張丹丹，苑 璐，邵露營，朱佳琳，周延清*

(1.河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南省周口市科技局，河南 周口 466000)

0 引言

【研究意義】地黃(Rehmanniaglutinosa)是一種栽培歷史悠久的大宗中草藥，屬于玄參科地黃屬多年生草本植物，具有重要的藥用、食用、觀賞和經(jīng)濟價值。其根以鮮地黃、生地黃和熟地黃等形式用于臨床實踐，具有養(yǎng)陰生津、清熱涼血和抗腫瘤等功效，是六味地黃丸和知柏地黃丸等中成藥的重要原料。地黃富含梓醇、地黃苷、毛蕊花糖苷和糖類等諸多藥效成分。其中，地黃糖類包括水蘇糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、毛蕊花糖、果糖、半乳糖和甘露三糖等。因此，研究地黃糖酵解關(guān)鍵酶基因?qū)τ陉U明其代謝途徑和品種改良具有重要意義。【前人研究進展】植物糖酵解涉及的酶相當多，其中，烯醇化酶是廣泛存在于動植物體糖酵解過程中的一個重要限速酶,催化磷酸甘油酸脫水形成磷酸烯醇式丙酮酸，在植物中具有催化糖酵解、抗逆、影響植物的生長和生殖發(fā)育和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種功能[1]。目前，已經(jīng)從擬南芥、茶樹、鹽芥、水稻和玉米等植物中克隆了烯醇化酶，研究了其功能[2]。但是，少見地黃烯醇化酶基因的報道。【研究切入點】在前期的地黃塊根轉(zhuǎn)錄組測序挖掘毛蕊花糖苷生物合成途徑相關(guān)酶及其相應(yīng)基因、闡明其合成途徑及分子機理的研究中挖掘的大量地黃基因[3]，包括7個糖酵解酶基因，烯醇化酶基因為其中之一。烯醇化酶不僅是糖酵解的關(guān)鍵限速酶，而且具有抗逆、參與植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長發(fā)育等功能[1]。因此，對地黃烯醇化酶基因進行進一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以前期轉(zhuǎn)錄組測序挖掘的地黃品種溫85-5的糖酵解關(guān)鍵酶-烯醇化酶基因堿基序列為材料[3]，利用計算機和生物信息學軟件研究地黃烯醇化酶基因(RgENO)編碼蛋白質(zhì)的同源性、理化性質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)、亞細胞定位、信號肽分析及根、莖和葉中的表達情況，為進一步深入研究該基因的結(jié)構(gòu)特征和糖酵解及抗逆功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

地黃品種溫85-5成熟植株的根、莖和葉。地黃發(fā)育根轉(zhuǎn)錄組測序挖掘烯醇化酶(EC：4.2.1.11)基因Contig4172，780 bp[3]，命名為RgENO。內(nèi)參基因RgTIP41引物序列和擴增產(chǎn)物詳見文獻[3]。RT-qPCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII購自TAKARA公司(日本)。

1.2 方法

利用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計qRT-PCR引物。引物方向5′→3′，正向引物：TGAGTGGGGTTGGTGTAAGC；反向引物：ATTGATGACATTGAAAGCGGG，引物為英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，預期擴增產(chǎn)物172 bp；NCBI的Blastp同源性檢索，ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對RgENO理化性質(zhì)分析，應(yīng)用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和KinasePhos2.0(http://kinasephos2. mbc.nctu. edu. tw/index.html)預測RgENO蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和對磷酸位點進行分析，SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對地黃RgENO氨基酸序列進行信號肽分析，SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_ sopm.html)分析RgENO蛋白的二級結(jié)構(gòu)，InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析RgENO蛋白的結(jié)構(gòu)域；用改良后的Trizol法提取地黃品種溫85-5植株的根、莖、葉的總RNA，用紫外微量分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳分別檢測所提RNA的濃度和完整度。qRT-PCR 在LightCycler 96實時定量PCR儀上進行，具體程序參見文獻[3]。采用2-△△Ct方法計算RgENO的相對表達量[3]。用Microsoft Office Excel 2007作RgENO的空間表達圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RgENO同源比對

根據(jù)RgENO的堿基序列，利用NCBI中的BLASTp軟件搜索發(fā)現(xiàn)，RgENO基因與芝麻(基因注冊號XP_011094426.1)、大豆(NP_001237329.2)、猴面花(XP_012840098.1)、可可(EOY08109.1)和長蒴黃麻(OMO68215.1)的烯醇化酶基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列同源性分別高達96%、91%、94%、94%與93%(圖1)。

圖1 RgENO的多重同源比對結(jié)果 Fig.1 Multiple homology alignment result of RgENO

2.2 RgENO編碼酶的理化性質(zhì)

在線軟件預測RgENO基因編碼蛋白質(zhì)由260個氨基酸殘基組成，包括26個酸性氨基酸(Asp+Glu)和27個堿性氨基酸(Arg+Lys)，相對分子量為27 654.69，等電點是7.69，分子式是C1233H1965N329O373S9，不穩(wěn)定系數(shù)為24.73，脂溶指數(shù)為90.46，總平均親水性(GRAVY)為-0.120，由此推測RgENO蛋白為穩(wěn)定、親水性蛋白；采用Kinase Phos 2.0對RgENO進行磷酸化結(jié)構(gòu)預測，其具有12個絲氨酸的磷酸化位點(8、10、11、25、33、37、89、131、150、151、、223、248)，10個蘇氨酸的磷酸化位點(12、41、53、56、69、179、203、211、228、231)和9個酪氨酸的磷酸化位點(15、27、105、163、174、210、226、232、256)。

2.3 RgENO蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)

一般當X軸數(shù)值高于500時，可以認作是跨膜結(jié)構(gòu)域。用TMHMM Server v.2.0預測地黃RgENO蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)果(圖2)表明，RgENO編碼酶無跨膜結(jié)構(gòu)。

2.4 RgENO蛋白質(zhì)的信號肽預測與保守結(jié)構(gòu)域預測

將RgENO的氨基酸序列輸入Signalp-5.0在線工具，進行信號肽預測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RgENO不具有跨膜運輸功能，屬于非分泌型蛋白。利用InterProScan和NCBI的Conserved domains search預測RgENO具有烯醇化酶所具有的N-端和C-端保守結(jié)構(gòu)域。在氨基酸序列的116-260位C末端有TIM barrel domain，屬于TIM磷酸結(jié)合超家族。

2.5 RgENO蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)預測

采用SOPM預測ENO蛋白的二級結(jié)構(gòu)表明,α螺旋40%，無規(guī)則卷曲31.54%，伸展鏈19.23%，β轉(zhuǎn)角9.23%。因此認為，RgENO的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、無規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角組成。

2.6 RgENO蛋白質(zhì)的亞細胞定位

使用WoLF PSORT蛋白亞細胞定位預測方法[4]對RgENO蛋白質(zhì)進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，在其K最臨近值在細胞核、線粒體、細胞質(zhì)、分泌系統(tǒng)囊泡、過氧物酶體和液泡中的值依次為34.8%、30.4%、21.7%、4.3%、4.3%和4.3%，RgENO蛋白質(zhì)在細胞核中定位的K最臨近值最大，可能定位與細胞核中。

2.7 RgENO的空間表達

以RgTIP41為內(nèi)參基因，用qRT-PCR技術(shù)檢測RgENO在地黃塊根、莖和葉中的相對表達量結(jié)果(圖3)表明，RgENO在莖中的表達量最高，其次是葉中，塊根中最低。

圖3 RgENO基因在成熟地黃植株塊根、莖和葉中的表達量Fig.3 Expressions of RgENO gene in tuber, stem and leaves of matured R. glutinosa

3 討論

研究用轉(zhuǎn)錄組測序地黃烯醇化酶基因RgENO，用生物信息學分析軟件對其分析發(fā)現(xiàn)，其與其他植物種類的烯醇化酶基因同源性高達91%～96%，具有烯醇化酶所具有的N-端和C-端保守結(jié)構(gòu)域(TIM barrel domain)，屬于烯醇化酶。其他植物種烯醇化酶基因研究表明，其催化糖酵解過程，具有抗逆性等功能。如從耐低溫馬鈴薯品種中克隆的糖酵解途徑上的StEnolase基因，一定程度上能夠調(diào)控馬鈴薯塊莖低溫糖化，影響轉(zhuǎn)基因株系芳香族氨基酸的合成[5]；脅迫響應(yīng)基因可通過依賴脫落酸信號途徑和非依賴脫落酸信號途徑進行調(diào)控[6]；茶樹CsENO在脫落酸脅迫下能表達且受到不同程度的誘導，屬于依賴脫落酸信號通路的植物逆境響應(yīng)基因[7]；在植物抗冷脅迫中還存在一種非脫落酸依賴的信號通路-CBF/DREB調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。CBF/DREB基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其表達產(chǎn)物與植物的冷響應(yīng)基因COR的順式元件結(jié)合，誘導抗冷基因表達來提高植物的抗冷性[8]。擬南芥CBF基因的下游調(diào)控因子los2經(jīng)過驗證是烯醇化酶基因，是一個雙功能酶基因，其間接地正調(diào)控冷應(yīng)答COR基因，提高擬南芥的抗冷性[9]。因此，地黃烯醇化酶基因RgENO的發(fā)掘與功能預測對地黃糖代謝與抗逆性分子機制研究提供參考。另一方面，qRT-PCR技術(shù)檢測地黃不同器官組織中RgENO基因均表達，但是表達量差異不明顯，說明其是組成型表達，對于地黃糖代謝與抗逆具有重要作用。

4 結(jié)論

RgENO基因與芝麻、大豆、猴面花、可可和長蒴黃麻(OMO68215.1)烯醇化酶基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列同源性較高，分別達96%、91%、94%、94%和93%；RgENO蛋白為穩(wěn)定、親水性蛋白；其具有12個絲氨酸的磷酸化位點、10個蘇氨酸的磷酸化位點和9個酪氨酸的磷酸化位點。RgENO編碼酶無跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽，二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、無規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角組成，蛋白質(zhì)可能定位于細胞核中；RgENO在地黃的塊根、莖和葉中均有不同水平的表達，但在莖中的表達量最高，在塊根中最低。研究結(jié)果可為今后深入研究地黃烯醇化酶基因(RgEND)的結(jié)構(gòu)特征和糖酵解及抗逆功能提供參考。