戴圻霏，韓建華，孫旸*，陳光

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2.吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林 吉林 132012）

柞蠶絲素蛋白是由柞蠶絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，包含丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸等14種氨基酸。柞蠶屬于野蠶，主要分布在遼寧、河南等地。目前，我國柞蠶原料繭和蠶絲產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的3/4。長期以來，柞蠶絲最為主要價值在于紡織，但是隨著時代的不斷發(fā)展，許多科學(xué)家對其不斷開發(fā)，范圍覆蓋了多個領(lǐng)域，比如手術(shù)后的縫合線、涂料、分離膜及生物活性物的固定化和智能型水凝膠等，目前柞蠶絲有很大的發(fā)展空間。

絲素蛋白主要應(yīng)用于兩大領(lǐng)域，生物材料和生物醫(yī)學(xué)。但是近幾年來，研究人員對絲素蛋白在食品方面的應(yīng)用也有所探究。如韓建華等[1-2]稱取柞蠶絲素納米粉產(chǎn)品12 g加水至40 mL混勻，按40 mL/kg給予小鼠灌胃，觀察14 d結(jié)果顯示，柞蠶絲解酒保肝產(chǎn)品未對小鼠產(chǎn)生急性毒性反應(yīng)，以期證明柞蠶絲食品有一定的安全性。

本試驗在大鼠生長試驗的基礎(chǔ)上開展試驗，通過測定大鼠對柞蠶絲素蛋白的消化吸收狀況，以及通過喂養(yǎng)實驗和氮代謝實驗，來檢測柞蠶絲素蛋白營養(yǎng)價值及食用安全性，對柞蠶絲素蛋白的營養(yǎng)價值作進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠：億斯實驗動物技術(shù)有限公司，試驗用鼠均SPF級別，動物飼養(yǎng)室溫度為（20±2）℃，通風(fēng)頻率≥10次/h，生長環(huán)境均為12 h光照、12 h黑暗，作息規(guī)律。

1.2 飼料配方

參考美國官方分析化學(xué)師協(xié)會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）中蛋白質(zhì)功效比值（protein efficiency ratio，PER）測定方法中的飼料配方要求設(shè)計蛋白喂養(yǎng)飼料，以含酪蛋白的飼料為陽性對照，飼料配方如表1所示。

表1 柞蠶絲素蛋白試驗飼料配方Table 1 Formula of tussah silk fibroin experiment feed%

1.3 儀器與試劑

SPD80全自動定氮儀：優(yōu)品培養(yǎng)基實驗器材有限公司；D2大鼠代謝籠：馮氏實驗動物設(shè)備有限公司；TU-1810型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；BS-600L電子天平：江蘇南京俱全儀器有限公司。

酪蛋白（含氮量13%）：天津大茂化學(xué)試劑廠；無氮飼料：天津天垚有限公司；正常組飼料：長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物選擇與準(zhǔn)備

清潔級SD大鼠（SPF級，雄性，體重為90 g～110 g，日齡28 d）：億斯實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)溫度為21℃～23℃，室內(nèi)相對濕度（relative humidity，RH）為70%～75%，自然光照，自由采食和飲水。每日給予大鼠足夠的特定飼料，大鼠飲水來自純凈的自來水[3]。

1.4.2 大鼠28 d喂養(yǎng)實驗

實驗前將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為高蛋白組、低蛋白組、酪蛋白組、無蛋白組、正常組（空白對照），每組5只，組內(nèi)體重差不大于10 g。實驗期間分別喂不同配方飼料，并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測和觀察。

1.4.3 柞蠶絲素蛋白氨基酸測定

由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院進(jìn)行測定待測柞蠶絲素中的各種氨基酸所占比例。

1.4.4 氮代謝實驗

喂養(yǎng)實驗的第6天起進(jìn)行5 d的氮代謝實驗。氮代謝實驗的第1天及代謝期結(jié)束的次日早上在柞蠶絲素蛋白飼料中加入胭脂紅作為標(biāo)記，每只鼠首次排出紅色糞便為開始收集的信號，將大鼠的糞便全部收集到塑封袋中進(jìn)行凍干放置-20℃保存。每天將代謝籠漏斗下每只鼠的尿液收集于玻璃瓶中，置-20℃冰箱保存。糞便用凱氏定氮法定氮，尿液用考馬斯亮藍(lán)法定氮[4]。大鼠消化中食物氮是柞蠶絲素蛋白飼料中含氮量；糞氮是大鼠吃過飼料后排泄物的含氮量；糞代謝氮是大鼠食用無氮飼料后排泄物中的含氮量；糞內(nèi)源氮指無氮（蛋白質(zhì)）膳食條件下，機(jī)體由糞便排出的氮；尿內(nèi)源氮指無氮（蛋白質(zhì)）膳食條件下，機(jī)體由尿排出的氮。

1.4.5 柞蠶絲素蛋白消化實驗

待大鼠生長穩(wěn)定，開始進(jìn)行消化實驗測定柞蠶絲素蛋白在大鼠體內(nèi)的消化、吸收、代謝等數(shù)值。飼養(yǎng)一段時間后，每天稱量食物消耗，收集每天未消化的飼料、排泄物和尿液，并且小心分離，將排泄物在100℃真空干燥箱過夜研磨，排泄物根據(jù)氮代謝實驗相關(guān)數(shù)值進(jìn)行計算相關(guān)消化指標(biāo)。

1）蛋白質(zhì)功效比值（protein efficiency ratio，PER）是大鼠體重的增加與所攝取的蛋白質(zhì)之比，表示將蛋白質(zhì)用于生長的效率。

PER=實驗期內(nèi)動物體重增加克數(shù)/實驗期內(nèi)攝入的蛋白質(zhì)克數(shù)

2）蛋白質(zhì)消化率反映蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被分解程度，同時還反映消化后的氨基酸和肽被機(jī)體吸收的程度。其中，消化率分為真消化率（true digestibility，TD）和表觀消化率（apparent digestibility，AD）。

TD/%=[食物氮-（糞氮-糞代謝氮）]÷食物氮×100

AD/%=（食物氮-糞氮）÷食物氮×100

3）生物價（biological value，BV）是機(jī)體的氮儲留量與氮吸收量之比。尿內(nèi)源氮是機(jī)體在無氮膳食條件下尿中所含有的氮，它們來自體內(nèi)組織蛋白質(zhì)的分解。主要用來評價蛋白質(zhì)的價值，它表示食物中的蛋白質(zhì)成分在體內(nèi)真正被利用的程度。

BV=儲留氮÷吸收氮

儲留氮=吸收氮-（尿氮-尿內(nèi)源氮）

吸收氮=攝入氮-（糞氮-糞內(nèi)源氮）

攝入氮=糞氮十尿氮

4）蛋白質(zhì)凈利用率（net protein utilization，NPU）是機(jī)體的氮儲留量與攝入氮量之比，表示蛋白質(zhì)實際被利用的程度。

NPU/%=儲留氮÷食物氮=生物價×表觀消化率

測定相關(guān)消化指標(biāo)后，進(jìn)行進(jìn)一步柞蠶絲素蛋白安全性能檢查。

1.4.6 大鼠血液生化指標(biāo)測定

大鼠喂養(yǎng)實驗結(jié)束后，給予麻醉藥15 min，從大鼠肛門處向胸腔剪開，在腸胃后部的脊柱動脈扎入抽血針，進(jìn)行抽血[5-6]。每組各鼠取0.5 mL大鼠血液送到吉林市龍?zhí)秴^(qū)鐵東醫(yī)院測其血液中各項生化指標(biāo)。

1.4.7 柞蠶絲素蛋白對大鼠組織病理學(xué)的影響

抽血后處死各組大鼠，仰位固定于板上，剖腹取出心、肝、脾、肺、腎和睪丸，先肉眼觀察高蛋白組合低蛋白組大鼠的各個器官與正常組之間的差異，外形、體積、顏色、質(zhì)地有無改變。然后進(jìn)行器官取樣放入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphat buffer saline，PBS）配制的4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定送到吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室進(jìn)行切片觀察。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 柞蠶絲素蛋白氨基酸組成

柞蠶絲素蛋白氨基酸組成見表2。該蛋白中丙氨酸（Ala）含量最高，占氨基酸總量的45.952 5%，蛋氨酸（Met）含量最少僅含0.0648 7%。

表2 柞蠶絲素蛋白各種氨基酸含量Table 2 Amino acid content of tussah silk fibroin

柞蠶絲素蛋白是由柞蠶絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)摻雜著少量雜質(zhì)，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)包含丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸等14種氨基酸。柞蠶絲素蛋白含有5種人體必需氨基酸：苯丙氨酸（phenylalanine）、蛋氨酸（methionine）、異亮氨酸（isoleucine）、亮氨酸（leucine）、纈氨酸（valine）。其中甘氨酸和絲氨酸具有降低血液中膽固醇濃度；丙氨酸有促進(jìn)酒精代謝的作用；酪氨酸具有預(yù)防老年癡呆的作用[9]。所以，柞蠶絲素蛋白在食用方面有很高的營養(yǎng)價值。

2.2 柞蠶絲素蛋白對大鼠體內(nèi)機(jī)能影響

2.2.1 柞蠶絲素蛋白對大鼠體重的影響

柞蠶絲素蛋白對大鼠體重的影響見表3。

如表3所示，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，28 d喂養(yǎng)后，大鼠的體重、攝食量在高、低蛋白組和正常組間比較存在顯著性差異，即攝入柞蠶絲素蛋白可以降低大鼠體內(nèi)脂肪，減少食物攝取，可能發(fā)揮減肥作用。

表3 柞蠶絲素蛋白對大鼠體重的影響Table 3 Effect of tussah silk fibroin on rat weight

2.2.2 柞蠶絲素蛋白對大鼠消化指標(biāo)的影響

柞蠶絲素蛋白對大鼠消化指標(biāo)的影響如表4所示。

表4 柞蠶絲素蛋白對大鼠消化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of tussah silk fibroin on digestive indexes of rats

如表4所示，28 d喂養(yǎng)后，使用凱氏定氮儀測得儲留氮和吸收氮數(shù)值，與正常組比較，高蛋白組和低蛋白組的PER顯著性降低（P<0.05）。PER計算得到負(fù)值，與正常組相比存在差異原因在于大鼠在28 d的柞蠶絲素蛋白飼料飼養(yǎng)過程中，體重不斷減輕。高蛋白組和低蛋白組的生物價與比正常組相比略低，分別達(dá)到了（98.13±1.74）和（96.35±2.66），蛋白質(zhì)被機(jī)體利用程度越高，食物被消化后產(chǎn)生的含氮廢物就越少，有利于減輕肝、腎的負(fù)擔(dān)[10-12]，所以正常組的飼料對大鼠吸收消化略優(yōu)于柞蠶絲素蛋白飼料。

2.2.3 柞蠶絲素蛋白對大鼠生化指標(biāo)的影響

柞蠶絲素蛋白對大鼠血清生化指標(biāo)的影響見表5。

如表5所示，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，28 d喂養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)低蛋白組與高蛋白組總蛋白、血白蛋白、球蛋白、總膽紅素、乳酸脫氫酶、甘油三酯較正常組均有顯著性改變；低蛋白組高密度脂蛋白、低密度脂蛋白也有顯著性改變，其余的生化指標(biāo)與正常組比較，均未見顯著性改變（P>0.05）。其中，低、高蛋白組總蛋白、血白蛋白、高密度脂蛋白、總膽紅素、乳酸脫氫酶、球蛋白均在正常范圍內(nèi)，高蛋白組白球比略低于正常值（1.08 g/L～1.31 g/L）。

表5 柞蠶絲素蛋白對大鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of tussah silk fibroin on rat serum biochemical indicators

低蛋白組和高蛋白組甘油三酯低于正常范圍（0.67 mmol/L～1.85 mmol/L），且與正常組存在顯著性差異。究其原因發(fā)現(xiàn)甘油三酯與大鼠體重有關(guān)，說明柞蠶絲素蛋白對甘油三酯影響較大。從而發(fā)現(xiàn)蠶絲蛋白具有減肥效果，但是過高劑量柞蠶絲素蛋白對體內(nèi)生化指標(biāo)有影響，進(jìn)而產(chǎn)生副作用，所以考慮食用劑量應(yīng)該低于低劑量[13]。

2.2.4 柞蠶絲素蛋白對大鼠組織病理學(xué)的影響

高蛋白組與低蛋白組的大鼠與正常組比較，低蛋白組均和正常組無明顯差別，且無病變。但是高劑量柞蠶絲素蛋白組的大鼠肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)水腫的現(xiàn)象，如圖1所示。

圖1 高劑量柞蠶絲素蛋白對大鼠組織病理學(xué)的影響Fig.1 Effect of high-dose tussah silk fibroin on histopathology of rats

其他肺、腎、脾、心、睪丸均未見顯著性改變，即低劑量的柞蠶絲素蛋白對大鼠體內(nèi)各個器官無明顯影響，但是高濃度的高柞蠶絲素蛋白飼料喂養(yǎng)可能存在肝損傷風(fēng)險，食用需適量。

3 結(jié)論

綜合上述實驗結(jié)果，柞蠶絲素蛋白在作為飼料喂養(yǎng)大鼠，大鼠消化柞蠶絲素蛋白后，主要顯著特征是體重有所減輕，高蛋白組真消化率和表觀消化率分別為（54.65±4.00）%和（35.83±2.60）%，生物價為 98.13±1.74，蛋白質(zhì)凈利用率為56.67±2.93，功效比值為-0.99±0.43，低蛋白組TD 和AD 分別為（57.77±5.08）%和（33.36±1.19）%，BV 為 96.35±2.66，NPU 為（60.40±5.65）%，PER 為-0.99±0.43。從實驗結(jié)果可知，柞蠶絲素蛋白在大鼠體內(nèi)吸收率較低，但是吸收入血后生物價基本大于95，說明機(jī)體對該蛋白利用率較高，但是PER為負(fù)值意味著大鼠體重有所減輕，由此判定柞蠶絲素蛋白維持大鼠體內(nèi)氮平衡時，可保存相應(yīng)肌肉和能量，減少部分多余脂肪量。根據(jù)生化指標(biāo)測定和大鼠組織病理學(xué)探究發(fā)現(xiàn)柞蠶絲素蛋白在飼料中比重過大對肝有一定影響，所以柞蠶絲素蛋白在減肥食用方面大有潛力但不宜大量食用，影響身體健康。