<0.05)，說(shuō)明鉛脅迫造成格木幼苗PRO的合成受抑制。鉛脅迫1天時(shí)，除B1、S2、J3、C1和C2外，其余處理的PRO含量均顯著高于CK2(P<0.05)； 脅迫3天時(shí)，所有處理均顯著高于CK2(P<0.05)； 脅迫10天時(shí)，除B1、J3、C1和S3外，其余處理均對(duì)格木幼苗的PRO合成有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。

2.2.2 對(duì)格木幼苗SP含量的影響 CK1和CK2的SP含量隨時(shí)間延后而顯著升高又顯著降低(P<0.05)，CK2始終顯著小于CK1(P<0.05)，說(shuō)明格木幼苗在遭受鉛脅迫時(shí)可溶性蛋白的分解速率大于合成速率。脅迫1天時(shí)，除J1、J3和C3外的處理PRO含量均顯著高于CK2(P<0.05)； 脅迫3天時(shí)，S3、B2、B3、C1和C2分別比CK2高44.2%、6.7%、29.6%、51.6%和42.6%； 脅迫10天時(shí)，B1、B2和J2較3天時(shí)升高，B3和S3則呈減少趨勢(shì)，但均顯著高于CK2(P<0.05)。以上結(jié)果表明，BT、SA和CaCl2對(duì)鉛脅迫格木幼苗SP的合成促進(jìn)作用較強(qiáng)(表2)。

表2 鉛脅迫下不同處理對(duì)格木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Tab.2 effects of different treatments on the content of osmotic adjustment substance in E. fordii seedlings under lead stress

2.2.3 對(duì)格木幼苗SS含量的影響 由表2可知，脅迫1天時(shí)，CK2的SS含量顯著高于CK1(P<0.05)，且高于外源調(diào)節(jié)物質(zhì)處理，說(shuō)明鉛脅迫下格木幼苗產(chǎn)生可溶性糖的應(yīng)激反應(yīng)較敏感； 脅迫3天時(shí)，B1、S3、J1和J3的SS含量略高于CK2； 脅迫10天時(shí)添加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的處理均顯著低于CK2(P<0.05)； 且在脅迫3天和10天時(shí)CK2的SS含量均顯著低于CK1(P<0.05)，說(shuō)明Pb2+累積對(duì)幼苗的破壞加重，導(dǎo)致光合效率降低或葉片內(nèi)可溶性糖降解加快。

2.3 鉛脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗細(xì)胞膜透性的影響

2.3.1 對(duì)格木幼苗MDA含量的影響 由表3可知，CK2的MDA含量較隨時(shí)間延后顯著升高，在脅迫中后期顯著高于CK1(P<0.05)。脅迫1天時(shí)，除S1、S2、J2、C1和C3外，其余處理的MDA含量均顯著低于CK2(P<0.05)； 脅迫3天時(shí)，除S1、J3、C1外的處理的MDA含量低于CK2，其中除B2和B3外均達(dá)顯著差異(P<0.05)； 脅迫10天時(shí)，除C1外的處理均表現(xiàn)顯著抑制MDA合成的作用(P<0.05)。外源調(diào)節(jié)物質(zhì)抑制格木合成MDA以抵御脅迫危害的作用。

2.3.2 對(duì)格木幼苗RC的影響 隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，CK2的RC明顯增加，由顯著低于CK1，到與CK1相當(dāng)，再到顯著高于CK1(P<0.05)(表3)。鉛脅迫1天時(shí)，外源調(diào)節(jié)物質(zhì)處理的RC均顯著高于CK2(P<0.05)； 脅迫3天時(shí)，B1、B2、C1的RC稍低于CK2； 脅迫10天時(shí)，僅BT處理的RC顯著低于CK2(P<0.05)，其對(duì)RC的抑制作用逐步明顯。

2.4 鉛脅迫下外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗SPAD的影響

CK2的SPAD值隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低且顯著低于CK1(P<0.05)，說(shuō)明格木葉綠素的分解隨Pb2+的富集增強(qiáng)。脅迫1天時(shí)，僅S1的SPAD值稍大于CK2； 脅迫3天時(shí)，除B2外的處理均顯著高于CK2(P<0.05)，其中S2、S3和J1分別較CK2高12、11和14倍； 脅迫10天時(shí)，B3、J1、J3、C1和施用SA處理的SPAD值仍顯著高于CK2(P<0.05)，其他處理則在脅迫后期有降低趨勢(shì)(表3)。

2.5 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗耐鉛脅迫的綜合評(píng)價(jià)

利用模糊隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗耐鉛脅迫的能力(表4)。各外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的耐鉛脅迫能力在濃度上表現(xiàn)為B1>B2>B3，S3>S1>S2，J2>J1>J3，C2>C1>C3。所有處理綜合評(píng)價(jià)排序?yàn)椋篔2>C2>B1>C1>J1>B2>CK2>S3>B3>S1>S2>J3>C3。格木幼苗產(chǎn)生適應(yīng)性誘導(dǎo)以抵抗鉛脅迫的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)以中低濃度的BT、MeJA、和CaCl2較為適宜。

表3 鉛脅迫下不同處理對(duì)格木幼苗細(xì)胞膜透性及SPAD值的影響Tab.3 Effects of different treatments on cell membrane permeability and spad value of E. fordii seedling under lead stress

2.6 鉛脅迫下格木幼苗生理指標(biāo)的相關(guān)性

SOD活性與CAT活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與PRO和SS含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)； POD活性與CAT活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與PRO、SP和SS含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)； CAT活性與PRO和SS含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)； PRO與SP、SS、RC及SPAD值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)； SP與SS呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)； SS與RC呈顯著正相關(guān)(P<0.05)； MDA與RC呈顯著正相關(guān)(P<0.05)； RC與SPAD值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)； 各生理指標(biāo)相互協(xié)同或拮抗，共同修復(fù)調(diào)節(jié)鉛脅迫對(duì)格木的損傷(表5)。

表4 鉛脅迫下不同處理的格木幼苗的各項(xiàng)生理指標(biāo)的隸屬值及其綜合評(píng)價(jià)Tab.4 membership value of various physiological indexes of different treatments of E. fordii seedlings under lead stress and its comprehensive evaluation

表5 鉛脅迫下格木幼苗生理指標(biāo)的相關(guān)性分析①Tab.5 Correlation analysis of E. fordii physiological indexes under lead stress

3 討論

3.1 鉛脅迫對(duì)格木幼苗的影響

鉛脅迫會(huì)限制植物細(xì)胞有絲分裂，改變細(xì)胞膜透性，破壞葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等亞顯微結(jié)構(gòu)，替換部分酶活性中心的金屬離子以影響其活性，繼而引起植物光合作用、呼吸作用、氮代謝、核酸代謝紊亂，同時(shí)造成植物體內(nèi)元素失衡而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)脅迫(Kosobrukhovetal.，2004)。本研究發(fā)現(xiàn)，鉛脅迫使格木幼苗的PRO含量顯著減少，可溶性糖(SS)、可溶性蛋白質(zhì)(SP)及光合色素的合成受到明顯抑制，嚴(yán)重?cái)_亂細(xì)胞維持其穩(wěn)態(tài)的滲透壓而增強(qiáng)細(xì)胞膜透性，這可能是Pb2+與膜蛋白上的-SH結(jié)合或與磷酸乙醇胺和磷脂絲氨酸反應(yīng)，并伴有Pb2+與膜結(jié)合的Ca2+置換，從而改變細(xì)胞壁膜系統(tǒng)的彈性和可塑性(宋勤飛等，2006)。Pb2+的累積導(dǎo)致胞內(nèi)MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率(RC)明顯增加，同時(shí)刺激抗氧化酶活性增強(qiáng)而降低鉛脅迫造成的脂質(zhì)過(guò)氧化； 其中POD激活程度大、觸發(fā)敏感且作用持久，是格木幼苗抗鉛脅迫的主要抗氧化酶，這與常云霞等(2015)和周芙蓉等(2013)的研究相同。格木對(duì)Pb2+具有一定的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)作用，其通過(guò)質(zhì)膜上ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和負(fù)電荷對(duì)Pb2+的泵離、液泡中有機(jī)酸和生物堿與Pb2+的絡(luò)合及有機(jī)配體(半胱氨酸、谷胱甘肽、植物螯合肽、金屬硫蛋白)與Pb2+的螯合來(lái)緩解Pb2+對(duì)自身的毒害(段德超等，2014)。

3.2 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗抗氧化酶活性的作用

鉛會(huì)造成植物體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而過(guò)氧化脅迫，使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS(reactive oxygen species)而氧化細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，導(dǎo)致體內(nèi)代謝失衡并引起膜脂過(guò)氧化和膜結(jié)構(gòu)破壞(Taizetal.，2015； 史樹(shù)德等，2011)。SOD可以催化氧自由基歧化反應(yīng)從而消除植物體內(nèi)活性氧的累積，POD和CAT又將催化產(chǎn)生的歧化產(chǎn)物H2O2轉(zhuǎn)化為無(wú)害的分子氧和水(史樹(shù)德等，2011)。本研究結(jié)果表明，外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)3種抗氧化酶活性的激活程度不一，但均對(duì)抗氧化酶協(xié)同防御活性氧或其他過(guò)氧化物自由基起到促進(jìn)作用，這與石貴玉等(2010)和常云霞等(2015)的研究結(jié)果一致。鉛脅迫下3種抗氧化酶活性的誘導(dǎo)與激活有差異，是因在植物細(xì)胞中ROS有超氧化物(O2.-)、單線態(tài)氧(1O2)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥基自由基(OH·)等形式，其中SOD主要清除超氧化物陰離子，同時(shí)產(chǎn)生H2O2； POD則主要催化H2O2、氧化酚類和胺類化合物； CAT在過(guò)氧化物酶體及乙醛酸循環(huán)體中含量較高，負(fù)責(zé)清除由光呼吸或脂肪酸氧化過(guò)程中形成的過(guò)氧化物(Taizetal.，2015)。

3.3 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用

逆境條件下，植物積累小分子有機(jī)化合物以增加細(xì)胞溶質(zhì)濃度降低滲透勢(shì)以保持體內(nèi)細(xì)胞與組織的水分平衡，使體內(nèi)與膨壓有關(guān)的生理活動(dòng)正常進(jìn)行。PRO增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水合作用保持原生質(zhì)形態(tài)，同時(shí)清除ROS保持膜結(jié)構(gòu)的完整性(王三根等，2015)； 可溶性蛋白質(zhì)(SP)多為未與膜系統(tǒng)特異性結(jié)合的酶，有保護(hù)植物細(xì)胞中生物大分子和維持特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用(曹瑩等，2005)； 可溶性糖(SS)能降低原生質(zhì)的滲透勢(shì)，利于細(xì)胞從外界吸水而產(chǎn)生具有固體機(jī)械特性的超飽和液體，避免細(xì)胞溶液結(jié)晶并防止細(xì)胞塌陷(Koster，1991； 李潔等，2009)。有研究表明，逆境條件下外施BT(Shaoetal.，2008)、SA(段小華等，2009)、MeJA(楊華庚等，2011)和Ca2+(王芳等，2016)能及時(shí)并顯著提升PRO、SP和SS的合成以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透失衡。本研究結(jié)果顯示，施加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)能較好緩解Pb2+造成的細(xì)胞滲透失衡； 脅迫初期，SP受外源調(diào)節(jié)物質(zhì)觸發(fā)而合成反應(yīng)快； 脅迫中期，PRO的激活較為徹底，主導(dǎo)格木幼苗的滲透調(diào)節(jié)； 脅迫后期，SP和PRO共同均等地對(duì)滲透失衡進(jìn)行修復(fù)調(diào)節(jié)。本研究外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗SS的合成無(wú)明顯促進(jìn)作用，這與鄒文桐等(2012)和段小華等(2009)的研究結(jié)果相悖，但與谷文英等(2013)利用SNP對(duì)菊苣(Cichoriumintybus)果糖、葡萄糖和蔗糖含量的研究結(jié)論相似，可能是高濃度Pb2+對(duì)格木幼苗的小分子糖類物質(zhì)和高分子量果聚糖的作用效果不一，導(dǎo)致可溶性糖總量存在差異。

3.4 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗細(xì)胞膜透性的作用

鉛脅迫時(shí)，植物體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)氧化自由基而誘發(fā)膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致膜脂分解和MDA累積，進(jìn)而改變膜蛋白的性質(zhì)和膜脂的流動(dòng)性，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)由于胞膜透性增大而外滲，繼而增大植物細(xì)胞浸提液的RC。本研究中，格木體內(nèi)MDA含量和RC隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加，外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)減少M(fèi)DA含量和RC的表達(dá)有差異，但均表現(xiàn)一定的分解MDA和降低RC的作用。這與趙騰飛等(2017)和Lou等(2015)的研究結(jié)果相同。本研究中Ca2+在脅迫中后期對(duì)MDA含量和RC的抑制作用較小，這與趙騰飛等(2017)和王芳等(2016)的研究結(jié)果有差別，可能是由于高濃度Ca2+使植物的蛋白質(zhì)與核酸變性、原生質(zhì)內(nèi)含物外泄，增強(qiáng)對(duì)乙烯等內(nèi)源激素的修飾和放大作用，從而加快植物的衰老和損傷。

3.5 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)格木幼苗光合色素的作用

植物在鉛脅迫下表現(xiàn)中毒癥狀與葉綠素的降解、葉綠體的功能障礙和光合作用受抑有關(guān)。鉛脅迫破壞光合色素合成的原因可能是Pb2+沉積在類囊體并與膜蛋白體結(jié)合，置換其中的Mg2+，導(dǎo)致葉綠體酶系統(tǒng)破壞而阻礙葉綠素合成(Küpperetal.，1996)。在甜瓜(Cucumismelo)(左彬彬等，2018)、煙草(Nicotianatabacum)(盧軍等，2011)和喜樹(shù)(Camptothecaacuminata)(孟長(zhǎng)軍等，2018)的相關(guān)研究中表明，逆境脅迫對(duì)植物葉綠素合成的抑制作用明顯，施加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)能有效提高葉綠素的含量而減少脅迫損傷。這與本研究中施加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)鉛脅迫下格木幼苗SPAD值的變化情況一致。

3.6 生理指標(biāo)受外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響及其相關(guān)性

各生理指標(biāo)之間存在一定的關(guān)聯(lián)性：格木幼苗受鉛脅迫時(shí)產(chǎn)生大量強(qiáng)氧化自由基，繼而引起膜脂過(guò)氧化和MDA累積，高含量的MDA破壞細(xì)胞膜透性致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物外滲而RC激增。為抵御脅迫傷害，格木光合作用等代謝增強(qiáng)，加速碳水化合物、氨基酸和蛋白質(zhì)等光合產(chǎn)物的合成，使胞內(nèi)PRO和SP含量增加，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)彼此協(xié)同促進(jìn)并刺激SOD和CAT活性增強(qiáng)，清除胞內(nèi)超氧化物陰離子自由基，同時(shí)消除植物減少自身?yè)p傷進(jìn)行的光呼吸所形成的過(guò)氧化物。高活性的CAT清除大部分過(guò)氧化物，而光呼吸消耗POD將光合作用的副產(chǎn)物乙醇酸氧化為乙醛酸和H2O2，故POD活性與CAT活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

本研究中，BT對(duì)激活CAT活性、促進(jìn)PRO和可溶性蛋白質(zhì)(SP)合成、消除MDA累積、降低相對(duì)電導(dǎo)率(RC)的作用最大； SA對(duì)PRO和SP含量及SPAD值的提高有明顯作用，能在一定程度提升POD活性； MeJA對(duì)增加PRO含量的作用較大，對(duì)促進(jìn)光合色素合成的作用最明顯； CaCl2能有效促進(jìn)PRO和SP的合成和激活SOD活性，但一定程度增大MDA含量和RC。外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)鉛脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性生理從而提高格木幼苗抗鉛脅迫的能力有差別，主要是由于外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的抗鉛脅迫機(jī)制不同。BT是極溶性生物堿，對(duì)植物亞細(xì)胞、大分子生物物質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物膜有保護(hù)作用，主要參與植物滲透調(diào)節(jié)，通過(guò)改變多糖代謝，影響植物根細(xì)胞壁中果膠的成分以增強(qiáng)細(xì)胞壁對(duì)重金屬的結(jié)合能力(段德超等，2014)，同時(shí)改變土壤重金屬形態(tài)、生物有效性和無(wú)機(jī)離子的吸收轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)植物對(duì)土壤重金屬的吸收和累積(姚偉卿等，2019)。SA是植物體自身可合成的小分子酚類物質(zhì)，通過(guò)調(diào)控信號(hào)分子代謝酶的活性而積累H2O2，H2O2作為第二信使誘導(dǎo)保護(hù)酶的合成(Raskin，1992)。MeJA在脅迫中是驅(qū)動(dòng)植物防御基因表達(dá)的信號(hào)因子，調(diào)節(jié)植物體保護(hù)酶及次生代謝酶活性，同時(shí)誘導(dǎo)特異基因表達(dá)以合成與植物細(xì)胞防御病菌有關(guān)的蛋白質(zhì)及次生物質(zhì)(Lehmannetal.，1995)。Ca2+與膜磷脂的極性頭部結(jié)合，通過(guò)交聯(lián)作用使膜脂分子和蛋白質(zhì)分子結(jié)合緊密，從而降低膜的透性(李美如等，1996)。

4 結(jié)論

鉛脅迫導(dǎo)致格木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量減少、光合色素合成受抑、MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率(RC)增加、抗氧化酶活性增強(qiáng)，格木在受鉛脅迫損傷的同時(shí)亦表現(xiàn)一定的耐鉛脅能力。施加外源調(diào)節(jié)物質(zhì)使抗氧化酶活性明顯增加、PRO和可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量明顯升高、葉綠素合成速率加快、MDA降解、RC降低，但對(duì)可溶性糖(SS)的合成促進(jìn)作用不明顯。外源調(diào)節(jié)物質(zhì)有利于提升格木幼苗抗鉛脅迫的抗性，各處理抗鉛脅迫能力綜合表現(xiàn)為J2>C2>B1>C1>J1>B2>CK2>S3>B3>S1>S2>J3>C3。中低濃度的甜菜堿(BT)、茉莉酸甲酯(MeJA)和CaCl2對(duì)提高格木幼苗抗性、抵抗鉛脅迫損害的效果較好。抗性生理指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性，彼此協(xié)同或拮抗，共同修復(fù)調(diào)節(jié)鉛脅迫傷害。