楊 春，李 恒，董欣宇，謝小亮，張 東

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，銀川 750004）

全球癌癥報(bào)告[1]數(shù)據(jù)顯示，2018年全球癌癥新發(fā)病例1810萬，死亡病例960萬。全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌位列第三位，結(jié)腸直腸癌的病死率僅次于肺癌位列第二位。目前臨床使用的治療結(jié)直腸癌藥物大多數(shù)為基因工程重組單克隆抗體靶向藥物[2]，價(jià)格昂貴，給家庭和社會(huì)帶來了極大的負(fù)擔(dān)，因此開發(fā)高效且經(jīng)濟(jì)的小分子治療藥物成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。

生姜作為一種佐料、膳食補(bǔ)充劑及中藥在世界范圍內(nèi)已經(jīng)廣泛使用，其主要的活性成分是姜辣素和姜烯酚[3]。姜烯酚6（Gingerol6，S6）為干姜的主要成分，研究[4]顯示其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抗氧化和抗癌的特性。Keap1/Nrf2（Kelchlike ECHassociatedprotein1/nuclearfactorE2related factor2）信號通路是機(jī)體一個(gè)非常重要的對癌癥自身防御抵抗信號通路，也是近年來抗癌研究的一大熱點(diǎn)。S6可能通過Keap1/Nrf2信號通路起到抑制腫瘤的作用[5]。S6衍生物M14（Gingerol derivativeM14，S6-M14）較S6具有更強(qiáng)的抑制結(jié)腸癌生長的作用[6]。目前S6-M14預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究以人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞為研究對象，通過觀察不同濃度的S6-M14對其增殖、凋亡和信號通路蛋白表達(dá)的影響，以期為探索其抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥物

人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞購于美國ATCC CLS號為300210。S6-M14購于中國武漢天植生物技術(shù)有限公司，CAS號為555-66-8。

1.2 試劑與設(shè)備

3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5 diphenyltetrazoliumbromide，MTT］、L-谷氨酰胺DMSO購于美國Sigma-Aldrich公司；DMEM-F1培養(yǎng)液、底透白邊96孔板、96孔板、6孔板購于美國CORNING公司；胰蛋白酶、PBS緩沖液購于美國Hyclone公司；FBS購于美國GIBCO公司CellTiter-GloRLuminescentCellapoptosisAssa購于美國Progema公司；核蛋白提取試劑盒購于美國THERMO公司；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購于武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；Keap1Nrf2、β-肌動(dòng)蛋白、LaminB兔抗人抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購于美國Cell SignalingTechnology公司；免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒購于中國上海銳賽生物技術(shù)有限公司；恒溫CO2培養(yǎng)箱購于日本SANYO公司；生化分析儀購于美國NOVA公司；多功能微孔檢測儀購于美國PerkinElmer公司；臺(tái)式低溫離心機(jī)購于美國BECKMAN公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、MiniTransblot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；Image－QuantLAS4000mini圖像分析系統(tǒng)購于美國GE公司。

1.3 人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的培養(yǎng)

復(fù)蘇人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞，接種于DMEMF12+5%FBS+2mol·L-1L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天取少許細(xì)胞于NOVA生化分析儀測定細(xì)胞密度和活率，做細(xì)胞生長曲線，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測S6-M14對人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞，用含5%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104細(xì)胞/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，則細(xì)胞接種量為5×103細(xì)胞/孔。將96孔板置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。加入S6-M14，使人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞分別處于0.25mmol·L-1、0.5mmol·L-1、1mmol·L-1、2mmol·L-1和4mmol·L-1終濃度的S6-M14刺激中，空白組含0mmol·L-1的S6-M14，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，刺激時(shí)間均為24h，每孔加入MTT至終濃度為5mg·mL-1繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT，每孔加入150μL的DMSO，室溫振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用多功能微孔檢測儀檢測490nm波長處各孔吸光度（A）值。

1.5 ATP顯色法檢測S6-M14誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞于25℃，300×g離心5min；用IMEM-F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至8×105個(gè)/mL，接種至96孔板，50μL/孔；用IMEM-F12培養(yǎng)基稀釋S6-M14至160mmol·L-1，再以IMEM-F12培養(yǎng)基進(jìn)行1∶2稀釋，共設(shè)12個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；將稀釋好的S6-M14加至96孔板，50μL/孔。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱靜置24h；于25℃室溫中將CellTiter-GloRLuminescentCellapoptosisAssay試劑盒中的緩沖液融化，1瓶緩沖液溶解1瓶酶粉，配成測定工作液，于各孔中加入100μL，酶標(biāo)儀振動(dòng)2min，25℃室溫避光靜置10min；用PerkinElmer多功能微孔板檢測儀在超靈敏化學(xué)發(fā)光模式下測定化學(xué)發(fā)光值。以S6-M14的反應(yīng)終濃度為橫坐標(biāo)，以PerkinElmer多功能微孔板檢測儀測定的化學(xué)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，將數(shù)據(jù)整理輸入GraphPadPrism軟件中。對橫坐標(biāo)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，在非線性擬合功能下，選擇Sigmodialdose response（variablescope）擬合四參數(shù)曲線。

1.6 Westernblot檢測Keap1/Nrf2信號通路蛋白的表達(dá)

取對數(shù)生長期的人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞于25℃，300×g離心5min；用IMEM-F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，將細(xì)胞吹打均勻后加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加2mL，則接種量為2×106細(xì)胞/孔，置于5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入不同濃度的S6-M14，使人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞分別處于0.25、1和4mmol·L-1終濃度的S6-M14刺激中，空白組不含S6-M14，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，刺激時(shí)間均為24h。提取各組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1h，洗滌3次后分別加入稀釋好的Keap1、Nrf2（均為1∶2000稀釋）、β-actin兔抗人一抗（1∶3000稀釋），室溫孵育2h。洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5000稀釋），室溫孵育2h。洗滌3次后ECL免疫印跡顯色試劑進(jìn)行顯色，分析胞質(zhì)蛋白中Keap1、Nrf2相對于β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量及核蛋白中Nrf2相對于LaminB的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用GraphPadPrism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞生長曲線

人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后，潛伏期為0～24h；36h細(xì)胞開始增殖，48～72h增殖明顯，呈指數(shù)增長；84h后細(xì)胞增殖趨緩，呈平臺(tái)期；108h后細(xì)胞增長進(jìn)入停滯期，呈下降趨勢，見圖1。依據(jù)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞生長曲線，選擇復(fù)蘇后48～72h指數(shù)生長期的人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞生長曲線

2.2 S6-M14對人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞增殖的影響

與空白組相比，0.25、0.5、1、2、4mmol·L-1S6-M14均可抑制人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的活性（P均＜0.001），提示S6-M14可抑制人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的增殖，見圖2。

圖2 S6-M14對人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞活性的影響

2.3 姜烯酚6衍生物M14促進(jìn)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞凋亡作用

S6-M14促進(jìn)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞凋亡作用符合四參數(shù)方程y=（A-D）/［1+（X/C）B］+D，其中A=2.376×106，B=-1.349，C=1.186，D=5.811×106，在半對數(shù)坐標(biāo)上呈典型的S曲線，R2為0.9893，四參數(shù)曲線見圖3。提示S6-M14可劑量依賴性地促進(jìn)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的凋亡。

圖3 姜烯酚6衍生物M14促進(jìn)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞凋亡作用

2.4 S6-M14對胞質(zhì)內(nèi)Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，0.25、1、4mmol·L-1的S6-M14均可抑制人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞Keap1/Nrf2信號通路Keap1和Nrf2蛋白的表達(dá)（P均＜0.01），見圖4。

2.5 S6-M14對細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，0.25、1、4mmol·L-1的S6-M14均可促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)（P均＜0.05），提示S6-M14促進(jìn)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞Nrf2核移位，見圖5。

圖4 S6-M14對Keap1/Nrf2信號通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程非常復(fù)雜，與眾多因素相關(guān)。近幾十年來，流行病學(xué)調(diào)查和分子、細(xì)胞生物學(xué)研究都表明，飲食是影響結(jié)直腸癌發(fā)病率的最重要因素[7]。生姜是我國常用的一種佐料，多項(xiàng)研究顯示干姜的主要成分S6具有抗氧化和抗癌作用，S6-M14較S6具有更強(qiáng)的抗癌作用，且毒性較姜烯酚6低[8-9]。

圖5 S6-M14對Nrf2核移位的影響

本研究結(jié)果顯示，S6-M14對人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的增殖具有抑制作用，劑量依賴性地誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞凋亡，下調(diào)了人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Keap1和Nrf2蛋白的表達(dá)，并且促進(jìn)了Nrf2蛋白的核移位。推測S6-M14可能與胞質(zhì)內(nèi)的Keap1反應(yīng)，導(dǎo)致Keap1蛋白構(gòu)象的變化，Nrf2與之解離并進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合激活啟動(dòng)下游多種保護(hù)性基因的表達(dá)[10-11]，從而促進(jìn)了人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞凋亡。

綜上所述，S6-M14通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路，抑制人結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，S6-M14在腫瘤治療方面具有一定的應(yīng)用前景。