(董憲兵 趙 博 周純潔 候美玲 吳彥蕾

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121)

椰毒伯克霍爾德菌可以產(chǎn)生兩種毒素，分別是米酵菌酸(Bongkrek acid)和毒黃素(Toxoflavin)，兩者共同導(dǎo)致了中毒癥狀，米酵菌酸的毒性更強(qiáng)。米酵菌酸是一種熱穩(wěn)定的高度不飽和的三羧酸脂肪酸，具有很強(qiáng)的生物活性，是椰毒假單胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產(chǎn)物，在20世紀(jì)30年代，由荷蘭學(xué)者M(jìn)erten和Vanveen發(fā)現(xiàn)[1]。米酵菌酸基本無味，很難察覺，其耐熱性極強(qiáng)，即使用100℃的開水煮沸或用高壓鍋蒸煮也不能破壞其毒性，進(jìn)食后即可引起中毒。多種食物如自制谷類發(fā)酵食品、銀耳和木耳等易受椰毒假單胞菌污染而產(chǎn)生米酵菌酸毒素，食用含有該毒素污染的食物會(huì)引起人或動(dòng)物中毒，目前對(duì)米酵菌酸尚無特效解毒藥物，一旦中毒，病死率在40%～100%。近年來，我國發(fā)生過多起因食用含有米酵菌酸的食品導(dǎo)致中毒死亡的事件。如2012年山東省臨沂市，2014年云南文山州，2018年廣東省東莞市，2020黑龍江均發(fā)生食用被米酵菌酸污染的食品導(dǎo)致的中毒死亡事件[2-5]。因此，對(duì)食品中米酵菌酸的檢測(cè)是不可或缺的。目前，對(duì)食品中米酵菌酸的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以及近年來發(fā)展起來的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法、超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法等。

1 食品中米酵菌酸檢測(cè)方法

1.1 薄層色譜法

薄層色譜法是將吸附劑或支持劑在玻璃或塑料板涂一薄層，將待分析樣品滴加到薄層上，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┱归_而達(dá)到分離，鑒定和定量分析的目的，具有樣品需求量少，設(shè)備要求簡(jiǎn)單和檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)[6]。薄層色譜法多用于食品中生物活性的測(cè)定、蜂蜜的鑒別、生物堿成分分析等領(lǐng)域[7-9]。早期國內(nèi)外學(xué)者把薄層色譜法應(yīng)用到米酵菌酸的測(cè)定，胡文娟等[10]對(duì)酵米面和銀耳中的米酵菌酸的提取和薄層分離條件進(jìn)行了研究，建立了測(cè)定酵米面和銀耳中的米酵菌酸的薄層色譜法。HU等[11]用交聯(lián)葡聚糖LH-20凝膠過濾和C-18反相柱層析法從玉米粉中分離出米酵菌酸，并用薄層色譜法進(jìn)行識(shí)別和分析。薄層色譜法對(duì)食品中米酵菌酸測(cè)定的應(yīng)用較早，但是因其步驟復(fù)雜，靈敏度低，不適合大批量樣品的檢測(cè)而逐漸被其他檢測(cè)方法替代。

1.2 分光光度法

分光光度法測(cè)定食品中的米酵菌酸，以其操作簡(jiǎn)單，儀器價(jià)格低廉為主要特點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室分析使用的分析方法。2018年馬忠賓等[12]建立了紫外分光光度法測(cè)定食品中的米酵菌酸，并申請(qǐng)了相關(guān)專利，該方法用氨水甲醇溶液作為提取溶劑，處理粉碎后的樣品加入溶劑經(jīng)震蕩、超聲、提取、分液加入碳酸氫鈉溶液分離，加入石油醚分離后濃縮，最后用甲醇溶解后在紫外分光光度計(jì)上比色進(jìn)行測(cè)定。閻立榮[13]應(yīng)用線性組合導(dǎo)數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了能同時(shí)測(cè)定米酵菌酸和毒黃素的分光光度法，此方法克服了各種組分波長(zhǎng)嚴(yán)重重疊時(shí)難以測(cè)定的困難，具有選擇性強(qiáng)，精密度好的優(yōu)點(diǎn)。黃建立[14]用紫外分光光度法測(cè)定變質(zhì)銀耳中米酵菌酸含量，并與高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明測(cè)定結(jié)果無顯著差異。但是分光光度法在測(cè)定食品米酵菌酸中存在專屬性差，靈敏度低的缺點(diǎn)。

1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法測(cè)定食品中的米酵菌酸應(yīng)用研究非常廣泛，GB 5009.189—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》中也是用高效液相色譜法測(cè)定米酵菌酸，但國標(biāo)測(cè)定范圍適用于銀耳及其制品、酵米面及其制品，其他食品類別中的米酵菌酸的測(cè)定還沒有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，而且該標(biāo)準(zhǔn)方法前處理過程繁瑣、有機(jī)試劑消耗量大，難以實(shí)現(xiàn)樣品批量處理。俞穗珍[15]在參照標(biāo)準(zhǔn)的方法基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化的固相萃取方法，提取工藝，進(jìn)樣量的大小，選擇流動(dòng)相pH 值大小，探索出更加快速、便捷、準(zhǔn)確的方法來測(cè)定新鮮銀耳中的米酵菌酸，縮短了樣品前處理周期，減少了有機(jī)試劑的消耗量，節(jié)約了成本。侯佰立[16]應(yīng)用固相萃取技術(shù)并結(jié)合高效液相色譜儀建立了固相萃取-高效液相色譜測(cè)定食品中米酵菌酸殘留的方法，該方法用甲醇和氨水作為提取溶劑，經(jīng)混合型強(qiáng)陰離子固相萃取柱凈化，濃縮過濾后用高效液相色譜儀在267 nm紫外波長(zhǎng)處進(jìn)行分析。結(jié)果表明米酵菌酸測(cè)定結(jié)果在一定線性范圍內(nèi)線性良好，R2為0.999 7，回收率高。李紅艷等[17]通過考察樣品的不同提取條件和不同固相萃取柱的凈化效果，建立了混合型弱陰離子固相萃取富集凈化，高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器快速測(cè)定食品中米酵菌酸殘留的方法。該方法以80%乙腈水為提起溶劑，經(jīng)WAX固相萃取小柱凈化，以269 nm為分析波長(zhǎng)進(jìn)行分析，米酵菌酸在0.1～40 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r值大于0.999。石聲鑫[18]比較了不同提取溶劑和不同萃取工藝對(duì)食品中米酵菌酸提取效率的影響，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定食品中米酵菌酸殘留的方法。蘇永恒[19]優(yōu)化了液相色譜的色譜條件、提取和凈化條件，建立了固相萃取-高效液相色譜方法測(cè)定食品中米酵菌酸含量，可滿足食品中米酵菌酸含量的檢測(cè)要求。周霞[20]采用C18色譜柱，以甲醇和1%乙酸為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm，建立混合型強(qiáng)陰離子(MAX)全自動(dòng)固相萃取富集凈化，超高效液相色譜法快速檢測(cè)食品中米酵菌酸殘留量。但高效液相色譜法分析時(shí)間較長(zhǎng)，易受樣品基質(zhì)干擾致使定性定量出現(xiàn)偏差，對(duì)低濃度樣品定性能力不夠，樣品取樣量較大。

1.4 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

隨著檢測(cè)行業(yè)的飛速發(fā)展，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的應(yīng)用越來越普及。相對(duì)液相色譜法，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)前處理更加簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，專屬性好，靈敏度高，適合大批量樣品的快速檢測(cè)。蘇肯明[21]采用甲醇：0.02 M乙酸銨緩沖溶液(85∶15)為流動(dòng)相，用電噴霧負(fù)離子源(ESI-)進(jìn)行離子化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(MRM)對(duì)米酵菌酸的母離子及子離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定銀耳中的米酵菌酸的新方法。周鵬[22]把粉碎后的銀耳樣品用甲醇提取，混合強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱(PAX)凈化，UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)色譜柱分析，以10 mmol/L乙酸銨-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，建立了快速測(cè)定銀耳中米酵菌酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。曾令浩[23]建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)銀耳中的米酵菌酸的方法。銀耳樣品用甲醇提取后，超聲振蕩，離心分層，上清液用甲醇定容。使用空白基質(zhì)液配置標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下，采用負(fù)離子模式進(jìn)行電離，并通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)目標(biāo)化合物的定量離子和定性離子進(jìn)行測(cè)定。覃冬杰[24]建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定柳州螺螄粉中米酵菌酸的分析方法，該方法通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜方法(色譜柱、流動(dòng)相、質(zhì)譜條件)、提取條件(提取溶劑的選擇)、凈化條件的選擇，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)得到最佳的螺螄粉中的米酵菌酸的測(cè)定方法。曾雪芳[25]研究了不同基質(zhì)米粉和河粉中的米酵菌酸的測(cè)定方法，試樣經(jīng)提取，凈化，濃縮及過濾后，以0.1%甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源負(fù)模式檢測(cè)，外標(biāo)法定量?；诿捉途嵘V和質(zhì)譜行為的研究，對(duì)其儀器測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法靈敏度高，專屬性好，準(zhǔn)確可靠，適用于米粉和河粉基質(zhì)中米酵菌酸的測(cè)定。李紅娜等[26]建立了用液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定配方米粉中米酵菌酸的方法，該方法快速簡(jiǎn)單。用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定米酵菌酸不僅在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在中藥和刑偵檢驗(yàn)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用[27-29]。

1.5 超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)的廣發(fā)應(yīng)用，相對(duì)于常規(guī)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式通過目標(biāo)物的離子對(duì)進(jìn)行定量分析，超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-OrbitrapHRMS)具有分辨率高及定量能力好的優(yōu)點(diǎn)，利用目標(biāo)物母離子的精確分子量直接定量，無需對(duì)目標(biāo)物逐個(gè)優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù)，對(duì)于多目標(biāo)物分析可以極大地降低檢測(cè)方法的時(shí)間，同時(shí)又能很好地避免低分辨質(zhì)譜易受基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性的現(xiàn)象[30，31]。針對(duì)目前測(cè)定米酵菌酸的前處理過程均需要使用混合型陰離子固相萃取柱進(jìn)行凈化，耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑消耗大的問題，梁明[32]建立了QuEChERS+EMR-Lipid結(jié)合超高效液相色譜-四極桿_靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速測(cè)定河粉中的米酵菌酸的方法，該方法采用 QuEChERSEMR-Lipid技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行凈化，可以大大縮短前處理時(shí)間。并且選用高分辨質(zhì)譜對(duì)處理后的樣品進(jìn)行測(cè)定，提高方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。此方法大大縮短前處理時(shí)間，提高食品中米酵菌酸的檢測(cè)分析效率。 Liang等[33]應(yīng)用納米管技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜建立了米粉中米酵菌酸的測(cè)定方法，并設(shè)計(jì)了響應(yīng)面對(duì)前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明該方法適用于米粉中米酵菌酸的測(cè)定，回收率為79.8%～102.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.2%～7.1%。超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法簡(jiǎn)化了分析步驟，提高了分析效率和檢測(cè)準(zhǔn)確性，但是該方法配套儀器購買成本較高，儀器后期維護(hù)保養(yǎng)成本較高，使該方法的推廣普及受到一定的限制。

2 結(jié)論與展望

近年來食品中米酵菌酸污染而引發(fā)的中毒事件時(shí)有發(fā)生，目前國內(nèi)對(duì)米酵菌酸污染的監(jiān)管還處于比較薄弱的環(huán)節(jié)，許多學(xué)者對(duì)米酵菌酸的測(cè)定方法進(jìn)行了大量研究，并且不斷的改進(jìn)。隨著監(jiān)管部門對(duì)米酵菌酸污染問題的重視，米酵菌酸污染將會(huì)納入監(jiān)管范疇，但是目前只有GB 5009.189—2016這一項(xiàng)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液相色譜法對(duì)米酵菌酸測(cè)定，該方法樣品需求量較大，前處理步驟復(fù)雜，溶劑消耗量大。目前，急需開發(fā)更加快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法將成為該領(lǐng)域重點(diǎn)研究方向之一。隨著實(shí)際檢測(cè)需求和技術(shù)水平的不斷提高，色譜檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)逐漸由低分辨向高分辨方向發(fā)展，以滿足建立高靈敏度、高選擇性、高分析通量、簡(jiǎn)便快速實(shí)用分析方法的需要。