(王鳳軍 陳 強(qiáng) 葉素丹 許海鋒 宣紅霞 楊伊平 周葉熹

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州 310012)

《2019年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)》報(bào)告顯示全球轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植面積已達(dá)到1.904億公頃[1]。從1996年到2019年，全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化24年間，種植面積增長了約112倍，全球29個(gè)國家/地區(qū)累計(jì)種植27億公頃[1]。全球共有71個(gè)國家/地區(qū)在食品、飼料和加工方面應(yīng)用了轉(zhuǎn)基因作物，已批準(zhǔn)4 485項(xiàng)文件，涉及29種轉(zhuǎn)基因作物的403個(gè)轉(zhuǎn)化體[1]。轉(zhuǎn)基因玉米在轉(zhuǎn)基因作物中占有非常重要的地位，種植面積逐年穩(wěn)步上升。截至2019年，全球轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積近6069萬公頃，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的31.87%，占世界玉米總面積的31%左右[1]，當(dāng)前已經(jīng)培育出了抗旱、抗蟲、抗除草劑、抗病等多種性狀的共238個(gè)轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)基因玉米。目前國外主要種植的轉(zhuǎn)基因玉米品系有Mon89034、MIR162、Bt11等品系。截至2019年8月，我國批準(zhǔn)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體共計(jì)21個(gè)[3]。

隨著我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的快速發(fā)展，研究、實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)、加工、經(jīng)營和進(jìn)口環(huán)節(jié)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物種類不斷增多，需強(qiáng)化研究實(shí)驗(yàn)源頭、田間種植和進(jìn)口加工環(huán)節(jié)監(jiān)管，加強(qiáng)標(biāo)識(shí)管理和科普宣傳，切實(shí)履行《種子法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)簽的標(biāo)識(shí)》，保障農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究與應(yīng)用健康發(fā)展，保障公眾知情權(quán)和選擇權(quán)[4，5]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)給人類帶來諸多幫助，但也存在潛在的安全問題，如破壞生態(tài)環(huán)境、引起抗生素耐性、造成基因漂移、引發(fā)食物過敏、隱含對(duì)人及動(dòng)物的潛在毒性等問題[6-9]。國外已批準(zhǔn)種植和正在研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品系越來越多，但我國還未頒發(fā)轉(zhuǎn)基因玉米種子生產(chǎn)許可證，所有轉(zhuǎn)基因玉米品系均不可在我國進(jìn)行商業(yè)化種植，僅能用作飼料或加工原料，因此有必要對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米品系進(jìn)行篩查，控制未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系在市場上的流通。

轉(zhuǎn)基因成分的篩查檢測及品系快速鑒定主要有蛋白質(zhì)檢測方法和核酸檢測方法。由于蛋白質(zhì)檢測方法的局限性，以常規(guī) PCR[10，11]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[12，13]、實(shí)時(shí)熒光PCR[14-16]、數(shù)字PCR[18，19]為主的核酸檢測方法逐漸成為主要的檢測手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新型高效的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)也不斷被研發(fā)出來。如徐君怡等[20]將Taqman微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光平臺(tái)可同時(shí)檢測17種轉(zhuǎn)基因玉米品系，檢出限可達(dá)10～20拷貝，符合歐盟轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法最低性能要求；Piednoir等[21]利用高通量測序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌進(jìn)行測序，通過序列比對(duì)設(shè)計(jì)引物和特異性探針進(jìn)一步運(yùn)用qPCR進(jìn)行確認(rèn)鑒定；Turkec等[22]設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)基因檢測DNA芯片，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和玉米共設(shè)計(jì)了1 830個(gè)探針，可用于區(qū)分 12個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，并開發(fā)了一套數(shù)據(jù)算法來實(shí)現(xiàn)最大的檢測通量和靈敏度。這些檢測技術(shù)雖然通量較高，但檢測技術(shù)較為復(fù)雜，結(jié)果分析需要通過生物信息學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過程依賴于昂貴的設(shè)備與試劑，較難在日常檢測過程中廣泛應(yīng)用。急需一種準(zhǔn)確高效、簡易可行、高通量的轉(zhuǎn)基因成分識(shí)別和檢測技術(shù)，保障食品農(nóng)產(chǎn)品安全和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展。

本研究通過靶標(biāo)基因篩選，轉(zhuǎn)基因陽性樣品采集，核酸樣本制備，多重引物和熒光探針組合篩選，反應(yīng)體系優(yōu)化以及方法學(xué)驗(yàn)證等過程開發(fā)建立了四重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)。該技術(shù)的使用可實(shí)現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測MIR162、Bt11、Mon89034三個(gè)玉米品系的特異性基因序列和一個(gè)玉米內(nèi)源基因，縮短檢測時(shí)限，節(jié)約試劑耗材成本，操作簡單易行，滿足高通量特征，為市場流通產(chǎn)品品系和轉(zhuǎn)基因成分的實(shí)時(shí)監(jiān)管和快速鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

10%MIR162、10%Mon89034、10%Bt11、10%Mon810、100%Mon863、10%NK603、100%Bt176等轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品；CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J273/J213，F(xiàn)APAS GeMSU 56A/56B均為中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)/英國食品與環(huán)境研究院(FAPAS)能力驗(yàn)證樣品；玉米陰性樣本為“晶甜3號(hào)”“中農(nóng)甜488(ZNT488)”“金甜玉808”“泰甜8號(hào)”“華珍”“珍甜6號(hào)”“金甜60”“珍早18”“甜糯3號(hào)”“加甜糯11號(hào)”。玉米深加工產(chǎn)品為本實(shí)驗(yàn)室2020年市售產(chǎn)品，共41個(gè)批次。

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(DP305)、深加工食品DNA提取試劑盒(DP326)、QuantiFast Multiplex PCR Master Mix (204754)、探針與引物(Taqman)：委托機(jī)構(gòu)合成。

1.3 方法

1.3.1 樣本核酸提取

將玉米種子和果實(shí)等未加工樣本采用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)提取基因組DNA。玉米深加工制品采用深加工食品DNA提取試劑盒(DP326)提取基因組DNA，其中，裂解、分離、洗滌等過程按照試劑盒說明書操作，在DNA洗脫時(shí)，為增加基因組DNA得率，用50 μL進(jìn)行洗脫，將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2 min后離心，獲取的DNA溶液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物和探針設(shè)計(jì)

通過國際環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)庫(CERA GM crop database，http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database)和加拿大轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品庫(http://www.agbios.com/dbase.php)收集得到目前已公開報(bào)道的商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系信息，分析國外流通的常見品系以及我國批準(zhǔn)應(yīng)用和重點(diǎn)監(jiān)控的轉(zhuǎn)化體信息，選定MIR162、Mon89034、Bt11轉(zhuǎn)基因玉米為檢測靶標(biāo)，選定玉米內(nèi)源基因編碼玉米淀粉合成酶異構(gòu)體zSTSII-2(zSSIIb)作為體系質(zhì)控物，通過NCBI和國內(nèi)外專利檢索得到三種玉米品系的特異性序列。采用 Vector NTI 11. 5 軟件和Express 3.0軟件在在其外源插入片段 3′端與玉米基因組的連接區(qū)序列上設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并在NCBI Blast中進(jìn)行產(chǎn)物特異性驗(yàn)證。探針熒光基團(tuán)按照設(shè)備性能進(jìn)行選擇性標(biāo)記，淬滅基團(tuán)按照?qǐng)?bào)告基團(tuán)偏好確定。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因玉米品系多重?zé)晒釶CR方法建立

1.3.3.1 轉(zhuǎn)基因玉米品系單轉(zhuǎn)化體特異性驗(yàn)證

提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11以及非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488基因組DNA，加入1.3.2設(shè)計(jì)的引物探針，采用GB/T 19295.5—2018《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測方法》[23]標(biāo)準(zhǔn)中反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行單重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，驗(yàn)證單個(gè)轉(zhuǎn)化體引物探針設(shè)計(jì)的特異性。

1.3.3.2 轉(zhuǎn)基因玉米品系多重?zé)晒釶CR反應(yīng)條件優(yōu)化

提取的MIR162、Mon89034、Bt11玉米基因組DNA，按照1∶1∶1進(jìn)行混合，得到3個(gè)品系的混合DNA溶液，以此作為模板，使用引物和探針對(duì)進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，以玉米內(nèi)源基因zSSIIb擴(kuò)增情況監(jiān)控反應(yīng)的有效性。通過單個(gè)轉(zhuǎn)化體的退火溫度梯度(52～64 ℃)確定各靶標(biāo)基因的最佳退火溫度區(qū)間，然后在共有區(qū)間范圍內(nèi)設(shè)置溫度梯度，確定四重實(shí)時(shí)熒光PCR的最佳退火溫度。以此退火溫度，通過上下游引物和探針濃度十字交叉法(0.1～1.5 μL)確定4個(gè)靶標(biāo)基因的引物探針的最佳濃度組合，最終確認(rèn)多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系和參數(shù)。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI QuantStudio Q5實(shí)時(shí)熒光PCR儀中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，以MIR162、Mon89034、Bt11轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品的混合DNA為陽性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488為陰性對(duì)照，并設(shè)置非模板空白對(duì)照，以驗(yàn)證4個(gè)靶標(biāo)基因之間有無信號(hào)干擾以及實(shí)驗(yàn)操作過程是否被污染。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因玉米品系多重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測

提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11、NK603、T25、Bt176、Mon863、Mon810以及非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488基因組DNA，對(duì)已知單組分DNA或多組分DNA使用多重?zé)晒舛縋CR體系進(jìn)行多重檢測，驗(yàn)證反應(yīng)體系的特異性。

1.3.5 靈敏度檢測

提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11樣本基因組DNA，并按1∶1∶1比例混合作為DNA模板原液，將其進(jìn)行10倍系列稀釋，共稀釋5個(gè)梯度，稀釋介質(zhì)為滅菌蒸餾水。根據(jù)玉米的單倍體基因組DNA長度為2 504 bp，混合樣本經(jīng)核酸蛋白分析儀測定濃度為20 ng/μL，按照式(1)計(jì)算玉米樣品中的拷貝數(shù)[23]。將稀釋后的DNA溶液為模板進(jìn)行四重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增得到的Ct值和DNA模板拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算4個(gè)檢測靶標(biāo)的擴(kuò)增效率和檢測低限。

(1)

式中：N為DNA拷貝數(shù)；ContDNA為DNA量/ng；LenDNA為基因組DNA長度/bp。

1.3.6 適用性檢測

收集玉米種子，玉米深加工食品，轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品以及能力驗(yàn)證盲樣等用品，其中包括實(shí)驗(yàn)室收集的轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品6種(Mon89034、MIR162、Bt11、MON863、MON810、NK603)及其混合DNA樣本5種，中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)組織的能力驗(yàn)證樣品(T067-J273)，英國FAPAS分析實(shí)驗(yàn)室組織的能力驗(yàn)證樣品(GeMSU56A和GeMSU568)；來自不同農(nóng)作物種子市場和互聯(lián)網(wǎng)農(nóng)作物銷售商等10個(gè)玉米品系種子樣本(晶甜3號(hào)、ZNT488、金甜玉808、泰甜8號(hào)、華珍、珍甜6號(hào)、金甜60、珍早18、甜糯3號(hào)、加甜糯11號(hào))，作為可種植的農(nóng)作物活生物體代表。來自于農(nóng)貿(mào)市場和超市的41份玉米食品，即罐裝玉米(11批次)、玉米粉(20批次)、爆米花(10批次)。應(yīng)用四重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)這64份玉米及其深加工制品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因品系及轉(zhuǎn)化體成分進(jìn)行檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品核酸提取結(jié)果

提取的DNA溶液經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰明亮，完整性好。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，OD260/280大于1.5表明核酸純度較高，蛋白質(zhì)殘留較少；OD260/230大于1.0，表明有機(jī)試劑和多糖的污染較低，提取的核酸較純。結(jié)果表明提取效果良好，可用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。

2.2 引物和探針標(biāo)記和篩選結(jié)果

針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)源基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034和Bt11轉(zhuǎn)化體目標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，為能在1個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測4個(gè)靶標(biāo)，按照設(shè)備性能使用不同的報(bào)告基團(tuán)和非熒光淬滅基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。將以上引物和探針采用GB/T 19295.5—2018《基因產(chǎn)品檢測 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)中反應(yīng)體系和參數(shù)分別對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11以及非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488基因組DNA進(jìn)行單重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，得到單轉(zhuǎn)化體的擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。篩選出用于多重?zé)晒釶CR的引物和探針序列見表1。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米品系特異性檢測的引物和探針序列

2.3 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

為了能夠在同一反應(yīng)管中檢測4個(gè)靶標(biāo)基因，并保持較高的反應(yīng)效率，需對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化。由于使用了商用化的多重?zé)晒舛縋CR預(yù)混液，主要優(yōu)化的參數(shù)有退火溫度、引物和探針濃度等。通過對(duì)MIR162、Mon89034、Bt11單一轉(zhuǎn)化體以及內(nèi)源基因zSSIIb分別設(shè)置退火溫度梯度，進(jìn)行單重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)退火溫度太低時(shí)Ct出現(xiàn)的較晚，影響結(jié)果的靈敏度；當(dāng)退火溫度較高時(shí)無明顯的指數(shù)型生長曲線。以MON89034為例，見圖1，結(jié)果表明在56～58 ℃時(shí)3個(gè)轉(zhuǎn)化體和內(nèi)源基因均能有較好的擴(kuò)增，且在該溫度區(qū)間設(shè)置梯度進(jìn)行四重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)最佳退火溫度為58 ℃。

圖1 mon89034退火溫度梯度單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增曲線圖

通過十字交叉法和熒光標(biāo)記的強(qiáng)弱與熒光信號(hào)之間的關(guān)系進(jìn)行了引物和探針濃度優(yōu)化，最終確定了最佳引物和探針濃度。優(yōu)化后的擴(kuò)增體系見表2。優(yōu)化后的擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 s；95℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，變性和退火延伸共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

表2 轉(zhuǎn)基因玉米品系的四重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液組成

2.4 多重?zé)晒釶CR特異性檢測結(jié)果

提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11、NK603、T25、Bt176、Mon863、Mon810以及非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488基因組DNA，使用多重?zé)晒舛縋CR體系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因品系鑒定，驗(yàn)證方法的特異性。圖2分別為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合樣本、轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、轉(zhuǎn)基因玉米Mon863/NK603/T25/Bt176混合樣本以及非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果。內(nèi)源基因zSSIIb均產(chǎn)生了明顯的S型擴(kuò)增曲線，Ct值小于35，表明DNA提取過程和實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增有效。轉(zhuǎn)基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合樣本為模板的反應(yīng)管中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11三個(gè)品系的轉(zhuǎn)化體特異性基因序列均檢出，表明樣品中含有這三種玉米品系的轉(zhuǎn)化體成分；在圖2b～圖2d中轉(zhuǎn)化體特異性靶標(biāo)基因僅在含有該基因的轉(zhuǎn)化體玉米品系為模板的反應(yīng)管中檢出，非該轉(zhuǎn)化體玉米品系不檢出；在圖2e～圖2f中，Mon863/NK603/T25/Bt176混合樣本和非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488為模板的反應(yīng)管中都僅有玉米內(nèi)源基因zSSIIb檢出，3種玉米品系的轉(zhuǎn)化體特異性基因均未檢出，表明這些樣品中不含有這3種玉米品系的轉(zhuǎn)化體成分。

注：a為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162/Mon89034/Bt11混合樣本；b為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162；c為轉(zhuǎn)基因玉米Mon89034；d為轉(zhuǎn)基因玉米Bt11；e為轉(zhuǎn)基因玉米Mon863/NK603/T25/Bt176混合樣本；f為非轉(zhuǎn)基因玉米ZNT488。

以滅菌蒸餾水為模板的空白對(duì)照管中無熒光信號(hào)，表明檢測基因之間無信號(hào)干擾，多重實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)結(jié)果與期望結(jié)果一致，表明引物探針的設(shè)計(jì)及反應(yīng)體系的設(shè)置具有特異性，可用于玉米轉(zhuǎn)基因品系及其轉(zhuǎn)化體成分的快速鑒定。

2.5 多重?zé)晒釶CR重復(fù)性和靈敏度檢測

通過建立轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、Mon89034、Bt11混合DNA溶液梯度稀釋后四重實(shí)時(shí)熒光PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析擴(kuò)增的Ct值。四個(gè)基因相關(guān)系數(shù)R2為0.995～0.998。同一基因同一稀釋梯度范圍內(nèi)Ct值的變異系數(shù)較小，重復(fù)性較好，如圖3所示。zSSIIb基因線性回歸方程為y=-3.152x+35.746，Ct值變化范圍在22.366～35.324之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.037～0.305，R2為0.996，擴(kuò)增效率為107%；MIR162轉(zhuǎn)化體特異性基因線性回歸方程為y=-3.295x+37.677，Ct值變化范圍在23.763～37.680，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.084～0.647，R2為0.998，擴(kuò)增效率為101%；Mon89034轉(zhuǎn)化體特異性基因線性回歸方程為y=-3.458x+39.236，Ct值變化范圍在24.701～38.912，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.160～0.876，R2為0.996，擴(kuò)增效率為94.6%；Bt11轉(zhuǎn)化體特異性基因線性回歸方程為y=-3.266x+39.510，Ct值變化范圍25.844～38.990，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.054～0.366，R2為0.997，擴(kuò)增效率為102%，表明該四重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系穩(wěn)定靈敏，最低檢測限可達(dá)18個(gè)拷貝。

2.6 樣品檢測結(jié)果

對(duì)市場流通的41份玉米加工食品樣品，6種轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品及其5種標(biāo)準(zhǔn)品混合樣本，不同農(nóng)作物種子市場和互聯(lián)網(wǎng)農(nóng)作物銷售市場流通的10份農(nóng)作物活生物體種子樣本，3份非玉米成分樣本，以及3份能力驗(yàn)證盲樣樣本等68份分樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因品系及轉(zhuǎn)化體成分進(jìn)行檢測分析。同時(shí)按照GB/T 19295.5—2018《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測方法》中所述的引物和探針、檢測步驟和反應(yīng)程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測[23]，結(jié)果見表3。使用本研究建立的四重實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測實(shí)驗(yàn)室收集的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品、能力驗(yàn)證盲樣和陽性樣本，檢測結(jié)果與樣本信息一致。使用四重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測10個(gè)玉米種子樣本和41份玉米及其深加工制品樣本結(jié)果與單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果一致，只有內(nèi)源基因zSSIIb檢出，均為陰性結(jié)果。使用四重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測檢測非玉米成分產(chǎn)品，4個(gè)靶標(biāo)基因均無信號(hào)。表明本實(shí)驗(yàn)研究開發(fā)的四重實(shí)時(shí)熒光PCR快速品系鑒定體系適用于玉米轉(zhuǎn)基因品系及其轉(zhuǎn)化體成分的快速鑒定，尤其是大量樣本的快速檢測。

表3 四重?zé)晒舛縋CR適用性檢測結(jié)果

3 討論

轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)商業(yè)化在不斷加速推進(jìn)，但目前我國被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物僅有棉花和木瓜，批準(zhǔn)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因品種包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜等，但進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因品種只能用作加工原料，不允許在國內(nèi)種植。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品合規(guī)性監(jiān)控和檢測方法種類繁多，其中蛋白質(zhì)免疫印跡法實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，耗時(shí)較長(通常在5 h以上)，檢測通量小，使用試劑復(fù)雜；酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度較PCR方法低，當(dāng)外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)含量極低時(shí)，難以檢測出來；膠體金免疫層析法雖操作簡便、耗時(shí)短，但檢測靈敏度偏低，經(jīng)過加工的轉(zhuǎn)基因食品中靶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，不能被抗體識(shí)別。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)成本低廉，適合大規(guī)模篩查，但其對(duì)靶序列存在一定的限制，假陽性問題較為嚴(yán)重，易受到實(shí)驗(yàn)室氣溶膠的污染容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；基因芯片技術(shù)對(duì)于轉(zhuǎn)基因食用農(nóng)產(chǎn)品的檢測，從實(shí)驗(yàn)成本考慮，價(jià)格過于昂貴，不適宜普遍推廣應(yīng)用。為提高轉(zhuǎn)基因檢測的準(zhǔn)確性和時(shí)效性，急需開發(fā)建立能同時(shí)多基因檢測且能避免常規(guī)PCR法缺陷的新方法。

多重?zé)晒舛縋CR方法兼具了熒光PCR實(shí)時(shí)定量與多重反應(yīng)高通量的特征，是大批量樣本篩查檢測和快速鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)已研發(fā)出可同時(shí)對(duì)番茄、大豆、玉米等農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行篩查檢測的四重實(shí)時(shí)熒光PCR，在品系鑒定方面研究應(yīng)用較少。本研究通過檢索國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)庫，從國內(nèi)轉(zhuǎn)基因監(jiān)控較為關(guān)注的轉(zhuǎn)基因玉米品系中確定檢測靶標(biāo)，建立多重?zé)晒釶CR檢測技術(shù)。通過檢測質(zhì)控，方法學(xué)驗(yàn)證等確保檢測準(zhǔn)確性和可靠性。

4 結(jié)論

本研究利用實(shí)時(shí)熒光PCR法，根據(jù)多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)中的特異性S曲線與對(duì)應(yīng)的閾值大小判斷被檢樣品中是否含有MON89034、MIR162、Bt11轉(zhuǎn)基因玉米品系及其轉(zhuǎn)化體成分。該檢測方法設(shè)置了核酸提取質(zhì)控、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，可同時(shí)檢測玉米內(nèi)源基因和3個(gè)玉米品系的特異性靶標(biāo)基因，擴(kuò)增效率均在90%～110%范圍內(nèi)，最低檢測限為18個(gè)拷貝。該方法可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)孔中同時(shí)檢測四個(gè)無熒光信號(hào)干擾的靶標(biāo)基因，操作簡單易行，從DNA提取到報(bào)告結(jié)果耗時(shí)不足 3 h，適用于大量樣品的高通量檢測，可為轉(zhuǎn)基因玉米品系的快速鑒定和篩查提供參考。