田東浩 許文耀 余 輝 楊薇粒 鄭百俊 高 亞 潘偉康

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung"s disease，HSCR）是最常見(jiàn)的先天性胃腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，活產(chǎn)兒中發(fā)病率為1／5 000，男性發(fā)病率約為女性的4 倍，主要臨床表現(xiàn)為病變腸管痙攣、腸內(nèi)容物通過(guò)受阻引起下消化道梗阻；病理學(xué)改變?yōu)椴∽兡c管神經(jīng)節(jié)缺如以及神經(jīng)纖維增粗、增多［1-4］。 其發(fā)病機(jī)制為胚胎第3 ～12 周時(shí)來(lái)自迷走神經(jīng)的腸神經(jīng)嵴前體細(xì)胞（enteric neural crest cells，ENCCs）沿頭向尾方向遷移障礙所致［5-7］。 研究表明，多基因如SOX10、NRG1、RET、SIP1、GDNF 等參與HSCR 的發(fā)生過(guò)程，但其確切發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚［8］。

MicroRNA （miRNA） 是內(nèi)源性小分子非編碼RNA，大小為19 ～25 bp，以直接結(jié)合靶基因mRNA的3"-非翻譯區(qū)（3"-UTR）阻遏翻譯和（或）誘導(dǎo)mRNA 降解的方式，參與調(diào)控細(xì)胞周期、分化、遷徙和凋亡以及能量代謝等多種細(xì)胞活動(dòng)［9-11］。 既往研究表明，HSCR 患者腸組織中存在大量異常表達(dá)的miRNA，如miR-206［12，13］、miR-192／215［14］、miR-140-5p［15］和miR-132／212［16］等，它們可能與HSCR 發(fā)生相關(guān)。 研究表明，miR-939 可通過(guò)靶向HDGF 誘導(dǎo)WNT／β-Catenin 途徑失活，還可通過(guò)靶向IGF-1R 誘導(dǎo)PI3K／Akt 途徑失活，進(jìn)而調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡，發(fā)揮抑癌作用［17，18］。 陳廣林等報(bào)道m(xù)iR-939 可靶向LRSAM1 并抑制HSCR 中ENCCs 增殖［19］。 SOX4 為SOX （Sry-related HMG box） 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛參與胚胎期神經(jīng)元發(fā)育、軸突形成、神經(jīng)元映射以及生殖系統(tǒng)發(fā)育等過(guò)程。有報(bào)道顯示，SOX4 可能通過(guò)Notch 信號(hào)通路調(diào)控Mash1、Ngn1 和Ngn2 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，并與SOX11 發(fā)揮協(xié)同作用［20］。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SOX4 在HSCR 患者腸組織中低表達(dá)［21］。 目前尚不清楚miR-939 對(duì)SOX4 的調(diào)控及二者對(duì)ENCCs 功能表型的影響，以及miR-939／SOX4 在HSCR 發(fā)病中的機(jī)制。

本研究擬通過(guò)檢測(cè)miR-939 和SOX4 在HSCR患者腸組織中的表達(dá)水平，評(píng)估m(xù)iR-939 對(duì)SOX4表達(dá)調(diào)控作用，以及miR-939、SOX4 對(duì)ENCCs 增殖、凋亡和遷移的影響，并探討miR-939／SOX4 在HSCR 干預(yù)治療中的潛在價(jià)值。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料

孕齡15 ～20 d 的Sprague Dawley （SD） 大鼠購(gòu)自廣州弗爾博生物科技有限公司；DMEM／F12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、Lipofectamine 2000、Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Nestin、GFAP、SOX4 單克隆一抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；miR-939模擬物、SOX4 siRNA 及陰性對(duì)照試劑均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell 遷移室、增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；Annexin V-FITC ／ PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Yeasen 公司；TaqMan MicroRNA 檢測(cè)試劑盒、ABI 7900HT 熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；SYBR GREEN 1 購(gòu)自日本TaKaRa 公司；RIPA 緩沖液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientifc 公司。

二、研究方法

1． 患者組織樣本采集 收集2019 年1 月至2020 年1 月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的30 例HSCR 患者狹窄段（無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段）腸組織，另選取30 例經(jīng)手術(shù)治療腸套疊患者的結(jié)腸非病變處組織作為對(duì)照；所有組織標(biāo)本用生理鹽水沖洗后保存于-80℃環(huán)境下。 HSCR 患者年齡為30 天至5 歲，男23 例，女7 例。 對(duì)照組患者年齡為1 ～5 歲，男20 例，女10 例。 兩組患者基線資料匹配，具有可比性。 本研究開(kāi)展前獲得患者監(jiān)護(hù)人的書(shū)面知情同意書(shū)，并獲取我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2． SD 大鼠ENCCs 分離培養(yǎng) 參考肖莉等［22］的研究方法進(jìn)行ENCCs 分離培養(yǎng)。 取孕15 ～18 天SD 胎鼠腸管，小心剔除腸系膜后充分剪碎，分別用胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶消化30 min、10 min，添加胎牛血清終止消化，無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾，于37℃下1 000 r／min 離心3 min，棄上清后PBS 沖洗3 次，完全培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，按照6 ×105個(gè)細(xì)胞／mL 的密度接種到培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 ～5 d，然后傳代培養(yǎng)。 傳代5 次后進(jìn)行克隆球的分化培養(yǎng)，取適量左旋多聚賴(lài)氨酸包被蓋玻片于24 孔板中過(guò)夜，無(wú)菌雙蒸水清洗3 次，600 r／min 離心2 min 離心收集懸浮神經(jīng)球，0． 25% 胰蛋白酶消化5 ～10 min，輕柔吹打，制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，添加10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，以每孔1 ×105細(xì)胞／mL 接種于24 孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)8 h，觀察克隆球的分化情況。

3． SD 大鼠ENCCs 鑒定 收集懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)球離心，用4% 多聚甲醛固定30 min，0．5% Triton X-100 室溫透膜10 min，5%胎牛血清室溫封閉30 min，4℃下將蓋玻片分別于1 ∶500 稀釋的鼠抗Nestin 和兔抗GFAP 一抗中過(guò)夜孵育，室溫復(fù)溫1 h，PBS 清洗，然后與FITC 綠色和TRITC 紅色熒光二抗室溫孵育1 h，PBS 清洗，DAPI 染色10 min，將蓋玻片置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

4． ENCCs 轉(zhuǎn)染 收集懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)球于離心管中，37℃下1 000 r／min 離心3 min，棄上清，0．25%胰蛋白酶消化5 ～10 min，輕柔吹打，制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸，按照2 ×105細(xì)胞／孔的密度接種于6 孔板中。 根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，配合使用Lipofectamine 2 000 將miR-939 模擬物、SOX4-siRNA 和陰性對(duì)照試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

5． ENCCs 增殖測(cè)定 分別用miRNA 或siRNA轉(zhuǎn)染48 h 后，使用CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力以評(píng)估增殖情況，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度，記錄OD 值。

6． ENCCs 凋亡測(cè)定 將miRNA 或siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下孵育48 h 后進(jìn)行收集，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，使用Annexin V-FITC ／ PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

7． ENCCs 遷移測(cè)定 使用孔徑8 μm 規(guī)格的Transwell 遷移小室進(jìn)行細(xì)胞遷移分析，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度為1 ×105細(xì)胞／ml，并添加100 μL 到上室中，將600 μL 含有10%FBS 的分化培養(yǎng)基添加到下室中，于37℃、5%CO2條件下孵育24 h 后，用棉簽小心擦拭上室，預(yù)冷PBS 清洗后，乙醇固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 充分清洗后，在顯微鏡下（ ×100）隨機(jī)選擇5個(gè)視野留取照片進(jìn)行計(jì)數(shù)。

8． RNA 分離和qRT-PCR 按照試劑商說(shuō)明書(shū)上方法使用Trizol 試劑從組織樣品和細(xì)胞中提取總RNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 TaqMan MicroRNA 檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)miR-939，以U6 作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。通過(guò)ABI 7900HT 熒光定量PCR 儀和SYBR GREEN 1 檢測(cè)SOX4 mRNA 表達(dá)水平，以GAPDH 作為內(nèi)參。 實(shí)驗(yàn)用到的引物序列如下：SOX4，正向，5"-CGAGAAAATCGGGTAGCCCA-3"， 反 向，5"-CAGATTCACTCGCAATGCCC-3"； GAPDH， 正 向 5"-GTGGAATGGTGCAGACCAAG-3"， 反 向 5"-GTCAGGAGGTGGGATGTTGG-3"。 全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct 法評(píng)估m(xù)iRNA 或mRNA 的表達(dá)水平。

9． Western blot 按照試劑商說(shuō)明書(shū)方法，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液從組織和細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。 采用Bradford 方法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。 采用15%SDS-PAGE 分離出等量蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉，分別以1 ∶500和1 ∶1 000 的稀釋度與抗SOX4 和抗GAPDH 一抗孵育，4℃條件下過(guò)夜，在室溫（37℃）條件下與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗共孵育1 h，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行顯影，GAPDH 作為內(nèi)部對(duì)照。 使用ImageJ 軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS24．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中服從正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以（±s）表示，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次以上。 采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異性分析，采用單因素方差分析及基于Bonferroni校正的事后多重檢驗(yàn)進(jìn)行多組間差異比較，P ＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ENCCs 神經(jīng)球鑒定

于原代培養(yǎng)第3 天、第5 天在光學(xué)顯微鏡下觀察ENCCs 來(lái)源神經(jīng)球生長(zhǎng)情況，通過(guò)Nestin 和GFAP 雙免疫熒光染色對(duì)ENCCs 來(lái)源的神經(jīng)球進(jìn)行鑒定，結(jié)果可見(jiàn)神經(jīng)球表現(xiàn)為Nestin（紅色熒光）和GFAP（綠色熒光）雙陽(yáng)性，細(xì)胞核被DAPI 染為藍(lán)色，Nestin+ ／GFAP+雙陽(yáng)性表示細(xì)胞為ENCC 細(xì)胞（圖1）。

二、HSCR 患者腸組織中miR-939 和SOX4 表達(dá)

分別通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)HSCR 患者腸組織中miR-939 和SOX4 mRNA 的表達(dá)水平，通過(guò)Western blot 檢測(cè)SOX4 蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果表明，與腸套疊患者腸組織相比，HSCR 患者腸組織中miR-939 的表達(dá)水平顯著增加（圖2A），SOX4 的mRNA（圖2B）和蛋白（圖2C，圖2D）表達(dá)水平顯著降低。

圖1 ENCCs 來(lái)源神經(jīng)球光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果和免疫熒光染色結(jié)果（ ×200） A：原代培養(yǎng)第3 天的神經(jīng)球； B：原代培養(yǎng)第5天的神經(jīng)球； C：GFAP 陽(yáng)性（綠色區(qū)域）； D：Nestin 陽(yáng)性（紅色區(qū)域）； E：DAPI 陽(yáng)性（藍(lán)色區(qū)域）； F：染色融合Fig．1 Observation of light microscopy and Nestin／GFAP immunofluorescence staining of ENCCs neurosphere （ ×200）

圖2 先天性巨結(jié)腸患者（HSCR 組）和腸套疊患者（control 組）腸組織中miR-939 和SOX4 的表達(dá)情況 A、B：RT-PCR 檢測(cè)miR-939（A）和SOX4 mRNA（B）表達(dá)； C：Western blot 檢測(cè)SOX4 蛋白表達(dá)； D：Western blot 條帶ImageJ 定量結(jié)果； *代表與control 組比較，P ＜0．05Fig．2 miR-939／SOX4 expression in intestinal tissues of patients with Hirschsprung"s disease and intussusception

圖3 上調(diào)miR-939 的表達(dá)對(duì)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響 A：轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 上調(diào)細(xì)胞中miR-939 的表達(dá)；B：CCK8 法測(cè)定細(xì)胞增殖； C，D：Annexin V-FITC／PI 法測(cè)定細(xì)胞凋亡； E，F(xiàn)：Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移； *代表與對(duì)照比較，P ＜0．05Fig．3 Effect of up-regulated miR-939 expression on the proliferation，apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

圖4 ENCCs 中miR-939 靶向調(diào)控SOX4 表達(dá) A：RT-PCR 檢測(cè)SOX4 mRNA 表達(dá)； B：Western blot 檢測(cè)SOX4 蛋白表達(dá)； C：Western blot 條帶ImageJ 定量結(jié)果； D：通過(guò)miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-939 靶基因； *表示與對(duì)照比較，P ＜0．05Fig．4 Up-regulated miR-939 regulated SOX4 expression in enteric neural crest stem cells

圖5 下調(diào)SOX4 的表達(dá)對(duì)腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響 A、B：RT-PCR 和Western blot 證實(shí)轉(zhuǎn)染SOX4-siRNA 可敲低ENCCs 細(xì)胞中SOX4 的mRNA 和蛋白表達(dá)； C：CCK8 法測(cè)定細(xì)胞增殖； D：Annexin V-FITC ／ PI 法測(cè)定細(xì)胞凋亡； E：Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移； *代表與對(duì)照比較，P ＜0．05Fig．5 Effect of down-regulation of SOX4 expression on proliferation，apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

三、miR-939 表達(dá)上調(diào)對(duì)ENCCs 增殖、凋亡和遷移能力的影響

使用miR-939 mimic 轉(zhuǎn)染ENCCs，RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示miR-939 的表達(dá)水平上調(diào)（圖3A）。 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，上調(diào)miR-939 的表達(dá)顯著抑制ENCCs 細(xì)胞增殖（圖3B）；流式細(xì)胞儀分析表明，與對(duì)照組相比，上調(diào)miR-939 的表達(dá)顯著促進(jìn)ENCCs 細(xì)胞凋亡（圖3C，圖3D）；Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，上調(diào)miR-939 的表達(dá)顯著抑制ENCCs 細(xì)胞遷移（圖3E，圖3F）。

四、miR-939 靶向調(diào)控ENCCs SOX4 表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 后，分別通過(guò)RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)SOX4 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-939 mimic 顯著抑制ENCCs 細(xì)胞中SOX4 的表達(dá)（圖4A—圖4C）。在miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)到miR-939 靶基因數(shù)分別為2 059 個(gè)、72 個(gè)和1 294 個(gè)，三個(gè)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)到的共同靶基因有8 個(gè)，其中包含SOX4，在TargetScan 獲得miR-939 與SOX4結(jié)合位點(diǎn)信息（圖4D）。

五、下調(diào)SOX4 對(duì)ENCCs 增殖、凋亡和遷移能力的影響

使用SOX4-siRNA 轉(zhuǎn)染ENCCs 細(xì)胞，RT-PCR和Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示SOX4 的mRNA 和蛋白表達(dá)下調(diào)（圖5A，圖5B），分別檢測(cè)ENCCs 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡（方法同前），結(jié)果表明，下調(diào)SOX4 的表達(dá)可顯著抑制ENCCs 細(xì)胞的增殖（圖5C）和遷移（圖5E），并促進(jìn)凋亡（圖5D）。

討 論

腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）屬于直接調(diào)節(jié)胃腸系統(tǒng)的獨(dú)立神經(jīng)系統(tǒng)，而腸神經(jīng)嵴前體細(xì)胞（enteric neural crest cells，ENCCs）發(fā)育障礙是導(dǎo)致ENS 相關(guān)疾病，引發(fā)腸道功能異常的主要原因之一［23］。 當(dāng)ENCCs 增殖、凋亡、遷移和分化等過(guò)程出現(xiàn)異常時(shí)可引起先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung"s disease，HSCR）［24］。 HSCR 的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)異常，盡管很多學(xué)者已經(jīng)鑒定出一些導(dǎo)致HSCR 發(fā)生的關(guān)鍵基因，但尚不清楚導(dǎo)致其發(fā)病機(jī)理的主要機(jī)制。

在胚胎發(fā)生過(guò)程中，ENCCs 從結(jié)腸前端到遠(yuǎn)端的遷移需要持續(xù)數(shù)周，此過(guò)程中影響ENCCs 增殖、遷移和凋亡的各種因素均可能影響神經(jīng)節(jié)的形成。大量研究已證明miRNA 在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，而關(guān)于miRNA 參與HSCR 的發(fā)病過(guò)程也有較多研究。 據(jù)報(bào)道，miR-192／215 在HSCR組織樣品中顯著下調(diào)，且沉默miR-192／215 通過(guò)靶向Nidogen 1（NID1）抑制人293T 和SH-SY5Y 細(xì)胞的增殖和遷移［14］。 另外，miR-206 的下調(diào)通過(guò)抑制細(xì)胞增殖和遷移而參與HSCR 的發(fā)生［12，13］。 下調(diào)miR-200a／141 通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸酶-張力蛋白同源物的表達(dá)在HSCR 發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用［25］。 此外，有學(xué)者研究報(bào)道，HSCR 患者血漿外泌體中存在異常高表達(dá)的miRNAs 分子，有可能參與細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用，通過(guò)干擾細(xì)胞連接而促進(jìn)HSCR 發(fā)生［26］。 本研究發(fā)現(xiàn)miR-939 在HSCR 患者結(jié)腸組織樣本中顯著上調(diào)，并且上調(diào)miR-939 的表達(dá)顯著抑制ENCCs 的遷移和增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 這些結(jié)果表明miR-939 的異常高表達(dá)可能直接參與破壞ENCCs 功能的過(guò)程，從而促進(jìn)先天性巨結(jié)腸的發(fā)展。

性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族盒蛋白4（Sry-related HMG box 4，SOX4）為SOX（Sry-related HMG box）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛參與胚胎期神經(jīng)元發(fā)育、軸突形成和神經(jīng)元映射，以及生殖系統(tǒng)發(fā)育等過(guò)程，并在多種類(lèi)型的人類(lèi)惡性腫瘤患者組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。 SOX4 的高表達(dá)與腫瘤血管生成以及對(duì)放化療的抗性有關(guān)［27］。 據(jù)報(bào)道，SOX4 的上調(diào)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，SOX4 的高表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。 SOX4可能通過(guò)Notch 信號(hào)通路調(diào)控Mash1、Ngn1 和Ngn2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，并與SOX11 發(fā)揮協(xié)同作用調(diào)控神經(jīng)發(fā)生［20］。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，先天性巨結(jié)腸組織樣本中SOX4 表達(dá)顯著下調(diào)［21］，提示SOX4 可能參與HSCR 的發(fā)病過(guò)程。 基于此，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染靶向SOX4 的siRNA 敲低ENCCs 細(xì)胞中SOX4 的表達(dá)，結(jié)果顯示，下調(diào)SOX4 可顯著抑制ENCCs 細(xì)胞增殖和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 本研究還觀察到上調(diào)miR-939 可顯著抑制ENCCs 細(xì)胞中SOX4 的表達(dá)，并獲得與敲低SOX4 類(lèi)似ENCCs 表型變化結(jié)果。 此外，通過(guò)miRWalk、Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)到miR-939 可能的靶基因?yàn)镾OX4，在TargetScan 獲得miR-939 與SOX4 結(jié)合位點(diǎn)信息。以上結(jié)果表明，miR-939 可能通過(guò)靶向調(diào)控SOX4 表達(dá)來(lái)影響ENCCs 細(xì)胞功能，進(jìn)而參與HSCR 發(fā)生過(guò)程。

HSCR 的早期診斷和治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。 然而，臨床上HSCR 具有多種亞型及復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，鋇灌腸、直腸肛門(mén)測(cè)壓、家族史和基因診斷技術(shù)等均不能對(duì)HSCR 進(jìn)行可靠預(yù)測(cè)，主要依賴(lài)于直腸活組織檢查發(fā)現(xiàn)特征性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量的減少來(lái)做出最終診斷。 有學(xué)者［26］提到循環(huán)生物標(biāo)志物對(duì)HSCR 的診斷意義，肝癌和結(jié)腸癌患者血液中miR-939 表達(dá)水平均對(duì)疾病診斷和預(yù)后具有獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值，并對(duì)促炎基因表達(dá)有調(diào)控作用。 因此，有必要開(kāi)展針對(duì)HSCR 患者血液循環(huán)miRNAs 的研究，為臨床上通過(guò)檢測(cè)血液循環(huán)miR-939 作為HSCR 診斷的輔助手段提供證據(jù)支持。

綜上所述，本研究認(rèn)為，miR-939 和SOX4 均參與HSCR 的發(fā)病過(guò)程。 HSCR 患者腸組織中miR-939 顯著上調(diào)，而SOX4 顯著下調(diào)。 上調(diào)miR-939 或下調(diào)SOX4 均可抑制ENCCs 的增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 miR-939 的高表達(dá)通過(guò)靶向抑制SOX4表達(dá)，從而抑制ENCCs 的生長(zhǎng)、遷移和促進(jìn)凋亡，從而參與HSCR 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。 因此，靶向miR-939 或SOX4 的干預(yù)措施可能是HSCR 臨床診斷與治療的新思路。