(陳鑫璐 邱 月 張建友 丁玉庭 呂 飛

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，杭州 310014)

1 谷物真菌毒素概述

1.1 真菌毒素

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物[1]，對(duì)肝臟、腎臟、造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)有嚴(yán)重的毒性，同時(shí)還有致癌、致突變、致畸等作用[2，3]。目前已發(fā)現(xiàn)了近400種真菌毒素[4]，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)估計(jì)每年有高達(dá)25% 的糧食受到真菌毒素的污染，而實(shí)際真菌毒素污染發(fā)生率(60%～80%)遠(yuǎn)高于25%[5，6]。

1.2 谷物中常見(jiàn)真菌毒素

谷物是真菌毒素的主要污染對(duì)象之一，谷物中常見(jiàn)的真菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌毒素、嘔吐毒素、T-2毒素、HT-2毒素和玉米赤霉烯酮等[2]，其毒性作用主要有致癌、致畸、損害肝腎功能，還具有細(xì)胞毒性和胚胎毒性，也會(huì)導(dǎo)致皮下出血與皮膚壞死、雌激素綜合癥等[7]。

1.3 谷物中多種毒素共存情況

谷物在種植、收獲、運(yùn)輸及儲(chǔ)藏過(guò)程中都可能遭受產(chǎn)毒真菌污染，受到污染谷物往往同時(shí)含有多種真菌毒素，并易產(chǎn)生復(fù)雜的毒性作用[4]。多種真菌毒素共存通常會(huì)產(chǎn)生協(xié)同毒性增強(qiáng)效應(yīng)。有研究證實(shí)，低于國(guó)家食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、ZEN和黃曲霉毒素B1(AFB1)共存時(shí)能造成細(xì)胞代謝的嚴(yán)重紊亂[8]。黃曲霉毒素G1(AFG1)、伏馬菌素B1(FB1)、OTA以及雜色曲霉毒素(ST)也被發(fā)現(xiàn)具有聯(lián)合肝細(xì)胞毒性，其中OTA 與 FB1之間存在中度協(xié)同作用[9]。Sobral等[10]研究證實(shí)，OTA-DON和AFB1-DON組合對(duì)肝、腸上皮細(xì)胞均有協(xié)同毒性作用。除此之外，OTA和FB1也被證實(shí)對(duì)肝、腎細(xì)胞系中具有協(xié)同毒性效應(yīng)[11]。動(dòng)物體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)了類似的毒素間協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致毒性增強(qiáng)的現(xiàn)象，如FB1和AFB1共存時(shí)會(huì)產(chǎn)生協(xié)同肝、腎毒性與致癌作用[12]。真菌毒素種類繁多，其在谷物中的共存情況受到谷物種類、產(chǎn)區(qū)、氣候等多種條件的影響，相關(guān)規(guī)律尚不明確；另一方面，對(duì)于多種毒素的協(xié)同毒性作用，迄今為止仍缺乏系統(tǒng)、有效的評(píng)估策略，因此，世界各國(guó)尚未對(duì)多種毒素共存問(wèn)題作出明確規(guī)定。但大量數(shù)據(jù)表明，毒素間的協(xié)同毒性增強(qiáng)效應(yīng)會(huì)在低于單一毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的劑量下對(duì)人和動(dòng)物的健康造成較大威脅，因而必須引起重視。

除不同種類毒素的協(xié)同毒性效應(yīng)外，一些真菌毒素本身具有多種對(duì)健康有負(fù)面影響的衍生物。研究表明，在某些情況下DON的乙酰化衍生物3A-DON和15A-DON的毒性作用甚至高于其本體[13]，乙?；腄ON在生物體內(nèi)可全部或部分水解以釋放母體糖苷配基轉(zhuǎn)化成DON，潛在地増加了DON攝入量[14]。ZEN及其代謝產(chǎn)物ZOL也被證明均具有雌激素效應(yīng)，α-ZOL的效應(yīng)強(qiáng)度約為ZEN及β-ZOL的2～4倍[15]。因此，高效準(zhǔn)確的多類型真菌毒素同步檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)對(duì)準(zhǔn)確分析谷物的真菌毒素的污染情況，降低由此引發(fā)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義[3]。

2 谷物中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

2.1 限量標(biāo)準(zhǔn)

由于真菌毒素對(duì)人與動(dòng)物健康的潛在威脅，各國(guó)和地區(qū)對(duì)谷物中諸多真菌毒素均建立了嚴(yán)格的限量規(guī)定，尤其是一些毒性較強(qiáng)的種類。不同國(guó)家和地區(qū)制定的限量水平參差不齊，限量標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的食品基質(zhì)適用范圍具有較大差異，缺乏相對(duì)的統(tǒng)一性。

2.1.1 黃曲霉毒素

如表1所示，AFB1是目前已發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的黃曲霉毒素，我國(guó)針對(duì)不同谷物中AFB1的最高允許量進(jìn)行了嚴(yán)格的分類規(guī)定。日本規(guī)定食品中的黃曲霉毒素限量為10 μg/kg。美國(guó)規(guī)定一般食品中黃曲霉毒素含量不得超過(guò)15 μg/kg。歐盟對(duì)谷物和谷物制品中黃曲霉毒素的限量有更加細(xì)致的分類標(biāo)準(zhǔn)，既對(duì)谷物和谷物產(chǎn)品中黃曲霉毒素總量(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)進(jìn)行了規(guī)定，又特別標(biāo)明了其中AFB1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。

表1 國(guó)內(nèi)外主要谷類產(chǎn)品中真菌毒素限量[16-19]

2.1.2 赭曲霉毒素

OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)情況與黃曲霉毒素基本相同，世界范圍內(nèi)的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5～50 μg/kg。赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC)毒性較OTA小，在谷物中并不常見(jiàn)，目前尚未制定關(guān)于OTB和OTC的限量標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 單端孢霉烯族毒素和伏馬毒素

對(duì)于DON大多數(shù)國(guó)家都有嚴(yán)格的限量規(guī)定，但對(duì)T-2、HT-2和伏馬菌毒素制定限量標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)家則較少，我國(guó)在2008年發(fā)布過(guò)配合飼料中T-2的允許量(GB 21693—2008)，但現(xiàn)已廢止，也未有新的限量標(biāo)準(zhǔn)替代；我國(guó)對(duì)HT-2和伏馬菌毒素的限量也沒(méi)有明確規(guī)定。

2.1.4 玉米赤霉烯酮

我國(guó)國(guó)標(biāo)規(guī)定小麥和玉米中ZEN的限量為60 μg/kg，歐盟對(duì)其限量有嚴(yán)格規(guī)定，國(guó)際上對(duì)于該毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)范圍在20～350 μg/kg之間。日本、美國(guó)和CAC對(duì)玉米赤霉烯酮的限量沒(méi)有明確規(guī)定。

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)比國(guó)內(nèi)外食品真菌毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(表2)，歐盟的谷物真菌毒素檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展較早，大多采用免疫親和柱凈化或固相萃取等前處理手段，聯(lián)合高效液相色譜法檢測(cè)。HPLC具有較高的可靠性，但對(duì)于性質(zhì)相近的物質(zhì)難以有效分離，需要一定的前處理步驟來(lái)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。免疫親和柱操作簡(jiǎn)單、分析快速、精密度高，可以獲得純凈的樣品提取物，同時(shí)避免了大量有機(jī)試劑的使用，但缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴大大提高了檢測(cè)成本。固相萃取效率高，溶劑用量少，但不具備免疫親和柱的特異性，因而可能因樣品凈化不徹底影響后續(xù)檢測(cè)。此外，一些標(biāo)準(zhǔn)在樣品前處理中使用了衍生化方法以調(diào)整待測(cè)毒素的色譜性質(zhì)，從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，但衍生化步驟繁瑣，衍生不完全時(shí)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成較大影響。我國(guó)在2016年頒布了一系列谷物中真菌毒素檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。與歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(European Committee for Standardization, CEN)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization，ISO)體系相比，我國(guó)真菌毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中所涉及的樣品種類更多。在毒素種類上，我國(guó)現(xiàn)已制定了T-2毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 3136—2012)，這在國(guó)外真菌毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中尚未出現(xiàn)。檢測(cè)技術(shù)上，我國(guó)率先規(guī)范了使用LC-MS同步檢測(cè)食品中多種真菌毒素的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 3136—2012)，還涉及LC-MS與同位素稀釋相結(jié)合的檢測(cè)方法。液質(zhì)聯(lián)用對(duì)樣品前處理的要求相對(duì)較低，且相比單純使用液相色譜檢測(cè)具有更高的可靠性和檢測(cè)靈敏度，是目前多種毒素同步檢測(cè)最為有效的方法，但缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴，且對(duì)操作人員技術(shù)要求較高。同位素稀釋法只需對(duì)復(fù)雜混合物體系進(jìn)行部分分離、純化就可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，但是操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理也更耗時(shí)。

表2 中國(guó)與歐盟現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中多種真菌毒素在谷物中的檢測(cè)方法[19-25]

此外，在我國(guó)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)中，谷物中多種真菌毒素的同步檢測(cè)技術(shù)也有涉及。在SN/T 3136—2012中，將LC-MS/MS作為花生、谷類及其制品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的同步檢測(cè)方法；在DB34/T 2776—2016中，采用LC-MS分兩步對(duì)谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素(DON、15A-DON、3A-DON)、黃曲霉素(B1、B2、G1、G2)、伏馬毒素(FB1、FB2)和ZEN進(jìn)行測(cè)定，但上述檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)只有檢測(cè)限。在LS/T 6133—2018中，利用LC-MS同步檢測(cè)谷物中的16種真菌毒素，并能對(duì)16種真菌毒素進(jìn)行定量檢測(cè)。但是以上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法滿足歐盟真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)中嬰幼兒食品不得檢出AFT和OTA低于0.5 μg/kg的限量要求。因此，建立高靈敏度、高通量的真菌毒素同步檢測(cè)方法至今仍是食品安全領(lǐng)域的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，亟需進(jìn)一步發(fā)展和規(guī)范化。

3 多種真菌毒素同步檢測(cè)方法

近年來(lái)，多種毒素同步檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展相對(duì)較為迅速。論文綜述了真菌毒素同步檢測(cè)方法，主要包括ELISA、免疫層析、分子技術(shù)、生物傳感、高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附法是將已知的抗原或抗體固定于固相載體表面，使酶標(biāo)抗原或抗體與之發(fā)生特異性結(jié)合[26]。目前根據(jù)ELISA技術(shù)開(kāi)發(fā)的商業(yè)化的真菌毒素檢測(cè)試劑盒已在市場(chǎng)上廣泛推廣，Dong等[27]基于酶聯(lián)免疫吸附，開(kāi)發(fā)了一種能同步檢測(cè)ZEN及其5種主要類似物的方法。不同基質(zhì)樣品ZEN及其主要類似物檢測(cè)限和定量限分別為114.2～812.3 ng/L和237.1～1 653.9 ng/L。Arola等[28]采用ELISA對(duì)小麥、大麥和燕麥中的T-2和HT-2毒素進(jìn)行同步檢測(cè)，相應(yīng)的檢測(cè)限分別為0.3、0.1、0.3 ng/mL。ELISA法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高，適合大量樣品的快速篩選，但其測(cè)定結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題。同時(shí)，ELISA法采用酶蛋白作為標(biāo)記物，需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理消除樣品中物質(zhì)的干擾[29]。

3.2 免疫層析技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是一種以膠體金作為抗原或抗體的示蹤劑標(biāo)記物的可視化免疫檢測(cè)技術(shù)[26]?；诿庖吣z體金技術(shù)開(kāi)發(fā)的商業(yè)化的真菌毒素檢測(cè)試劑盒已在市場(chǎng)上得到初步應(yīng)用，李鑫[30]建立了可同時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮三種真菌毒素的免疫膠體金技術(shù)，可視化檢測(cè)限分別為0.25、0.5、1 ng/mL。Duan等[31]采用膠體金技術(shù)，在10 min內(nèi)可完成玉米中OTA、FB1和ZEN的同步檢測(cè)，可視化檢測(cè)限分別為5、20、10 ng/mL。免疫膠體金技術(shù)在多種真菌毒素檢測(cè)上雖然具有操作簡(jiǎn)便、快速，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，且近年來(lái)隨著技術(shù)的進(jìn)步檢測(cè)靈敏度也得到了較大改善，但膠體金作為標(biāo)記材料存在成本高、易受環(huán)境干擾、易受樣品基質(zhì)干擾等問(wèn)題，同時(shí)由于試紙條制備時(shí)易出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象以及非特異性吸附都會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大誤差[29]。

3.3 分子技術(shù)

3.3.1 多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Multiplex PCR)

多重PCR技術(shù)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與僅使用一對(duì)引物的普通PCR相同。Priyanka等[32]基于多重引物PCR技術(shù)以及黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮和延胡索霉素的產(chǎn)毒基因建立了一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，能同時(shí)檢測(cè)這5種毒素產(chǎn)生菌的方法，可用于預(yù)測(cè)谷物中這幾種主要真菌毒素的污染情況。Nwachukw等[33]基于聚合酶鏈反應(yīng)條件下擴(kuò)增的黃曲霉、赭曲霉和青霉的產(chǎn)毒基因，篩選市場(chǎng)上銷售的棕櫚油樣品中的黃曲霉毒素基因和赭曲霉毒素基因，對(duì)食品加工過(guò)程中產(chǎn)生真菌毒素的真菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)。多重PCR雖然有著廣泛的應(yīng)用前景，但是存在一些弊端。它本質(zhì)上檢測(cè)的是某一段產(chǎn)毒基因，而毒素產(chǎn)生涉及復(fù)雜的代謝過(guò)程，往往會(huì)受到諸多環(huán)境因素的影響，部分非產(chǎn)毒菌株有時(shí)也會(huì)攜帶一段產(chǎn)毒基因，因而檢測(cè)到某一段目標(biāo)產(chǎn)毒基因并不代表一定存在毒素污染，即使用多重PCR進(jìn)行毒素污染的預(yù)測(cè)極有可能得到假陽(yáng)性結(jié)果。此外，多重PCR擴(kuò)增效率的一致性是最大的難題，擴(kuò)增子越多，不均一性越高，檢測(cè)的準(zhǔn)確性相對(duì)也越難以保證。另一方面，如何降低檢測(cè)成本也是未來(lái)完善多重PCR真菌毒素檢測(cè)技術(shù)需要考慮的問(wèn)題。

3.3.2 熒光原位雜交(FISH)

熒光原位雜交是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的非放射性原位雜交方法。許琳[34]利用不同顏色的微球標(biāo)記單克隆抗體建立了真菌毒素混合污染多色免疫層析同步檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1、T-2和玉米赤霉烯酮混合污染的同步檢測(cè)，其可視檢測(cè)限分別為1.6、64.2、6.3 nmol/L。歐陽(yáng)歲燕[35]以量子點(diǎn)納米球?yàn)闊晒鈽?biāo)記材料，分別制備3種真菌毒素的抗體熒光探針，建立了能同步檢測(cè)AFB1、ZEN、FB1的量子點(diǎn)納米球免疫層析檢測(cè)技術(shù)。在甲醇溶液、玉米基質(zhì)、花生基質(zhì)中,該方法對(duì)AFB1、ZEN、FB1的檢測(cè)限分別為2.4、2.5、4.5 ng/kg，20.4、28.1、36.3 ng/kg，2.5、3.2、4.0 ng/kg，檢測(cè)線性范圍均可達(dá)兩個(gè)數(shù)量級(jí)。但這項(xiàng)研究只是從原理上說(shuō)明了這項(xiàng)技術(shù)能對(duì)真菌毒素等小分子量毒素進(jìn)行多重分析，對(duì)于后續(xù)實(shí)際應(yīng)用還有一段路要走。

3.4 生物傳感

生物傳感器是以生物質(zhì)敏感材料(包括抗體、酶、核酸、微生物、細(xì)胞、組織等)為識(shí)別元件，結(jié)合能將化學(xué)信息轉(zhuǎn)化為光、電、聲等可測(cè)量信號(hào)的信號(hào)元件組成的檢測(cè)分析系統(tǒng)[36]，由于具有高通量、高靈敏度和選擇性，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于真菌毒素同步檢測(cè)。Wang等[37]開(kāi)發(fā)了一種能同時(shí)檢測(cè)OTA和FB1的電化學(xué)磁控適配體傳感器，該法對(duì)OTA和FB1的檢測(cè)范圍分別為10pg/mL～10 ng/mL和 50 pg/mL～50 ng/mL，并成功應(yīng)用于玉米樣品。Nolan等[38]利用質(zhì)量敏感微陣列(MSMA)同步、半定量檢測(cè)T-2毒素、ZEN和FB1，靈敏度分別為6.1、3.6、2.4 ng/mL。生物化學(xué)傳感器雖然快速便捷，但是技術(shù)仍不成熟，在檢測(cè)范圍、靈敏度、抗干擾能力、重現(xiàn)性、造價(jià)和重復(fù)使用率等方面還存在不足，需要進(jìn)一步研究。

3.5 HPLC

高效液相色譜法由于檢測(cè)結(jié)果較為可靠，且成本和對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求與質(zhì)譜聯(lián)用相比都相對(duì)較低，因而仍是目前甚至未來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)分析方法。Marcin等[39]采用HPLC-UV對(duì)波蘭市場(chǎng)上100個(gè)啤酒樣品中的毒素進(jìn)行了同步測(cè)定，DON、NIV和DON-3G(deoxynivalenol-3-glucoside)的發(fā)生率分別為56%、83%和67%。Ozgur等[40]采用HPLC-UV和HPLC-FLD對(duì)谷物及其制品中的DON和ZEA進(jìn)行了同步測(cè)定，定量限分別為46.90～72.30 μg/kg和3.50～3.70 μg/kg。但HPLC對(duì)真菌毒素的定性與定量都需要標(biāo)準(zhǔn)品；在實(shí)際實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，真菌毒素的保留時(shí)間會(huì)隨著環(huán)境等因素的變化而產(chǎn)生偏移；對(duì)于多種毒素的測(cè)定，前處理操作復(fù)雜，液相條件的摸索與方法建立較為耗時(shí)，極性相近的物質(zhì)很難分離。

3.6 GC/LC-MS

近年來(lái)，在有關(guān)真菌毒素檢測(cè)的文獻(xiàn)中，色譜-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用檢測(cè)方法占50%以上[1]。質(zhì)譜檢測(cè)的高選擇性在一定程度上簡(jiǎn)化了樣品前處理和純化步驟，并能提供毒素分子詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，提高對(duì)目標(biāo)物識(shí)別的準(zhǔn)確性與靈敏度。國(guó)內(nèi)最近的一項(xiàng)研究表明，通過(guò)HPLC-MS可實(shí)現(xiàn)小麥粉中28種真菌毒素的同步檢測(cè)[41]。目前，在大部分真菌毒素檢測(cè)研究中，基本采用MS與氣相色譜(GC)或液相色譜(LC)聯(lián)用的方法。GC-MS在測(cè)定之前需要對(duì)毒素化合物進(jìn)行衍生化，樣品預(yù)處理較為復(fù)雜。Carrasco等[42]采用GC-MS/MS對(duì)182份谷物粉碎樣品中的單端孢霉素、棒曲霉素和玉米赤霉烯酮進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)真菌毒素的定量限低于10 μg/kg，谷物的回收率在毒素濃度為20 μg/kg和80 μg/kg時(shí)，分別為76%～108%和77%～114%，RSD小于9%。

LC-MS則不需要進(jìn)行衍生化就可對(duì)多種毒素同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢出限低，是目前被廣泛采用的真菌毒素同步檢測(cè)方法。LC-MS/MS能一次性的定性和定量檢測(cè)多種真菌毒素，成為近年來(lái)多種真菌毒素同步檢測(cè)的主要方法。Elaridi等[43]采用LC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)小麥谷物、小麥面粉和面包中的OTA、OTB、T-2和HT-2毒素，準(zhǔn)確度高達(dá)到98%～100%，回收率達(dá)到93%～105%。Scarpino等[44]采用高效液相三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-TQ-MS/MS)同時(shí)測(cè)定玉米和小麥中的真菌毒素，在反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式下，對(duì)FB1、FB2、DON、ZEA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2等17種真菌毒素進(jìn)行負(fù)離子和正離子掃描，選定強(qiáng)度相對(duì)大的子離子，以母離子-子離子對(duì)對(duì)玉米和小麥中的毒素分子進(jìn)行確證。三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜定量能力好，但是分辨力不足，容易受m/z近似的離子干擾，因而Wang等[37]采用了分辨率更高且對(duì)m/z近似離子具有更好的定性區(qū)分度的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)對(duì)玉米中的9種真菌毒素進(jìn)行了同步檢測(cè)，檢測(cè)限為0.05～50 μg/kg，定量限為0.1～200 μg/kg。此外，謝剛等[45]基于四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時(shí)檢測(cè)玉米中16種真菌毒素和11種農(nóng)藥殘留的方法。該法直接使用目標(biāo)物母離子的精確分子質(zhì)量進(jìn)行定量分析，不需要對(duì)目標(biāo)物子離子進(jìn)行逐個(gè)優(yōu)化，大大簡(jiǎn)化了分析方法建立的難度。靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)物跟未知物質(zhì)有更高的確證能力，能有效預(yù)防假陰性、能分辨出質(zhì)量數(shù)差別極小的離子，并且能同時(shí)篩查大量分析物[46]。與TOF相比，靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜在大大提高分辨率的同時(shí)，也具備出色的定量能力。液質(zhì)聯(lián)用在檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度上有著極大的優(yōu)勢(shì)，但檢測(cè)成本較高，開(kāi)發(fā)低成本、快速、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)，并應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)同步檢測(cè)真菌毒素是未來(lái)液質(zhì)聯(lián)用法的研究熱點(diǎn)[47]。

4 總結(jié)與展望

由于谷物真菌毒素污染的頻發(fā)性及其對(duì)人與動(dòng)物健康造成的威脅，國(guó)內(nèi)外已針對(duì)這一問(wèn)題制定了一系列安全限量與檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在兩個(gè)突出的問(wèn)題：一是目前世界各國(guó)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)體系對(duì)毒素及谷物種類劃分不夠細(xì)致，且缺乏統(tǒng)一性；二是受到毒理學(xué)研究與檢測(cè)技術(shù)發(fā)展限制，仍有許多已被證實(shí)具有安全隱患的真菌毒素尚未被納入標(biāo)準(zhǔn)體系，且目前的安全限量與檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)基本未考慮多種真菌毒素共存這一極為普遍的情況。谷物真菌毒素污染的監(jiān)管離不開(kāi)有效的檢測(cè)手段，對(duì)于多種毒素同步檢測(cè)，盡管技術(shù)上已經(jīng)有了較大的突破，但現(xiàn)有方法在檢測(cè)準(zhǔn)確性、成本和可操作性方面仍有待完善，開(kāi)發(fā)高通量、快速、穩(wěn)定、低成本的多種毒素同步檢測(cè)技術(shù)依然是食品安全領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。另一方面，進(jìn)一步推進(jìn)真菌毒素毒理學(xué)研究，尤其是建立多種毒素共存時(shí)協(xié)同毒性效應(yīng)的有效評(píng)估策略，對(duì)于更為合理的安全限量標(biāo)準(zhǔn)的制定也具有重大意義。