伍菱 ，張其標(biāo)，楊遠(yuǎn)帆 ，姜澤東

1. 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（廈門 361021）；2. 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廈門 361021）

鰻魚學(xué)名鰻鱺，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類和維生素等，是集營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健于一身的水產(chǎn)品[1]，素有“水中人參”的美譽(yù)。我國(guó)是世界上最大的鰻魚養(yǎng)殖、加工和出口國(guó)家，鰻魚產(chǎn)品已成為我國(guó)單項(xiàng)農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)匯最多的商品。但是，目前國(guó)內(nèi)鰻魚加工企業(yè)多數(shù)以烤鰻為主，產(chǎn)品形式單一，使得鰻魚產(chǎn)業(yè)受國(guó)外市場(chǎng)（尤其是日本市場(chǎng)）的影響非常大。一旦國(guó)外市場(chǎng)受到貿(mào)易壁壘及其他政治問題而縮減，鰻魚的銷量、養(yǎng)殖及加工效益就急劇降低[2]。近年來，受到中美貿(mào)易戰(zhàn)影響，從2018年9月份開始鰻魚及制品出口受阻，導(dǎo)致鰻魚收購(gòu)價(jià)格維持在12萬元/t左右，大規(guī)格鰻魚價(jià)格不斷下降，超大規(guī)格收購(gòu)價(jià)格跌破7萬元/t，至2019年1月份跌至6.4萬元/t，還有持續(xù)下跌趨勢(shì)[3]。因此，研發(fā)新產(chǎn)品和新工藝，開發(fā)出能擴(kuò)大出口和內(nèi)銷的適宜產(chǎn)品形式是拓寬國(guó)內(nèi)外兩個(gè)消費(fèi)市場(chǎng)、保障鰻魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必要途徑。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，很多天然蛋白質(zhì)經(jīng)水解后，不但消化吸收性、溶解性、黏度、乳化性等關(guān)鍵參數(shù)能夠得到很大程度的改善，而且還表現(xiàn)出一系列獨(dú)特的生理活性[4-6]。蛋白水解物的制備方法主要有化學(xué)法和酶法?；瘜W(xué)法雖然簡(jiǎn)單價(jià)廉，但由于反應(yīng)條件劇烈，生產(chǎn)過程中氨基酸受損嚴(yán)重，使L-氨基酸形成D-氨基酸，并可能形成有毒物質(zhì)（如氯丙醇等），且難以根據(jù)所需的水解程度對(duì)水解過程進(jìn)行控制[7]。與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，酶法水解條件溫和，氨基酸不被破壞，構(gòu)型不發(fā)生變化，在營(yíng)養(yǎng)成分的保留上有著不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)隨著固定化技術(shù)和膜發(fā)生器的發(fā)展，蛋白酶的成本不斷降低，酶技術(shù)的研究和應(yīng)用更加深入，酶解過程更趨于自動(dòng)化、簡(jiǎn)單化，因此酶法水解成為有效利用蛋白質(zhì)資源的主要方法。

風(fēng)味蛋白酶由米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生，同時(shí)具備內(nèi)切酶和外切酶的活性，是一種被廣泛運(yùn)用的商業(yè)酶[8-9]。此次試驗(yàn)選用風(fēng)味蛋白酶對(duì)鰻魚進(jìn)行水解，對(duì)影響酶解效果的溫度、時(shí)間、pH、酶添加量及底物蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行研究，優(yōu)化確定風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚的適宜條件，為利用酶技術(shù)生產(chǎn)高附加值的鰻魚產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

歐洲鰻魚（鰻鱺），購(gòu)于集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖廠。

1.1.2 主要試劑

風(fēng)味蛋白酶（6萬 U/g），購(gòu)于諾維信（中國(guó)）投資有限公司；干酪素，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；氫氧化鈉、鹽酸、甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、碳酸鈉、硼酸、濃硫酸，均為分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

FiveEasy20型臺(tái)式酸度測(cè)定儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4（雙列）型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；KDC-1044型低速大容量多管離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；FA1004N分析天平，上海精科有限公司；WCJ-802磁力攪拌機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司；722PC型可見分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

將新鮮鰻魚宰殺、清洗、瀝干、絞碎，為保證絞碎程度及原料的均勻一致性，進(jìn)行二次絞碎處理。絞碎后分裝，置于-18 ℃條件下貯藏，備用。

1.2.2 樣品制備

冷凍原料→解凍→加水混勻→調(diào)pH→加酶水解→滅酶→冷卻→離心（3 500 r/min，15 min）→上清液

1.2.3 酶解工藝條件的優(yōu)化

以水解度為指標(biāo)，先采用單因素試驗(yàn)方法研究鰻魚水解所需的適宜溫度和pH，再通過中心組合試驗(yàn)及響應(yīng)面分析方法確定最適底物濃度和加酶量，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化水解時(shí)間。

1.2.4 測(cè)定方法

氨基態(tài)氮含量，甲醛電位滴定法；總氮含量，半微量凱氏定氮法測(cè)定；非蛋白氮含量，樣品加入一定體積10%的三氯乙酸充分研磨，再用10%的三氯乙酸定容，過濾取濾液，用半微量凱氏定氮法測(cè)定含氮量[10]。

1.2.5 計(jì)算方法[11]

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果用SAS軟件進(jìn)行處理分析[12]，所有試驗(yàn)平行3次，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)鰻魚水解效果的影響

固定底物蛋白質(zhì)濃度2.48%，調(diào)節(jié)體系pH 7.0，以1.2萬 U/g比例加入風(fēng)味蛋白酶，分別置于40，45，50，55和60 ℃條件下進(jìn)行水解。1 h后，測(cè)定水解液中的氨基態(tài)氮含量，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 溫度對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚效果的影響

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，水解度隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最高。其原因是：反應(yīng)初始階段，酶促反應(yīng)的速率隨著溫度的升高而增大，故水解得到的氨基態(tài)氮含量增多；但是當(dāng)溫度升高時(shí)，除了酶促反應(yīng)的速率隨之提高外，酶蛋白變性導(dǎo)致酶活力喪失的速率也加快，酶促反應(yīng)受到抑制，水解度下降[12]。因此，在用風(fēng)味蛋白酶對(duì)鰻魚進(jìn)行水解時(shí)，溫度控制在50 ℃左右較為適宜。

2.2 pH對(duì)鰻魚水解效果的影響

固定底物蛋白質(zhì)濃度2.48%，以1.2萬 U/g比例加入風(fēng)味蛋白酶，將體系的pH分別調(diào)整為6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，置于50 ℃溫度條件下進(jìn)行水解。1 h后，測(cè)定水解液中的氨基態(tài)氮含量，計(jì)算水解度，結(jié)果如圖2所示。在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)，水解度隨著pH的增加先升高后下降。pH 7.0時(shí)，水解效果最好，水解度最高；pH高于或者低于7.0，水解度均有一定程度的下降。其主要原因是：pH過高或者過低均會(huì)因酶空間構(gòu)象的改變而使酶失活；另外，pH可以改變底物的解離狀態(tài)，影響它與酶的結(jié)合[13]，因此其水解度相應(yīng)變小。因此，在用風(fēng)味蛋白酶對(duì)鰻魚進(jìn)行水解時(shí)，將體系的pH調(diào)整為7.0所獲得的酶解效果較好。

圖2 pH對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚效果的影響

2.3 最適底物蛋白質(zhì)濃度和加酶量的確定

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)確定的水平范圍（表1），采用中心組合試驗(yàn)優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚的最適底物蛋白質(zhì)濃度和最適加酶量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。以酶解反應(yīng)的水解度為響應(yīng)值，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和回歸分析，結(jié)果分別見表3和表4。

表1 風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗(yàn)的因素水平表

表2 風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表

表4 風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚中心組合試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析表

由表3可知，總模型、線性模型和二次方模型差異顯著，而交互作用不顯著；模型的R2值為0.96，表明模型可以較好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。由表4可知，X1、X2、X12、X22的顯著水平分別為0.001 4，0.000 2，0.011 7和0.026 3，是影響水解效果的主要因素，而X1X2的顯著水平為0.468 4，大于5%，說明這個(gè)因素對(duì)結(jié)果沒有顯著影響。由表4可進(jìn)一步確定風(fēng)味蛋白酶添加量及底物蛋白質(zhì)濃度對(duì)鰻魚水解效果影響的模型，如式（2）所示。

結(jié)合表4的顯著值，可以獲得簡(jiǎn)化的模型，如式（3）所示。

由響應(yīng)面可以預(yù)測(cè)，風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚的最優(yōu)條件為X1=0.383 0，X2=1.168 8，即加酶量為9 532 U/g，底物濃度為19.36%。

2.4 水解時(shí)間對(duì)鰻魚水解程度的影響

在通過上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)酶解條件下（底物蛋白質(zhì)濃度19.36%，加酶量9 532 U/g，溫度50 ℃，pH 7.0），利用風(fēng)味蛋白酶對(duì)鰻魚進(jìn)行水解，分別于2，4，6，8和10 h時(shí)取樣，測(cè)定水解液氨基態(tài)氮含量，計(jì)算水解度，研究處理時(shí)間對(duì)水解效果的影響，結(jié)果如圖3所示。水解度是衡量蛋白質(zhì)酶解程度的重要特征指標(biāo)，與酶解產(chǎn)物的成分和功能特性有直接關(guān)系。近年來，很多學(xué)者針對(duì)不同程度的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，除了分析其肽段分子量、氨基酸組成以外，還對(duì)它們的功能特性及其作為添加劑對(duì)食品品質(zhì)的影響進(jìn)行了研究。李媛媛等[14]研究了堿性蛋白酶水解玉米蛋白產(chǎn)物的抗氧化能力及乳化能力與水解度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，而乳化活性、乳化穩(wěn)定性和ζ電勢(shì)等則呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。胡莉麗等[15]在研究水解度對(duì)麥胚清蛋白酶解物功能特性和抗氧化力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著水解度的增加，酶解產(chǎn)物的溶解性大幅提高，乳化性和乳化穩(wěn)定性剛好相反，而清除自由基能力則是先升高后降低。楊昭等[16]利用胰蛋白酶限制性酶解牡蠣肉，通過感官指標(biāo)、肽段分量分布和游離氨基酸組成，多角度分析了水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物的影響，并比較了加入不同水解度的牡蠣酶解液以后，餅干在感官、色度和風(fēng)味等方面的差異。Noman等[17]利用堿性蛋白酶水解中華鱘蛋白質(zhì)，結(jié)果表明水解物中粗蛋白含量、氨基酸總量、溶解性和抗氧化活性隨著水解度的增大而升高。因此，為了更好地發(fā)揮蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，在食品研發(fā)及加工過程中，應(yīng)該有控制地進(jìn)行水解，精準(zhǔn)制備出符合產(chǎn)品特點(diǎn)的酶解產(chǎn)物。

圖3 時(shí)間對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚效果的影響

因風(fēng)味蛋白酶含有內(nèi)切酶和肽酶，增加了底物的水解位點(diǎn)，能使酶解更徹底。前期試驗(yàn)結(jié)果也表明，相比于中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶以及復(fù)合蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶對(duì)鰻魚具有更高的水解度和總氮回收率。由圖3可以看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解液中的氨基態(tài)氮含量、水解度不斷增加，而且提升跨度很大，由2 h的24.21%增加到10 h的40.55%，為開發(fā)不同氨基酸組成、不同活性功效的鰻魚產(chǎn)品提供更多可能性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以水解度為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚的溫度、pH、底物蛋白質(zhì)濃度、加酶量進(jìn)行了優(yōu)化，研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響。結(jié)果表明，在溫度50 ℃、pH 7.0的條件下，風(fēng)味蛋白酶水解鰻魚的適宜加酶量為9 532 U/g，底物蛋白質(zhì)濃度為19.36%；在試驗(yàn)范圍內(nèi)，水解度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高，10 h時(shí)達(dá)到40.55%。后續(xù)可結(jié)合感官評(píng)分、氨基酸組成及相關(guān)活性分析，進(jìn)一步研究不同水解度的酶解產(chǎn)物性質(zhì)，為有針對(duì)性地開發(fā)高值化鰻魚產(chǎn)品提供更多的數(shù)據(jù)支撐。