崔云前，孟飛，杜俊杰，吉春暉，周長(zhǎng)生

1. 齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南 250353）；2. 菏澤聚鑫源食品有限公司（菏澤 274400）

高濃度啤酒需要利用高濃度的麥汁（麥汁濃度≥15 °P）及高耐性的酵母進(jìn)行釀造，而且普遍將高于18 °P麥汁濃度的啤酒稱為高濃度啤酒，酒精含量大于5%vol的啤酒稱為高酒精度啤酒[1]。雖然其酒精度略微偏高，但風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富、口感上佳，具有十分高的飲用價(jià)值。在高濃度啤酒釀造中，啤酒酵母是重要因素，直接影響成品啤酒的品質(zhì)。酵母在高濃度麥汁發(fā)酵過程中會(huì)受到多個(gè)因素的影響，包括發(fā)酵初期高濃度的糖含量及低溶氧、發(fā)酵后期的高酒精含量等，這些均會(huì)影響酵母的生理狀態(tài)和發(fā)酵性能，造成啤酒的口感及品質(zhì)不佳。此外，高濃度麥汁的制備和發(fā)酵過程的控制等對(duì)高濃度啤酒的品質(zhì)也起著至關(guān)重要的影響。

近幾年，精釀啤酒在國(guó)內(nèi)蓬勃發(fā)展，中高端啤酒的銷售量持續(xù)增長(zhǎng)，啤酒消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)與創(chuàng)新性的要求不斷增高。不過考慮到釀造技術(shù)及生產(chǎn)成本的原因，我國(guó)生產(chǎn)的啤酒仍然以中低端、口感清淡（原麥汁濃度≤15 °P）為主，高濃度啤酒占小部分市場(chǎng)，啤酒種類也相對(duì)單一。以高麥汁濃度、高酒精含量啤酒為主的高端市場(chǎng)被國(guó)外啤酒所占據(jù)。因此，若要增強(qiáng)國(guó)內(nèi)啤酒在中高端市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，對(duì)醇厚濃烈、種類多樣的高濃度啤酒的研究有重要意義。

1 高濃度發(fā)酵對(duì)酵母的影響

1.1 對(duì)酵母的生理狀態(tài)影響

在高濃度發(fā)酵的整個(gè)過程中，發(fā)酵初期高濃度的糖分和發(fā)酵中后期較高的酒精含量均會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生較大的滲透壓：在發(fā)酵前麥汁的滲透壓達(dá)150 Psi以上，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的滲透壓可以到450 Psi以上，酒精含量在6%以上[2]。滲透壓的增加會(huì)引起環(huán)境中水含量降低，所以會(huì)造成一定程度的生理干燥。因?yàn)檩^高的酒精含量導(dǎo)致酵母細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重毒性：酵母細(xì)胞膜的通透性會(huì)由于高的酒精含量發(fā)生改變，使細(xì)胞膜對(duì)H+的透過性加強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)的pH下降，由此改變了酵母細(xì)胞的活性和生理狀態(tài)，降低了糖代謝能力，細(xì)胞的活力也會(huì)減弱，細(xì)胞的生長(zhǎng)得到限制。所以，在高酒精含量及高滲透壓的環(huán)境影響下啤酒酵母的發(fā)酵度、酒精生成量及發(fā)酵速度均會(huì)隨之降低，從而影響經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)[3]。

1.2 對(duì)酵母碳源物質(zhì)代謝的影響

碳水化合物占麥汁的90%～93%。其中異麥芽糖、戊糖、低聚糊精等不可發(fā)酵性糖占26%左右，這些物質(zhì)不能被酵母分解利用，不過會(huì)明顯影響到成品啤酒的品質(zhì)。在約75%的可發(fā)酵糖中，葡萄糖、麥芽糖與麥芽三糖的含量最高，依次占有60%～65%，20%～25%與10%～15%，果糖與蔗糖的含量相對(duì)來說微乎其微[4]。研究表明，麥汁中糖類每個(gè)組分的減少或者增加可能會(huì)同時(shí)改變麥汁可發(fā)酵性糖的比例，從而影響酵母的糖代謝能力[5]。到目前為止，一些啤酒釀造公司普遍都是通過添加適當(dāng)比例的輔料來制備較高濃度的麥汁，常用輔料包括大米、玉米淀粉及麥芽糖漿等，所以麥汁中糖類的組分發(fā)生比較顯著的改變。Rautio等[6]研究表明，如果在麥汁中葡萄糖的比例較高，則酵母的麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性會(huì)明顯地受到抑制，隨著葡萄糖與麥芽糖的比例下降，葡萄糖對(duì)麥芽糖的阻遏效應(yīng)會(huì)出現(xiàn)減緩，麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶的活力得到提升。不過在發(fā)酵的后期，麥芽糖代謝基因的表達(dá)量會(huì)迅速下降。研究表明葡萄糖與麥芽糖的比例太大或者太小均會(huì)對(duì)酵母的糖代謝能力產(chǎn)生一定的負(fù)面作用。

1.3 對(duì)酵母氮源物質(zhì)代謝的影響

酵母的發(fā)酵性能及啤酒品質(zhì)的穩(wěn)定性不能僅僅依靠麥汁中的糖類組分。在啤酒的發(fā)酵階段，酵母還需要利用麥汁里的含氮物質(zhì)來合成細(xì)胞自身的核酸、蛋白質(zhì)等含氮化合物，進(jìn)而完成細(xì)胞的增殖[7]。不過酵母并不是可以吸收并利用所有的含氮物質(zhì)。酵母可以吸收并利用的含氮化合物稱之為游離氨基氮，即銨離子、小分子肽與游離氨基酸的總稱，被視為是在啤酒的釀造中表達(dá)酵母可同化氮水平的重要指標(biāo)[8]。若可同化氮的含量充沛，酵母的降糖速度與增殖速度就會(huì)加快，若含量偏少，則會(huì)導(dǎo)致酵母提前進(jìn)入衰老狀態(tài)。在高濃度啤酒的發(fā)酵過程中，需要更多的游離氮用來平衡高滲透壓及其他的環(huán)境壓力，并且加入一定比例的輔料使麥汁中游離氨基氮含量下降，因此對(duì)酵母的發(fā)酵性能產(chǎn)生影響。所以，在增加麥汁濃度的同時(shí)還需要注意游離氨基氮含量的增加，進(jìn)而使糖代謝能力保持正常，維持較強(qiáng)的細(xì)胞活性。Conner等[9]研究得出，在高濃度發(fā)酵中的麥汁初始游離氨基氮的含量與酵母的增殖速率有較高的相關(guān)性。麥汁中游離氨基氮的含量從160 mg/L增至410 mg/L后，酵母的降糖速率及增殖速率均顯著增強(qiáng)，并且酒精的含量增加了約75%。

2 高濃度啤酒酵母的選育

酵母作為啤酒的“靈魂”，對(duì)啤酒的風(fēng)味及品質(zhì)有著至關(guān)重要的影響。酵母在高濃度麥汁中會(huì)受到高滲透壓和高酒精含量的影響，選育出合適的酵母是進(jìn)行高濃度啤酒發(fā)酵的關(guān)鍵。這類酵母需要擁有較好的耐高酒精含量及耐高滲透壓的能力，具有良好的發(fā)酵性能，這樣才可以確保成品啤酒的風(fēng)味與品質(zhì)的穩(wěn)定性[10]。

目前，很少有與高濃度發(fā)酵啤酒酵母選育相關(guān)的研究報(bào)告，普遍應(yīng)用的技術(shù)包括化學(xué)誘變、物理誘變、連續(xù)培養(yǎng)選擇等方法。凌猛等[11]用啤酒酵母X作出發(fā)菌株，以生化方式進(jìn)行連續(xù)篩選，得到耐高酒精含量（18%）、耐高滲透壓（糖度60%）的啤酒酵母Y。這個(gè)酵母在28 °P高濃度麥汁中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵度和出發(fā)菌株比較增加了3.5%，并且風(fēng)味的組合也更加協(xié)調(diào)；Lies等[12]利用高濃度馴化結(jié)合紫外誘變技術(shù)的方法，得到一株在18 °P高濃度的麥汁中有良好發(fā)酵性能的啤酒酵母菌株，12℃發(fā)酵結(jié)束后酒精度為8.2%vol，比出發(fā)酵母菌株增加了5.2%。Huuskonen等[13]采用EMS誘變方法對(duì)發(fā)酵結(jié)束之后的酵母菌株進(jìn)行處理，接著連續(xù)培養(yǎng)選擇（持續(xù)地往麥汁中加入麥芽糖與麥芽三糖，直到大多數(shù)酵母細(xì)胞失去活性），所得到的酵母菌株發(fā)酵性有明顯的改善，它的發(fā)酵速度相對(duì)于出發(fā)菌株增加了10%～30%，發(fā)酵得更加徹底，并且酵母的絮凝性和親代相似。Mizuno等[14]應(yīng)用培養(yǎng)基篩選的方法，在培養(yǎng)基中加入適量2-去氧-D葡萄糖（2-DOG），然后進(jìn)行優(yōu)勝劣汰的選擇，最終得到一株可以抑制葡萄糖阻遏效應(yīng)的酵母菌株，在20 °P的超高濃度麥汁中發(fā)酵酒精度可達(dá)到9.9%vol，相對(duì)于出發(fā)酵母菌株增加了12.5%。

雖然以上研究利用誘變技術(shù)和連續(xù)培養(yǎng)選擇等方法，得到的酵母菌株可以進(jìn)行高濃度啤酒的釀造，不過截至目前，并沒有專用酵母可以完全適用于高濃度啤酒的生產(chǎn)。所以，需要嘗試對(duì)傳統(tǒng)的誘變育種等方法進(jìn)行改進(jìn)，合理地利用好基因工程技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，潛心于組建適合高濃度啤酒釀造的基因工程菌種探究，期望獲得一株耐高滲透壓、耐高酒精度、副產(chǎn)物的產(chǎn)率高及穩(wěn)定性強(qiáng)的酵母菌株，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高濃度啤酒的大規(guī)模生產(chǎn)。

3 高濃度麥汁的制備

高濃度麥汁的制備，需要高質(zhì)量的麥芽才能制備高濃度的麥汁。溶解度好、糖化力強(qiáng)的麥芽，能夠?qū)⒌矸鄹训厮鉃榭晒┙湍肝绽玫奶?，而且得到的麥汁中含有更高的游離氨基氮。增加游離氨基氮與可發(fā)酵性糖含量的同時(shí)有效避免酵母細(xì)胞活力低造成的發(fā)酵緩慢，得到更加高的酒精產(chǎn)量，降低能源消耗、勞動(dòng)力等，以獲得更多的經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)。

通過研究得出，最佳制備高濃度麥汁的方式有：1）添加各種糖漿以獲得高濃度麥汁；2）增加煮沸時(shí)間或者增加麥芽的使用量。對(duì)于前者，如果在煮沸結(jié)束之前加入糖漿，能夠很好地避免過濾及攪拌等問題，不過糖漿的種類和添加量會(huì)對(duì)麥汁品質(zhì)造成影響，包括使游離氨基氮含量下降及可發(fā)酵性糖的比例發(fā)生改變。想要獲得高濃度的麥汁，需要在增加麥芽使用量時(shí)把控好料水比，在煮沸結(jié)束之前投入適量的糖漿[10]。后者因?yàn)樵黾恿他溠渴褂昧?，?dǎo)致糊化與糖化醪黏度增加，使過濾與攪拌受阻，并且增加了煮沸時(shí)間，加大了能源消耗。

4 高濃度啤酒發(fā)酵過程的控制

國(guó)內(nèi)外研究者提出多種通過途徑對(duì)發(fā)酵過程的控制來解決釀造高濃度啤酒的困難，如提高酵母接種量、補(bǔ)充酵母營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)溶氧量等。Nguyen等[15]研究表明，增加酵母的接種量會(huì)使發(fā)酵液酵母細(xì)胞數(shù)得到增加，乙醇生產(chǎn)速率和糖的利用率也會(huì)升高，不過啤酒的雙乙酰水平也會(huì)同時(shí)提高。研究結(jié)果還顯示，只利用增加接種量的方式，要比往麥汁里加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)效果更佳（酵母提取物及吐溫80）或者將這兩種方法共同進(jìn)行，糖的攝入量、雙乙酰含量、乙醇生產(chǎn)速率及酒精含量均是評(píng)價(jià)的指標(biāo)[16]。Erten等[17]表明，增加酵母接種量會(huì)使發(fā)酵速率加快，2-甲基-1丙醇的含量同時(shí)也會(huì)增加，而2-及3-甲基-1-丁醇的含量減少。不過Verbelen等[18]研究表明，風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生沒有因接種量受到明顯的影響，不過雙乙酰的含量會(huì)明顯增加。

在啤酒的發(fā)酵階段，酵母的生理活性和發(fā)酵性能受到溶氧量的顯著影響。氧對(duì)甾醇及不和飽和脂肪酸的合成有促進(jìn)作用。并且甾醇是酵母細(xì)胞膜的重要成分，充足的麥角甾醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)保持細(xì)胞膜的滲透性、流動(dòng)性以及細(xì)胞膜功能的完整性也有顯著影響[19]。另外，研究發(fā)現(xiàn)線粒體基質(zhì)中的含錳超氧化物歧化物和酵母對(duì)酒精的耐受性有密切聯(lián)系，然而氧和其合成緊密相關(guān)。若在發(fā)酵階段不能對(duì)酵母提供充足的氧，對(duì)其增殖會(huì)造成負(fù)面作用，酵母對(duì)高酒精度、高滲透壓的耐受性下降，進(jìn)而造成發(fā)酵速率下降或減緩。在高濃度啤酒釀造中，因其麥汁濃度的提高，造成麥汁的飽和溶氧量下降，然而相比于常規(guī)發(fā)酵，高濃度釀造中酵母對(duì)氧的需求量更高。因此在高濃度發(fā)酵過程中，需要增加麥汁的溶氧量，以確保在酵母增殖期間能夠提供充足的氧。Heather等[20]研究表明，如果供氧濃度和時(shí)間可以合理有效地控制，發(fā)酵周期能夠明顯縮減，可提高生產(chǎn)效率，降低物質(zhì)消耗。Rees等[21]分別研究了12 °P麥汁與20 °P麥汁中不同含量的鋅離子對(duì)酒精含量及酵母發(fā)酵能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母種類、麥汁濃度大小等因素會(huì)影響鋅離子對(duì)酵母的發(fā)酵能力，提升高濃度麥汁中的鋅離子含量對(duì)于提高酒精含量和酵母的發(fā)酵速率起到正面影響。

此外，高濃度發(fā)酵比常規(guī)發(fā)酵產(chǎn)生更多的泡沫，會(huì)造成發(fā)酵罐的容積率下降，導(dǎo)致不必要的泡沫損失。有關(guān)研究表示，可以在發(fā)酵階段通過變溫控制來處理這一問題，即發(fā)酵初期就使用低溫發(fā)酵直至高泡期，等高泡期過后，再升到正常發(fā)酵溫度[22]。

5 結(jié)語

研究高濃度釀造對(duì)酵母的生理狀態(tài)、發(fā)酵性能及胞內(nèi)代謝情況產(chǎn)生的影響，可為確保選育優(yōu)良的高濃釀造菌株提供根本的理論依據(jù)。酵母菌株的選育、麥芽汁的制備和發(fā)酵過程的控制是影響高濃度啤酒釀造的重要因素，引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。但在實(shí)際生產(chǎn)中，還會(huì)受到原料的選擇、糖化溫度與時(shí)間的確定以及代謝副產(chǎn)物等的影響，因此還需要對(duì)高濃度啤酒釀造的影響因素進(jìn)一步研究，以期生產(chǎn)更高品質(zhì)的啤酒。