陳德勝，張 晨，劉子歌，宋國(guó)瑞，郭鳳英，李 燕

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；

3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

骨性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是臨床常見(jiàn)關(guān)節(jié)疾患，主要有關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限等臨床表現(xiàn)，發(fā)展到中晚期會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)屈曲攣縮畸形。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療關(guān)節(jié)終末期疾病的有效治療手段，很大程度地提高了患者生活質(zhì)量[1-2]。經(jīng)前期研究證實(shí)[3-4]：磨損顆粒隨著假體植入機(jī)體內(nèi)的時(shí)間推移，不斷聚集在關(guān)節(jié)間隙，并進(jìn)入骨-假體的界膜組織內(nèi)，從而激活巨噬細(xì)胞，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等大量強(qiáng)效溶骨細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，進(jìn)一步誘導(dǎo)假體周?chē)墙M織的破骨細(xì)胞增殖、成熟、活化，引起一系列溶骨反應(yīng)，導(dǎo)致假體周?chē)侨芙?，假體失效。因此，尋找一種行之有效的方法預(yù)防和治療假體后無(wú)菌性松動(dòng)是目前關(guān)節(jié)外科關(guān)注的熱點(diǎn)。

與調(diào)控?zé)o菌性松動(dòng)所致骨溶解有關(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有絲裂源活化蛋白激酶（MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）、P13t信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，而MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是極其重要的相關(guān)通路。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是MAPK家族中的重要成員之一[5]。近期研究[6-9]證實(shí)，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅參與骨重建的調(diào)節(jié)可能在人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后無(wú)菌性松動(dòng)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。本文以小鼠Air pouc氣囊植骨動(dòng)物模型為研究對(duì)象，鈦顆粒為研究因素，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其下游炎性因子TNF α為作用靶點(diǎn)，探討ERK抑制劑PD98059在無(wú)菌性松動(dòng)中潛在的預(yù)防和治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鈦顆粒購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司，顆粒直徑＜20μm。內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，ERK選擇性抑制劑PD9805購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠70只，體質(zhì)量為（25±5）g，8～10周齡，健康狀況良好。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)審批通過(guò)［批準(zhǔn)號(hào)：SCXK（京）2016-0006］，符合動(dòng)物倫理要求，所有動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 磨損顆粒的內(nèi)毒素去除處理并檢測(cè) 將鈦顆粒放置燥箱內(nèi)180℃焙烤6 h后浸泡在70%乙醇里，離心、沉淀出鈦顆粒，反復(fù)多次進(jìn)行此循環(huán)操作，加PBS洗滌、離心、干燥，通過(guò)紫外線持續(xù)照射消毒，加PBS，配制成鈦顆粒懸液（300 mg·mL-1），放置4℃?zhèn)溆?。鈦顆粒懸液加入內(nèi)毒素檢測(cè)試劑，按照試劑盒說(shuō)明順序，進(jìn)行鈦顆粒內(nèi)毒素檢測(cè)陰性后備用。

1.3.2 小鼠Air pouch氣囊植骨動(dòng)物模型建立 采用文獻(xiàn)[10]中的手術(shù)方法建立小鼠Air pouch氣囊植骨動(dòng)物模型。將小鼠腹腔麻醉，待麻醉成功后，在其背部注射2 mL無(wú)菌空氣形成氣囊；在以后的6 d內(nèi)，連續(xù)每天向小鼠背部氣囊中注射0.5 mL無(wú)菌空氣，第7天氣囊形成；再隨機(jī)選同品系同齡小鼠處死，常規(guī)消毒鋪巾后，取出其顱骨骨片，剔除多余的軟組織。切開(kāi)氣囊，植入小鼠顱骨骨片，縫合切口。

1.3.3 動(dòng)物模型分組和處理 將45只SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、鈦顆粒刺激組和鈦顆粒+ERK抑制劑組，每組15只。另選25只SPF級(jí)BALB/c同品系同齡雌性小鼠，作為磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解動(dòng)物模型植骨的供體，每只小鼠可提供兩片用于植骨的顱骨骨片，大小約0.5 cm×0.25 cm×0.1 cm?？瞻讓?duì)照組：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL PBS液。每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14 d。鈦顆粒刺激組：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液。每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14 d。鈦顆粒+ERK抑制劑組：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，每日1次腹腔注射0.1 mL·kg-1ERK抑制劑PD98059，持續(xù)14 d。之后將三組動(dòng)物同時(shí)間處死，取出小鼠顱骨及其囊壁組織。

將小鼠顱骨及其囊壁組織置于12.5%EDTA脫鈣液脫鈣2周；再經(jīng)自動(dòng)脫水機(jī)處理后進(jìn)行石蠟包埋，制作成組織蠟塊。做4μm連續(xù)切片，撈片到載玻片上，置于烤箱中烘烤后備用。

1.3.4 蘇木素-伊紅染色（HE） 將準(zhǔn)備好的切片先后置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ以及不同濃度乙醇中浸泡，用蒸餾水洗滌；加蘇木素，持續(xù)14 d清水沖洗，鹽酸乙醇分化，再自來(lái)水沖洗，用0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗殘液；再將切片置入伊紅染液中染色；再置入95%乙醇I、乙醇II、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明；中性樹(shù)膠對(duì)已脫水的切片進(jìn)行封片。

1.3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP） 對(duì)破骨細(xì)胞的觀察和確定具有特異性，用于檢測(cè)磨損顆粒誘導(dǎo)炎性骨溶解中產(chǎn)生的TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞（破骨細(xì)胞樣細(xì)胞）數(shù)目。嚴(yán)格按照美國(guó)Sigma公司TRAP試劑盒進(jìn)行操作。將脫鈣后的小鼠顱骨及其囊壁組織石蠟切片二甲苯脫蠟后，依次經(jīng)過(guò)不同濃度乙醇階梯脫水，雙蒸水沖洗；放入丙酮溶液中固定，雙蒸水沖洗，將玻片放入暗盒內(nèi)，加入新鮮配制的TRAP染液，染液須完全覆蓋切片，37℃水浴鍋避光孵育1 h；雙蒸水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗、晾干，中性樹(shù)膠封片。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色 切片在68℃中烤片2 h后置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇浸泡，自來(lái)水、蒸餾水沖洗；3%H2O2孵育，將切片小心放入0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加羊血清于玻片封閉，PBS液沖洗，滴加ERK多克隆抗體及TNF-α多克隆抗體（購(gòu)自英國(guó)Abcam公司）孵育，4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次。滴加山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有效公司），37℃孵育，PBS沖洗。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37℃孵育。滴加DAB液靜置數(shù)分鐘，置于顯微鏡下觀察顯色，適時(shí)終止，用流水沖洗。蘇木素液對(duì)已顯色的切片復(fù)染，流水輕洗；1%鹽酸乙醇分化，流水輕洗；碳酸鋰返藍(lán)，流水輕洗。95%乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，中性樹(shù)脂封片。

三組免疫組化染色切片通過(guò)顯微鏡下觀察結(jié)果并進(jìn)行圖像采集。觀察可見(jiàn)組織標(biāo)本中出現(xiàn)細(xì)胞胞漿或細(xì)胞質(zhì)中的棕黃色顆粒分布視為陽(yáng)性表達(dá)，每張免疫組化切片隨機(jī)選取5個(gè)表達(dá)的高倍鏡（10×40）視野，需確保每張圖像的位置以及背景亮度一致。將采集圖像運(yùn)用Image-Pro軟件進(jìn)行分析，確定統(tǒng)一的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算分析后得到平均光密度（AOD）值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

資料運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠植骨氣囊病理變化

HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未見(jiàn)鈦顆粒，沒(méi)有明顯的炎性反應(yīng)，囊壁組織分布著少量的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，所植顱骨骨塊邊緣表面光滑，完整；鈦顆粒刺激組可見(jiàn)植骨氣囊的囊壁增厚，組織中存在明顯的炎性反應(yīng)，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等，氣囊組織中可見(jiàn)大量的鈦顆粒，植骨的顱骨骨塊表面存在侵蝕作用，表現(xiàn)為顱骨骨塊邊緣欠光整，有部分缺損。與鈦顆粒刺激組比較，鈦顆粒+ERK抑制劑組可見(jiàn)氣囊組織厚度相對(duì)較薄，氣囊中炎性細(xì)胞減少，所植顱骨骨塊邊緣的溶骨反應(yīng)減輕，見(jiàn)圖1。

2.2 小鼠植骨氣囊中溶骨性變化

空白對(duì)照組中可見(jiàn)少量的TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性染色面積較小，染色較淺；鈦顆粒刺激組，植入顱骨骨塊囊壁中TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增多，陽(yáng)性染色面積較大，染色較深；與空白對(duì)照組相比，鈦顆粒刺激組、鈦顆粒+ERK抑制劑組TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞增多；與鈦顆粒刺激組相比，鈦顆粒+ERK抑制劑組中TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少，見(jiàn)圖2、表1。

2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)植骨氣囊中ERK及TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)

2.3.1 三組植骨氣囊中ERK的陽(yáng)性表達(dá) 空白對(duì)照組小鼠植骨氣囊組織中囊壁的纖維細(xì)胞的胞漿中可見(jiàn)少量的ERK染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性染色較淺，有一定的陽(yáng)性表達(dá)（圖3A）；鈦顆粒刺激組，植入顱骨骨塊囊壁中ERK染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增多，陽(yáng)性表達(dá)較高（圖3B）；鈦顆粒+ERK抑制劑組中ERK染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及陽(yáng)性表達(dá)與鈦顆粒刺激組比較相對(duì)減少（圖3C）。

運(yùn)用Image-Pro軟件進(jìn)行分析后，與空白對(duì)照組相比，鈦顆粒刺激組、鈦顆粒+ERK抑制劑組ERK染色陽(yáng)性細(xì)胞增多（P＜0.05）；與鈦顆粒刺激組相比，鈦顆粒+ERK抑制劑組中ERK染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少（P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖1 三組植骨氣囊HE染色結(jié)果（HE×10）

圖2 三組小鼠植骨氣囊溶骨性變化結(jié)果（TRAP×200）

表1 三組植骨氣囊TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比較（x±s，個(gè)）

圖3 三組小鼠ERK免疫組化結(jié)果（×20）

表2 三組植骨氣囊中ERK免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)果比較（x±s）

2.3.2 三組植骨氣囊中TNF-α的陽(yáng)性表達(dá) 空白對(duì)照組小鼠中植骨氣囊組織中囊壁的纖維細(xì)胞的胞漿中可見(jiàn)少量的TNF-α染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性染色淺；鈦顆粒刺激組，植入顱骨骨塊囊壁中TNF-α染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，陽(yáng)性表達(dá)增高；鈦顆粒+ERK抑制劑組中TNF-α染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及陽(yáng)性表達(dá)與鈦顆粒刺激組相比減少，見(jiàn)圖4。

運(yùn)用Image-Pro軟件進(jìn)行分析后，與空白對(duì)照組相比，鈦顆粒刺激組、鈦顆粒+ERK抑制劑組TNF-α染色陽(yáng)性細(xì)胞增多（P＜0.05）；與鈦顆粒刺激組相比，鈦顆粒+ERK抑制劑組中TNF-α染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少（P＜0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是目前骨關(guān)節(jié)終末期疾病最為有效的治療手段，該手術(shù)可重建關(guān)節(jié)形態(tài)，緩解患者疼痛，改善關(guān)節(jié)功能，使患者生活質(zhì)量得到很大提高。假體周?chē)鸁o(wú)菌性松動(dòng)是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最為首要的并發(fā)癥。目前研究表明[11-12]，假體植入體內(nèi)產(chǎn)生的磨損顆粒刺激人工關(guān)節(jié)界膜組織中巨噬細(xì)胞激化，引起一系列炎性反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子可致破骨細(xì)胞增殖成熟活化，引起骨組織溶骨性改變，出現(xiàn)人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)。

磨損顆粒刺激人工關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路單一或者協(xié)同調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟，ERK通路是其中之一。ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又稱(chēng)p42/p44 MAPK通路，磷酸化激活后的ERK從細(xì)胞胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)完整性的維持、細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)的構(gòu)建以及細(xì)胞凋亡等一系列分子生物學(xué)反應(yīng)[7]。

圖4 三組植骨氣囊中TNF-α免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)果（×200）

表3 三組植骨氣囊中TNF-α免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)果比較（x±s）

磨損顆粒在假體周?chē)缒そM織中誘發(fā)巨噬細(xì)胞，釋放TNF-α、MMP-9等大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，進(jìn)一步誘導(dǎo)假體周?chē)墙M織的破骨細(xì)胞激活，活化從而產(chǎn)生骨溶解反應(yīng)，導(dǎo)致無(wú)菌性炎性骨溶解[5]。ERK作為MAPK信號(hào)通路家族的成員，當(dāng)細(xì)胞受到磨損顆粒刺激時(shí)也相應(yīng)激活，參與炎性反應(yīng)過(guò)程[13]。TNF-α是機(jī)體介導(dǎo)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵炎性因子，當(dāng)磨損顆粒刺激巨噬細(xì)胞后，TNF-α協(xié)同巨噬細(xì)胞釋放多種炎性因子和細(xì)胞因子，發(fā)揮“級(jí)聯(lián)放大”的作用，在整個(gè)炎性反應(yīng)中，TNF-α作為ERK信號(hào)通路的下游炎性因子，有著重要的始動(dòng)作用[14]。

有研究[15]證實(shí)，在ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控下，LPS作用于M-SCF刺激破骨細(xì)胞成熟分化，通過(guò)ERK抑制劑PD98059干預(yù)后，可抑制LPS介導(dǎo)下的TNF-α、MIP-la的表達(dá)。Ang等[16]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用紫杉醇作用于鈦顆粒刺激小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞出現(xiàn)炎性因子及破骨細(xì)胞生成，以及作用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的鈦顆粒刺激小鼠顱骨產(chǎn)生骨溶解，證實(shí)紫杉醇可以通過(guò)抑制NF-KB和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終有效地抑制鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解的生物學(xué)反應(yīng)。還有體外實(shí)驗(yàn)[17]將Sargachromanol G作用于磨損顆粒刺激的巨噬細(xì)胞，證實(shí)Sargachromanol G通過(guò)NF-KB和ERK兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制破骨細(xì)胞的分化和增殖。

本實(shí)驗(yàn)研究中，選用小鼠顱骨植入Air pouch氣囊，加入鈦顆粒刺激建立磨損顆粒骨溶解動(dòng)物模型，在此基礎(chǔ)上，選用ERK選擇性抑制劑PD98059作用于該動(dòng)物模型。結(jié)果顯示，ERK抑制劑PD98059可以減輕鈦顆粒刺激小鼠顱骨植入Air pouch氣囊中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性反應(yīng)；TRAP染色結(jié)果證實(shí)，ERK抑制劑PD98059可以減少鈦顆粒刺激后破骨樣細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域；并且在免疫組化染色結(jié)果看到，ERK抑制劑PD98059抑制了鈦顆粒刺激下小鼠顱骨植入Air pouch氣囊中ERK與其下游炎性因子TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)下調(diào)ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)，而其表達(dá)的下調(diào)使得多種轉(zhuǎn)錄因子基因蛋白的活性降低，從而抑制ERK信號(hào)通路下游炎性因子蛋白TNF-α的表達(dá)。

綜上所述，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解中發(fā)揮重要作用。ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能影響破骨細(xì)胞的分化和活化，進(jìn)而調(diào)控炎性骨溶解發(fā)生、發(fā)展，可為延緩和抑制假體周?chē)侨芙庖鸬臒o(wú)菌性松動(dòng)尋找有效的途徑和方法。