張月 李瑩 戴紹軍

摘 ?要： 建立禾本科牧草的遺傳轉(zhuǎn)化體系對于種質(zhì)資源利用具有重要意義.近年來，假儉草（Eremochloa ophiuroides）、黑麥草（Lolium perenne）、結(jié)縷草（Zoysia japonica）、柳枝稷（Panicum virgatum）、高羊茅（Festuca elata）、二穗短柄草（Brachypodium distachyum）、匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）、朝鮮堿茅（Puccinellia chinampoensis）、羊草（Leymus chinensis）、金發(fā)草（Pogonatherum paniceum）、雙花草（Dichanthium annulatum）等多種禾本科牧草遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化方法不斷得到優(yōu)化與完善.該文總結(jié)了近年來禾本科牧草在遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的研究進展，探討了植物受體材料、轉(zhuǎn)化條件、共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮濃度、抑菌劑濃度、篩選劑選擇壓等因素對轉(zhuǎn)化效率的影響.

關(guān)鍵詞： 禾本科牧草; 遺傳轉(zhuǎn)化; 影響因素

中圖分類號： Q 939.9 ???文獻標志碼： A ???文章編號： 1000-5137（2021）01-0021-07

Abstract： The establishment of a genetic transformation system for gramineous forages is of great significance to the utilization of germplasm resources.In recent years，the genetic transformation methods of various gramineous forages such as Eremochloa ophiuroides，Lolium perenne，Zoysia japonica，Panicum virgatum，F(xiàn)estuca elata，Brachypodium distachyum，Agrostis stolonifera，Puccinellia chinampoensis，Leymus chinensis，Pogonatherum paniceum and Dichanthium annulatum have been continuously optimized.This article summarized the recent research progress in the optimization of the genetic transformation systems of gramineous forages，and discussed the effects of plant receptor material，transformation condition，co-cultivation time，acetosyringone concentration，bacteriostatic agent concentration，selection pressure of screening agents and other factors on the transformation efficiency.

Key words： gramineous forage; genetic transformation; effect factors

0 ?引 言

利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)胫参锘蚪M是改良植物性狀的重要方法之一.建立穩(wěn)定高效的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系是獲得轉(zhuǎn)基因植株的前提.ZAMBRYSKI等[1]以根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒為轉(zhuǎn)化載體，將T-DNA上的基因轉(zhuǎn)入煙草細胞，成功獲得了第一株轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum L.），此后植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到迅速發(fā)展.植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要包括農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、細胞融合劑介導（PEG）法、電轉(zhuǎn)化法等.與其他方法相比，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有易操作、費用低、轉(zhuǎn)化效率高、基因拷貝數(shù)低、可轉(zhuǎn)移較大的DNA片段（50 kb）等優(yōu)點，逐漸成為植物遺傳轉(zhuǎn)化最常用的方法.農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[2]，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可通過植物材料上的傷口進入植物體內(nèi)并整合到基因組上，經(jīng)植物有性生殖過程穩(wěn)定遺傳給后代.

由于包括禾本科植物在內(nèi)的單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，利用農(nóng)桿菌介導法對其進行遺傳轉(zhuǎn)化的研究受到限制[3].HIEI等[4]構(gòu)建了VlrG和VxB高效表達的超雙元載體，通過借助酚類化合物乙酰丁香酮誘導成功建立了水稻（Oryza sativa）遺傳轉(zhuǎn)化體系，推動了農(nóng)桿菌介導單子葉遺傳轉(zhuǎn)化的研究進程.通過對轉(zhuǎn)化機理的深入探索，以及對轉(zhuǎn)化方法的不斷改進、優(yōu)化與完善，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法已成為介導禾本科作物的常用手段.近年來，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法建立了禾本科重要糧食作物水稻[5]、玉米（Zea mays）[6]、小麥（Triticum spp.）[7]、大麥（Hordeum vulgare）[8]、高粱（Sorghum bicolor）[9]，以及主要糖類作物甘蔗（Saccharum officinarum）[10]等的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并獲得了具有各種優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植物.禾本科植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為研究植物基因功能、植物發(fā)育與逆境應答分子調(diào)控機制，以及開展分子設(shè)計育種提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐.

禾本科牧草具有耐踐踏、再生能力強的特點，可作為生物燃料、能源作物，以及牲畜的能量飼料和綠化植物.此外，禾本科牧草在草原生態(tài)系統(tǒng)中具有水土保持、防風固沙的作用.近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因牧草研究也取得了明顯進展.利用農(nóng)桿菌介導法建立了禾本科牧草黑麥草[11]、結(jié)縷草[12]、柳枝稷[13]、高羊茅[14]、二穗短柄草[15]、匍匐剪股穎[16]等遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因牧草，在牧草改良方面得到了廣泛應用.

植物受體材料、轉(zhuǎn)化條件、共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮濃度、抑菌劑濃度、篩選劑選擇壓等因素對農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化都有一定影響.本文作者將系統(tǒng)介紹各因素對農(nóng)桿菌介導的禾本科植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響.

1 ?植物受體的選擇

植物受體的選擇是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一個重要因素.分裂時期細胞具有分生能力強、生長旺盛的特點，選擇分裂時期的組織器官或細胞作為轉(zhuǎn)化受體可獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化后植株的再生能力較強.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中，常用的受體材料包括胚性愈傷組織、幼胚、成熟胚、胚芽、莖尖、葉片等.對于不同植物，隨最適外植體的選擇不同，轉(zhuǎn)化效率也存在明顯差異.在假儉草遺傳轉(zhuǎn)化體系中，以種質(zhì)“E126”的側(cè)芽誘導的胚性愈傷組織作為受體材料，經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后獲得了3.6%的轉(zhuǎn)化率[17];農(nóng)桿菌介導的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化過程中，將成熟胚誘導的胚性愈傷組織作為受體材料，獲得了4.8%的轉(zhuǎn)化效率[18];柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化過程中，利用Alamo品種成熟種子誘導的胚性愈傷組織作為受體材料，轉(zhuǎn)化效率為6%[19];利用匍匐剪股穎種子誘導的胚性愈傷組織作為受體材料，轉(zhuǎn)化效率高達40%，這暗示著利用胚性愈傷組織作為受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率最高[16].此外，莖段具有直接生成不定芽的能力，選擇結(jié)縷草直接莖段作為受體材料可以獲得6.8%的轉(zhuǎn)化效率[20].由此可見，對于禾本科植物而言，選擇分裂能力旺盛、細胞活性高、DNA合成能力強的胚性細胞作為受體材料，更有利于農(nóng)桿菌與T-DNA整合，從而提高轉(zhuǎn)化效率.

2 ?轉(zhuǎn)化條件及共培養(yǎng)時間

農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系中受體材料的轉(zhuǎn)化條件與共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率有明顯影響.侵染方法不恰當會使農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率降低，侵染時間過短會使農(nóng)桿菌不能充分依附到受體材料上，導致T-DNA整合效率低，侵染時間過長則容易導致農(nóng)桿菌過度繁殖，抑菌難度增加，甚至導致受體材料會因農(nóng)桿菌毒害而死亡.共培養(yǎng)時間影響農(nóng)桿菌吸附和T-DNA轉(zhuǎn)移[21].農(nóng)桿菌必須附著在創(chuàng)傷部位16 h以上才能完成轉(zhuǎn)移過程[22].不同作物的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件與共培養(yǎng)時間存在差異，同一作物不同受體材料的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件與共培養(yǎng)時間也不同.摸索合適的轉(zhuǎn)化條件與共培養(yǎng)時間是建立高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)所必須的（表1）.

可利用冷處理、攪拌孵育和真空處理等手段提高轉(zhuǎn)化效率.在朝鮮堿茅遺傳轉(zhuǎn)化體系建立過程中，使用含有二元載體pBI 121的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105進行轉(zhuǎn)化，當菌液在600 nm波長處的吸光度值（OD600）達到0.8～1.0時，對成熟種子誘導的胚性愈傷組織浸泡孵育30 min可以達到最佳轉(zhuǎn)化效果[23];對柳枝稷胚性愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化時，使用含二元載體pCAMBIA 1305.1的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，將冷處理20 min后的胚性愈傷組織浸入OD600值為0.5的農(nóng)桿菌菌液中，經(jīng)過真空孵育10 min，攪拌孵育20 min，共培養(yǎng)3 d后，其轉(zhuǎn)化效率最高為72.8%[24].這表明：在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化前對愈傷組織進行冷處理，可大幅度減少農(nóng)桿菌侵染后愈傷組織的褐變[25];而轉(zhuǎn)化過程中對愈傷組織進行真空和攪拌孵育對提高轉(zhuǎn)化效率有促進作用，主要因為真空處理可增加愈傷組織表面創(chuàng)傷，使農(nóng)桿菌更容易進入到愈傷組織內(nèi)并整合到植物基因組上，攪拌處理則是通過增大愈傷組織與農(nóng)桿菌的接觸面積提高轉(zhuǎn)化效率.

在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化前對愈傷組織進行預培養(yǎng)，可改善愈傷組織的生長狀態(tài)，有利于獲得最佳轉(zhuǎn)化效率.在建立羊草遺傳轉(zhuǎn)化體系時，使用攜帶Ib2-Cys prx基因的載體pCAMBIA 2300轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，活化菌液至OD600值為0.4，將預培養(yǎng)7 d后的胚性愈傷組織浸入農(nóng)桿菌菌液孵育20 min，最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為共培養(yǎng)3 d，獲得8.97%的轉(zhuǎn)化效率[26].這表明：生長狀態(tài)良好、分化力強的愈傷組織具有活躍的基因整合能力，明顯有利于提高轉(zhuǎn)化效率.

在農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化過程中，不同受體材料的最適轉(zhuǎn)化條件存在差異.在黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化體系中，使用農(nóng)桿菌AGL1轉(zhuǎn)化攜帶SOS1，SOS2，SOS3，CBL10和BAR基因的耐鹽多基因植物表達載體pSOS，將成熟種子誘導的胚性愈傷組織浸泡在OD600值為0.3～0.6的農(nóng)桿菌菌液中孵育20 min，經(jīng)2 d共培養(yǎng)后得到22.8%的最高轉(zhuǎn)化效率[27];而在農(nóng)桿菌介導結(jié)縷草匍匐莖節(jié)進行遺傳轉(zhuǎn)化過程中，將二元載體pCAMBIA 1301，pCAMBIA 1304和pCAMBIA 1305.2導入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105用于轉(zhuǎn)化，將莖節(jié)浸泡在OD600值為1.0的農(nóng)桿菌菌液中真空孵育10 min，然后浸泡孵育50 min，共培養(yǎng)2 d后，其轉(zhuǎn)化效率最高為10.5%～13.7%[20].

3 ?乙酰丁香酮濃度

在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物材料的過程中需要酚類化合物誘導完成，僅靠植物材料自身分泌是遠遠不夠的，需要人為添加.乙酰丁香酮是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物過程中常用的酚類化合物.乙酰丁香酮通過誘導農(nóng)桿菌Vir區(qū)VirA基因自身磷酸化，并激活VirG基因產(chǎn)物，從而激活其他Vir基因轉(zhuǎn)錄，增強T-DNA加工與轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌T-DNA更容易進入植物基因組并與其整合[28-29].共培養(yǎng)階段是T-DNA轉(zhuǎn)移和整合的關(guān)鍵時期.

不同植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系中的乙酰丁香酮濃度存在差異.建立金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系時，選擇物質(zhì)的量濃度為20 μmol?L-1的乙酰丁香酮加入共培養(yǎng)基中作為最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件[30];結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的過程中，在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加50 μmol?L-1的乙酰丁香酮達到最大轉(zhuǎn)化率[31].農(nóng)桿菌介導的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化過程中，通過在共培養(yǎng)基中添加200 μmol?L-1的乙酰丁香酮誘導以提高轉(zhuǎn)化效率[11].在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙花草時則選擇在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加400 μmol?L-1的乙酰丁香酮[32].在柳枝稷、高羊茅和匍匐剪股穎的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，都選擇了100 μmol?L-1作為乙酰丁香酮的最適合物質(zhì)的量濃度[33-34，16].

4 ?抑菌劑濃度

共培養(yǎng)后的一個重要環(huán)節(jié)就是抑菌處理.共培養(yǎng)后受體材料表面及淺層組織中共生有大量農(nóng)桿菌.為了殺死和抑制農(nóng)桿菌的生長必須進行脫菌處理，以免影響外植體再生.抑菌劑濃度是遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的一個重要因素.抑菌劑濃度過高會抑制外植體生長甚至造成外植體死亡，濃度過低則起不到抑菌作用.常用的抑菌劑包括特美?。═im）、頭孢霉素（Cef）和羧芐青霉素（Carb）等.與Cef和Carb相比，Tim對植物材料影響較小，在胚性愈傷組織再生系統(tǒng)中能達到很好的抑菌和再生效果，是組培實驗中的首選抑菌劑.在組培過程中，可以根據(jù)植物材料受體的特點選擇抑菌劑并摸索抑菌劑濃度.二穗短柄草遺傳轉(zhuǎn)化過程中，在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為225 mg?L-1的Tim進行抑菌處理[35];黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化過程中選擇200 mg·L-1的Cef作為最適抑菌劑[11];結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化在抑菌階段選擇250 mg?L-1的Cef進行抑菌處理[36];假儉草愈傷組織的抑菌處理則選擇250 mg·L-1的Carb和250 mg?L-1的Cef結(jié)合，以達到最好的抑菌效果[37].

5 ?篩選劑及篩選壓選擇

在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，只有少數(shù)植物細胞能夠吸收外源DNA并將其整合到植物基因組中，大多數(shù)細胞仍是未被轉(zhuǎn)化的.可以利用質(zhì)粒載體上帶有的特定選擇性標記，通過相應的篩選劑篩選被轉(zhuǎn)化的細胞.篩選劑的作用是抑制非轉(zhuǎn)化細胞生長，而對轉(zhuǎn)化細胞無抑制作用，從而保證快速、有效地從大量轉(zhuǎn)化群體中篩選到含有外源目的基因的轉(zhuǎn)化體.不同植物在農(nóng)桿菌介導過程中所用的質(zhì)粒載體不同，所以其適用的篩選劑有所差異.不同受體材料對篩選劑的敏感程度和毒害忍耐程度差異較大，并且受體材料在光/暗培養(yǎng)條件下其篩選壓也不同.因此，在建立農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中，確定適合的篩選壓是基因轉(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵[38].在選擇篩選壓時，要保證在不損傷受體材料的前提下篩選出抗性受體.選擇培養(yǎng)過程中，篩選劑會降低受體組織的再生能力，增加褐化率或白化率.所選擇的篩選壓應該既能有效抑制非抗性細胞的生長，使之緩慢死亡，又不抑制抗性細胞的生長.目前廣泛使用的篩選劑包括潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kana）、草酊磷（PPT）等.

在假儉草遺傳轉(zhuǎn)化體系中，用帶有hpt選擇標記基因的pCAMBIA 1301質(zhì)粒載體進行轉(zhuǎn)化，篩選時愈傷組織的篩選壓為質(zhì)量濃度為100 mg?L-1的Hyg B，陽性芽的篩選壓為50 mg?L-1的Hyg B，生根時則不添加Hyg B[37].在農(nóng)桿菌介導的羊草遺傳轉(zhuǎn)化過程中，選擇攜帶npt II抗性基因的pCAMBIA 2300質(zhì)粒載體進行轉(zhuǎn)化，愈傷組織篩選和再生苗的篩選均選擇150 mg?L-1的Kana作為最適篩選壓[26].在匍匐剪股穎的遺傳轉(zhuǎn)化體系中使用帶有bar選擇標記基因的pCAMBIA 3301質(zhì)粒載體進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，篩選過程中以5 mg?L-1的PPT作為抗性芽的篩選壓，10 mg?L-1的PPT作為生根的篩選壓[39].

6 ?結(jié) 語

禾本科牧草作為牲畜飼料、綠化植物、生物燃料和能源作物，具有巨大的經(jīng)濟價值和生態(tài)功能.利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將禾本科牧草自身不具有的優(yōu)良外源基因?qū)胫参锘蚪M，實現(xiàn)僅靠傳統(tǒng)育種無法實現(xiàn)的遺傳重組，定向改造植物遺傳性狀.農(nóng)桿菌介導法構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響因子很多，不同植物材料的遺傳轉(zhuǎn)化條件差異較大.基于基本的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化機理，不斷改進轉(zhuǎn)化方法，提高轉(zhuǎn)化效率，不斷建立新物種的轉(zhuǎn)化方法，對于研究禾本科牧草發(fā)育與逆境應答機制具有重要意義，也是開展基因編輯分子設(shè)計育種的基礎(chǔ).

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（責任編輯：顧浩然）