劉 輝，周玉鋒*，周羅娜，趙興麗，羅林麗，賀圣凌，張 欣

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，貴州 貴陽 550006)

0 引言

茶餅病是由壞損外擔(dān)菌(ExobasidiumvexansMassee)侵染引起的一種茶樹真菌病害，主要危害茶樹嫩葉、新梢，不僅影響產(chǎn)量，而且用感病芽葉生產(chǎn)的茶葉易碎且味苦，茶葉品質(zhì)顯著下降，嚴(yán)重影響茶農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益[1]。1868年首次報道在印度阿薩姆地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病菌，其于1908年成為當(dāng)?shù)夭鑸@的地方??；1947年首次報道該病在斯里蘭卡規(guī)?；l(fā)生，之后相繼在印度、印度尼西亞、馬來西亞及日本等國發(fā)現(xiàn)[2]；我國(安徽)最早于1903年記載茶餅病的發(fā)生[3]。20世紀(jì)40年代末，各國學(xué)者展開了對茶餅病病原物生物學(xué)、流行和預(yù)測及防治技術(shù)等方面的研究[3-9]。茶餅病主要分布在南緯8°至北緯35°，東經(jīng)75°～138°的區(qū)域，亞洲各產(chǎn)茶國及歐洲部分地區(qū)如意大利均有發(fā)生[4]。我國的產(chǎn)茶區(qū)，除江北茶區(qū)外，均有茶餅病的發(fā)生，尤以西南和中南產(chǎn)茶區(qū)的高山茶園發(fā)生較嚴(yán)重[5]。茶餅病屬于低溫高濕型病害，尤以濕度對茶餅病的影響最大[6]。當(dāng)連續(xù)10～14 d保持11 h空氣相對濕度均>80%時，壞損外擔(dān)菌擔(dān)孢子隨風(fēng)飄落至茶樹嫩葉或新梢上的水滴中，在水環(huán)境中萌發(fā)侵入茶葉，后經(jīng)3～18 d長出子實層，形成病斑。成熟擔(dān)孢子可進(jìn)行飛散傳播，從而導(dǎo)致茶園大面積感染[7]。日照也是影響茶餅病流行的主要因子之一，在發(fā)病期晨照連續(xù)<4 h，可促進(jìn)發(fā)??；若日照>4 h，則可抑止病害流行。發(fā)病適宜氣溫為15～20℃，若氣溫>31℃，則可抑止病害發(fā)生[8-9]。因此，茶樹有大量嫩梢、嫩葉存在及溫和濕潤的氣候條件是該病流行所需的兩大重要條件[5]。我國茶區(qū)茶餅病的流行一般在3-4月，9-10月為流行盛期[9]。關(guān)于茶餅病的流行規(guī)律、病原菌分離及防治技術(shù)等已有大量研究報道，但鮮見關(guān)于病原菌與寄主互作機(jī)制的研究報道。為科學(xué)、高效、綠色地防控及進(jìn)一步研究茶餅病提供理論依據(jù)，從茶餅病病原菌、病原菌與茶樹互作機(jī)制等方面對2010年以來國內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病原菌

1.1 形態(tài)特征

茶餅病病原菌為壞損外擔(dān)菌(ExobasidiumvexansMassee)，屬擔(dān)子菌亞門外擔(dān)菌目外擔(dān)菌屬真菌。病葉泡狀區(qū)的橫切面觀察結(jié)果(圖1)表明，壞損外擔(dān)菌菌絲體生長在植物細(xì)胞間并形成手指狀吸器結(jié)構(gòu)侵入到葉片薄壁細(xì)胞中。菌絲體生長到一定時期，在感病葉底面的上表皮細(xì)胞中形成子實層。子實層密集地排列著無數(shù)棍棒型、單胞、無色的擔(dān)子，形成柵欄結(jié)構(gòu)。擔(dān)子大小為(30～50)μm×(3～6)μm，頂生3～4個小梗，每個小梗上頂生1個擔(dān)孢子。擔(dān)孢子呈腎形或橢圓形，頂端略圓，基部稍尖，大小為(9～16)μm×(3.5～6)μm。感病茶樹葉片上的白色粉末即為無數(shù)的擔(dān)子和擔(dān)孢子[4]。

1.2 培養(yǎng)條件

目前，關(guān)于茶餅病病原種類的報道不多，原因在于E.vexans曾被認(rèn)為是絕對寄生的專性活體營養(yǎng)真菌，其生活史只能在茶樹上完成[10]。而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，E.vexans也能在maltsalep、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)等培養(yǎng)基上生長，但需要添加一些天然活性物質(zhì)，如水溶性維生素B[11]，菌落形成時間大致為20～30 d，而在茶樹上完成一個世代的時間大致為11～28 d；在適宜條件下，病原可完成多個世代的繁殖[12]。盡管如此，仍未能形成穩(wěn)定有效且可重復(fù)的培養(yǎng)基。為篩選穩(wěn)定可靠的茶餅病病原菌體外培養(yǎng)基，CHALIHA等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化適宜茶餅病病原孢子生長的培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)查氏(Czapek dox)培養(yǎng)基配方為1 000 mL體系中添加6 g碳源、15%(W/V)茶葉提取物、0.4 g CaCO3，pH 6.5和25℃培養(yǎng)溫度；最優(yōu)PDA培養(yǎng)基為3 g碳源、30%(W/V)茶葉提取物、0.4 g CaCO3，pH 6.5和25℃培養(yǎng)溫度；最優(yōu)V8 Juice配方為0.35 g碳源、7.5%(W/V)茶葉提取物、0.6 g CaCO3，pH 5.75和27.5℃培養(yǎng)溫度。在上述3種配方培養(yǎng)基上，E.vexans可獲得最大量的可育菌絲，且可存活5周，為下一步研究茶餅病的發(fā)病機(jī)理、設(shè)計防治策略奠定關(guān)鍵基礎(chǔ)。

1.3 生理小種

VENKATE等[14]報道，E.vexans可能存在多個生理小種。ABEYSINGHE等[15-16]研究證實，采自斯里蘭卡不同地區(qū)的E.vexans具有不同長度和寬度的孢子形態(tài)，RAPD-PCR和ITS序列分析結(jié)果也表明其存在基因型變異和遺傳多樣性。最新研究結(jié)果表明，茶餅病是由多種病原菌共存和協(xié)同作用引起的茶樹病害，導(dǎo)致茶餅病發(fā)病機(jī)制的研究變得異常復(fù)雜。BARMAN等[17]從多種茶樹病葉中收集不同發(fā)病時期的茶餅病病斑，從中分離得到42種病菌，根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)觀察，以及ITS-RFLP鑒定和體外致病性測定發(fā)現(xiàn)，Pestalotiopsis和Nigrospora是茶餅病中協(xié)同存在的2種主要病菌，其可以在茶餅病發(fā)生期間誘發(fā)茶樹并發(fā)癥，并反過來促進(jìn)茶餅病的流行。此研究有助于茶餅病的新型有效防控技術(shù)策略的研發(fā)，但由于田間環(huán)境的復(fù)雜性，此研究結(jié)果仍需進(jìn)一步驗證。

2 病原菌與茶樹互作機(jī)制

2.1 病原菌的侵染過程

前人研究發(fā)現(xiàn)，可將茶餅病的發(fā)生時期分為7個階段：第1階段，從病原菌穿透角質(zhì)層第3天開始，直至產(chǎn)生直徑<0.5 mm的半透明斑點；隨著斑點逐漸擴(kuò)大，危害過渡到2～4階段；第5階段，病害損害開始膨脹，典型癥狀為葉正面凹陷平滑且發(fā)亮，葉背面凸出，暗色、灰色，呈粉末狀增厚，最后變?yōu)榧儼咨禊Z絨狀，此階段E.vexans可擴(kuò)展到海綿組織的細(xì)胞間；第6階段，少量孢子形成；第7階段，大量孢子形成[10,12]。趙曉珍等[12]通過過碘酸-希夫(氏)(PAS)、甲苯胺藍(lán)(TBO)、臺盼藍(lán)(Trypan blue)和伊文思藍(lán)(Evans blue)組織染色觀察，將茶餅病在茶葉上的侵染過程分為4個階段(圖2)：第1階段，孢子侵染的0～24 h，擔(dān)孢子利用芽管穿過葉片下表皮表皮細(xì)胞合縫處的角質(zhì)層，也可通過氣孔到達(dá)海綿組織的細(xì)胞間進(jìn)行增殖。第2階段，孢子侵染的1～7 d，孢子萌發(fā)階段，在此期間茶葉組織仍保持較完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)；但PAS染色結(jié)果表明，海綿組織細(xì)胞中紅色顆粒堆積增多，邊界明顯。第3階段，孢子侵染的7～14 d，吸器形成階段，可觀察到病害侵染的典型特征；伴隨E.vexans對茶樹葉片組織細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的利用，茶樹葉片細(xì)胞營養(yǎng)耗竭，而細(xì)胞和病原都趨向死亡。但同時也誘導(dǎo)了植物的防御機(jī)制，對病原的擴(kuò)展起到抑制作用，可見著色的死亡擔(dān)孢子和菌絲體。第4階段，孢子侵染的14～20 d時，孢子形成以及進(jìn)行2次侵染。

注：A、B，感病葉片的橫切面；C，子實層中的棒狀菌絲結(jié)構(gòu)；D，擔(dān)子和擔(dān)孢子結(jié)構(gòu)；E、F，含有明顯分割層的成熟擔(dān)孢子；G，萌發(fā)中的孢子結(jié)構(gòu)(含頂端長有吸器結(jié)構(gòu)的萌發(fā)管)。Note: A and B, transverse section of diseased leaves; C, club-shaped hyphae structure in the hymenial layer; D, basidium and basidiospore structures; E and F, mature basidiospores with clearly segmented layer; G, spore structure in germination(containing a germinating tube with a haustorium structure at the end).圖1 茶餅病病原菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of pathogen in tea blister blight

注：A，健康茶葉葉片；B～D，病原侵染茶樹葉片1～3階段。上表皮層，Up-epidermis (up-EP)；柵欄組織，Palisade tissue(PT)；海綿組織，Spongy tissue(ST)；下表皮層，Down-epidermis(down-EP)。箭頭所指為Exobasidium vexans的擔(dān)孢子、擔(dān)子及菌絲。Note: A, leaf of healthy tea; B-D, 1-3 stages of pathogen infected tea leaves. up-EP, Up-epidermis; PT, Palisade tissue; ST, Spongy tissue; down-EP, Down-epidermis. The arrows indicate the basidiospore, basidium and hyphae of Exobasidium vexans.圖2 PAS染色觀察E. vexans侵染茶樹真葉的組織結(jié)構(gòu)Fig.2 Tissue structure of E. vexans infected tea leaves by using PAS staining

2.2 茶餅病病原菌與茶樹互作的生理和分子機(jī)制

2.2.1 分子機(jī)制 經(jīng)長期進(jìn)化，植物形成了一套復(fù)雜的免疫系統(tǒng)。植物自身可以通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)并觸發(fā)早期防御機(jī)制，包括活性氧爆發(fā)(ROS burst)、絲裂原活化蛋白激酶(smitogen-activated protein kinases，MAPK)激活、胼胝質(zhì)沉積(callose deposition)及抗性蛋白和防御酶基因表達(dá)等，從而調(diào)控茶餅病響應(yīng)過程中的各種生理和生化反應(yīng)過程，也叫系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAS)。同時，病原菌可以向植物細(xì)胞遞送效應(yīng)物以抑制病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)(PAMP-triggered immunity，PTI)，但是一些效應(yīng)物可以被植物抗性蛋白識別并激活效應(yīng)子誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)(effector-triggered immunity，ETI)。ETI是一種強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，引起細(xì)胞程序性死亡以及一些信號分子如水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)及脫落酸(ABA)等的積累[18]。當(dāng)前，只有少部分有關(guān)茶餅病抗性基因在茶樹中被鑒定，通過細(xì)胞組學(xué)技術(shù)可以系統(tǒng)揭示茶樹對茶餅病的響應(yīng)機(jī)制。BHORALI等[19]利用cDNA-AFLF和抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，從E.vexans感染的茶樹嫩葉中篩選鑒定得到部分防御相關(guān)的新基因；同時發(fā)現(xiàn)，茶樹中能量代謝、運(yùn)輸、蛋白修飾、細(xì)胞壁防御、氧化脅迫響應(yīng)及信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白與抗茶餅病顯著相關(guān)。利用RNA sequencing技術(shù)從茶樹葉片中鑒定得到149個基因參與茶餅病免疫響應(yīng)過程，包括30個防御相關(guān)酶，25個resistance genes(R基因)，9個耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，65個轉(zhuǎn)錄因子，9個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和其他防御相關(guān)基因，其中大部分基因上調(diào)表達(dá)；茶樹可以通過核苷酸結(jié)合富亮氨酸重復(fù)序列(Nucleotide Binding Leucine Rich Repeat)介導(dǎo)ETI系統(tǒng)的激活、激活R基因介導(dǎo)SA信號通路以誘導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和細(xì)胞程序性死亡等以抵御茶餅病病原菌的侵染(圖3)[20]，這些基因也為茶樹抗茶餅病基因的功能鑒定提供了候選基因。

圖3 茶樹對茶餅病的防御機(jī)制Fig.3 Defense mechanism in tea trees against blister blight

寄主植物在病原菌入侵過程中可識別某些病原菌中保守物質(zhì)而激發(fā)植物的免疫機(jī)制，如真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)和β-葡聚糖[21]。植物在響應(yīng)病原菌侵染的過程中可誘發(fā)許多病程相關(guān)基因表達(dá)〔pathogenesis-related (PR) genes〕，此PR基因既可在病原感染處表達(dá)，亦可在非感染區(qū)域表達(dá)，在非感染區(qū)域表達(dá)的PR蛋白可誘發(fā)植物系統(tǒng)獲得性抗性，對提升植物抵抗病原菌二次攻擊的能力至關(guān)重要[22]。幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶是其中比較典型的具有水解能力的PR蛋白，其中幾丁質(zhì)酶可催化病原菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)N-乙酰葡糖胺同聚體間的β-1,4-連接鍵水解，β-1,3-葡聚糖酶則可水解細(xì)胞壁上的多聚糖形成低聚糖，從而破壞病原菌細(xì)胞壁，使其失去侵染能力[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)馬鈴薯I型幾丁質(zhì)酶基因和內(nèi)源1,3-β-D-葡聚糖酶基因能提高茶葉對E.vexans的抗性[25-26]。同時，轉(zhuǎn)內(nèi)源1,3-β-D-葡聚糖酶基因茶樹植株中的I型幾丁質(zhì)酶和類甜蛋白基因表達(dá)水平顯著上升，超敏反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步證明幾丁質(zhì)酶和類甜蛋白在茶樹抗茶餅病中的重要作用[25]。

植物病原菌和寄主植物中含有一些以蛋白質(zhì)、糖蛋白及復(fù)雜的碳水復(fù)合物聚合體等為存在形式的特異抗原決定簇和識別因子[27]。大量研究證實，植物品種對病害的抗性與寄主植物和病原共有抗原水平有關(guān)，共有抗原水平越高的植物品種，其抗病性越差[28]。CHAKRABORTY等[28]研究發(fā)現(xiàn)，茶餅病病原菌E.vexans與不同茶樹品種中可交叉反應(yīng)的抗原水平越高，茶樹抗茶餅病能力越弱，該抗原物質(zhì)主要存在于茶樹葉片細(xì)胞的葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。因此，該抗原物質(zhì)可以用于茶樹抗茶餅病品種的鑒定，也可作為一些殺菌劑的靶標(biāo)，還可作為抗茶餅病茶樹品種分子標(biāo)記育種的Marker[29]。KARUNARATHNA等[30-31]利用分子標(biāo)記輔助育種和批量隔離分析技術(shù)，從茶樹中成功鑒定得到 SSR DNA marker EST SSR 073，此分子標(biāo)記與光系統(tǒng)I亞基D(PsaD I)相關(guān)，是一種E.vexans抗性蛋白，對提升茶樹抗茶餅病能力和揭示其抗性機(jī)理至關(guān)重要。

茶樹SAS的激活除了可以通過病原菌侵染誘導(dǎo)外，一些生物或化學(xué)誘抗劑也能激活茶樹體內(nèi)的SAS[32-33]，如水楊酸、苯并噻二唑、CaCl2、殼聚糖及生防菌等可促進(jìn)茶樹體內(nèi)防御酶(苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、抗氧化酶、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和超氧化物歧化酶等)活性、提升木質(zhì)素含量以增強(qiáng)細(xì)胞壁功能、促進(jìn)一些抗菌物質(zhì)(黃酮類、原花青素及多酚類等)的生物合成、通過NO通路調(diào)控下游功能基因表達(dá)等，這既為茶餅病的綠色高效防治提供了藥劑選擇，也為茶樹抗茶餅病機(jī)理的揭示奠定關(guān)鍵基礎(chǔ)[33-40]。

2.2.2 生理機(jī)制 病菌基因和蛋白對植物的危害以最終代謝產(chǎn)物的作用體現(xiàn)。植物中某些特定的黃酮類物質(zhì)對植物真菌病有抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，植物特定細(xì)胞液泡中的各種原花青素占葉肉細(xì)胞的30%～40%，其對植物各種病原菌具有顯著的毒害作用，如，樟子松、番茄枝及桂皮中的原花青素對水稻紋枯病菌、葡萄灰霉病菌等具有顯著抑菌效果，其主要作用靶標(biāo)包括病原菌的蛋白激酶、對二苯代乙烯氧化酶、脂肪酸合成酶和脂氧合酶等[41]。植物中原花青素有2個合成途徑：一是通過無色花色素還原酶將兒茶素還原成原花青素；一是在花色素還原酶的作用下，將表兒茶素轉(zhuǎn)換成原花青素。在茶樹葉片中檢測到花色素還原酶活性，并利用cDNA文庫法擴(kuò)增得到2個花色素還原酶基因CsANR1和CsANR2，表明茶葉是通過表兒茶素途徑合成原花青素[42-47]。PUNYASIRI等[42]研究發(fā)現(xiàn)，E.vexans侵染可促進(jìn)易感茶樹品種葉片中原花青素的2,3-反式結(jié)構(gòu)異構(gòu)化為順式結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)其沒食子酸酯化，從而導(dǎo)致其易感茶餅病。

E.vexans入侵茶樹葉片后，葉片中除原花青素對茶餅病能起到抑菌效果外，還發(fā)生一系列其他內(nèi)在變化，包括一些抗菌代謝物含量的降低，如咖啡堿、多糖類物質(zhì)、槲皮素、山奈酚糖苷、芹黃素、楊梅酮苷、單萜類和雙萜類物質(zhì)、倍半萜烯類物質(zhì)等，同時干擾信號傳導(dǎo)物質(zhì)水楊酸和茉莉酸的合成，以方便E.vexans在茶樹體內(nèi)的定植和生長[45，48-49]。在生理水平方面，抗病和感病茶樹品種對茶餅病的響應(yīng)存在差異，感病葉片的光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度及水分利用效率明顯下降，同時，E.vexans入侵可導(dǎo)致葉片中總糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和多酚等物質(zhì)的含量顯著降低，且抗性品種的降低程度顯著低于易感品種[50-51]。另外，E.vexans侵染可改變?nèi)~片代謝調(diào)控，導(dǎo)致γ-氨基丁酸、茶氨酸、賴氨酸、色氨酸及精氨酸等含量發(fā)生變化[52]。

3 結(jié)語

茶餅病感染初期可導(dǎo)致茶樹葉片的光合作用和蒸騰作用效率下降，并顯著影響茶樹氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成及糖代謝等生物學(xué)過程。隨著病原菌的進(jìn)一步侵染，病斑在擴(kuò)大到一定程度時就受到限制。與病原菌誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(SAS)機(jī)制有關(guān)，其主要機(jī)制包括：防御酶(苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、抗氧化酶、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶及超氧化物歧化酶等)活性增強(qiáng)，提升木質(zhì)素含量以增強(qiáng)細(xì)胞壁功能，促進(jìn)一些抗菌物質(zhì)(黃酮類、原花青素、多酚類及萜類物質(zhì)等)的生物合成，通過NO、JA及SA信號通路調(diào)控下游功能基因表達(dá)等。由于相關(guān)功能基因的鑒定與驗證工作仍較缺乏，今后還需加強(qiáng)茶樹抗茶餅病病原相關(guān)基因的篩選、鑒定和功能驗證研究，為茶樹抗茶餅病品種的培育提供候選基因。