孫浩，左婕，雷霆雯，王筑婷，莫曉川，張禮林，許慶忠，李紅梅

（貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，貴州 貴陽 550025）

食源性天然抗氧化肽具有較強的抗氧化活性和較高的安全性，因此制備食源性抗氧化肽逐漸受到人們的重視[1]。已有研究者從發(fā)酵乳、鳶烏賊、大豆、乳清、玉米、雞蛋和魚等多種食材中制備得到抗氧化肽[2-6]。這些研究主要集中在抗氧化肽的酶解工藝、分離純化、功能鑒定等方面，而生產加工及儲存條件對其活性的影響研究較少。多肽作為蛋白質的降解產物，與蛋白質有類似的性質，其活性易受環(huán)境因素的影響，例如pH值、高溫、重金屬鹽、有機溶劑、超聲波、高壓等。肽類物質在生產加工、儲存過程中，可能會因氧化、脫氨基、水解或環(huán)化等作用而發(fā)生降解，導致其生物活性下降甚至完全喪失，這將嚴重影響到肽類產品的開發(fā)應用[7-8]。所以，研究肽類物質在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性顯得尤為重要。

苦蕎作為一種重要的農作物，因其風味獨特，營養(yǎng)價值高，具有很好的保健食療作用，被譽為“長壽食品”，已經得到廣泛應用。苦蕎的蛋白質含量為13.4%，富含賴氨酸、苯丙氨酸等多種必需氨基酸，是一種營養(yǎng)均衡的蛋白質，可以很好地為人體所利用。有研究發(fā)現苦蕎蛋白具有降低膽固醇、降血脂、抗衰老、抑制乳腺癌的發(fā)生、抑制膽結石等作用[9-12]。前期通過堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白得到苦蕎清蛋白酶解液，然后通過超濾分離、陰離子交換色譜、反向高效液相色譜成功分離出苦蕎活性肽組分，經測序其氨基酸序列為Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp（AFYRW），分子量大小為741.8 Da，并發(fā)現其在體外有良好的抗氧化活性[13]，其清除羥自由基和DPPH自由基的IC50分別為0.65 mmol/L和0.64 mmol/L，同時還具有顯著的脂質過氧化活性和還原性。這些結果表明AFYRW可能具有作為食品添加劑或功能性食品的潛在用途。然而，多肽必須抵抗胃腸道蛋白酶的降解，并通過腸道屏障完整的吸收，才能在人體系統發(fā)揮生理作用[14]。作為食品添加劑，還應考慮溫度和加工條件對多肽的穩(wěn)定性的影響。因此，本文研究了pH值、高溫、凍融、金屬離子以及模擬胃腸消化對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響，為其后期開發(fā)為食品添加劑、功能性食品等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

苦蕎抗氧化肽AFYRW（純度≥98%）：上海淘普生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海思域化工科技有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）：大連美侖生物科技有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg）、Triton X-100：北京索萊寶科技有限公司；羥自由基測試試劑盒：南京建成生物工程研究所；無水乙醇、鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：重慶茂業(yè)化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PE28 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Epoch2全波長酶標儀：美國Bio-Tek公司；DF-II數顯集熱式磁力攪拌器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；SHHW21恒溫水浴箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1·OH清除率的計算

采用南京建成生物公司的羥自由基測試試劑盒測定樣品的·OH清除率，嚴格按照羥自由基測試試劑盒說明書要求進行試驗，并按照下面的公式計算羥自由基清除率。

羥自由基清除率/%=（Aa-Ab）/Aa×100

式中：Aa為空白吸光度；Ab為樣品吸光度。

1.3.2 DPPH自由基清除率的計算

根據LIU等[15]描述的方法測定DPPH自由基清除率，并稍作修改。用95%乙醇溶液制備0.1 mmol/L的DPPH溶液。將100 μL樣品和100 μL DPPH溶液在96孔板中混合。將混合物在黑暗中靜置30 min。通過全波長酶標儀在波長為517 nm的條件下測量吸光度。使用乙醇做空白。DPPH自由基清除率通過以下公式計算。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（Aa-Ab）/Ac]×100

式中：Aa為樣品加DPPH溶液的吸光度值；Ab為樣品加無水乙醇的吸光度值；Ac為無水乙醇加DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3 pH值對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，用1 mol/L氫氧化鈉和鹽酸調整溶液pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫（25 ℃）振蕩反應 2 h，結束后直接測定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.4 溫度對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，分別在 37、65、98 ℃水浴中保溫 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 h，測定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.5 反復凍融對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，將其放置-80 ℃冰箱反復凍融 0、1、2、4、6、8、10次，測定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.6 金屬離子對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為2 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，向其添加等體積的 K+、Mg2+、Na+、Ca2+金屬離子溶液，使每種金屬離子濃度分別為0、0.05、0.10、0.20 mol/L，室溫（25℃）放置2 h，測定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.7 體外模擬胃腸道消化對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

根據ZHU等[16]的方法并稍加改動，配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，用1 mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至2.0，向其加入4%（質量分數）的胃蛋白酶，37℃水浴2 h，反應完成后，沸水浴10 min，6 000 r/min離心10 min，上清液為胃蛋白酶消化產物；取上清液用0.9 mol/L碳酸氫鈉調節(jié)pH 5.3，再用1 mol/L氫氧化鈉調節(jié)pH值至8.0，向其加入4%（質量分數）的胰蛋白酶，沸水浴10 min，6 000 r/min離心10 min，得到的上清液為胃蛋白酶、胰蛋白酶消化樣品；取1mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，用1mol/L氫氧化鈉調節(jié)pH 8.0，向其加入4%（質量分數）的胰蛋白酶，沸水浴10 min，6 000 r/min離心10 min，得到的上清液為胰蛋白酶消化樣品。將上述樣品的pH值調至7.0，測定上清液的·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.8 苦蕎抗氧化肽AFYRW溶血活性的測定

根據SOUZA等[17]的方法測定苦蕎抗氧化肽AFYRW的溶血活性，取新鮮分離的人紅細胞，用pH 7.4，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，然后在150 g，4℃離心10 min，重復3次，得到洗滌紅細胞，用磷酸鹽緩沖液配制濃度為4%（體積分數）的紅細胞懸液；將100 μL 濃度為 0、10、50、100、200、300、400、500 μg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW加入到含有100 μL 4%的紅細胞懸液的96孔板中，37℃共同孵育1 h，225 g，4℃離心10 min，取100 μL上清液，用酶標儀測定其在450nm的吸光度值。0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液為陰性對照，0.1%的Triton X-100為陽性對照。重復3次。并按照下面的公式計算溶血率。

紅細胞溶血率/%=（Aa-Ab）/（Ac-Ab）×100

式中：Aa為樣品吸光度值；Ab為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液的吸光度值；Ac為0.1%的Triton X-100的吸光度值。

1.4 統計分析

每組試驗重復3次，試驗結果以均值±標準差表示。使用SPSS 25.0軟件進行方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 pH值對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

pH值對苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響如圖1所示。

圖1 pH值對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of pH on antioxidant activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

由圖1可以看出，pH值為3時，苦蕎抗氧化肽AFYRW對·OH清除率和DPPH自由基清除率最強，分別為63.81%和57.80%，隨著pH值的上升，苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性顯著下降（P<0.05），在pH值為11時，抗氧化活性最低，但也保持著較高的水平，這時·OH清除率和DPPH自由基清除率分別為47.52%和44.24%。與pH值為3時比較，pH值為11時對·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了16.29%（P<0.05）和 13.56%（P<0.05）。這可能是隨著 pH值增大，多肽易發(fā)生消旋作用，造成一些L型氨基酸變成D型氨基酸，進而引起極性和空間位阻等結構性質變化，降低生物活性[18]。因此，在加工利用過程中，應避免在強堿性環(huán)境下使用苦蕎抗氧化肽AFYRW。

2.2 溫度對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

溫度對苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響如圖2、圖3所示。

圖2 溫度對苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率的影響Fig.2 Effect of temperature on·OH scavenging rate of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

由圖 2、圖 3可以看出，在 37、65、98℃時，苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性保持在比較穩(wěn)定的狀態(tài)（P>0.05）。這可能是因為分子量較小的肽不具備熱敏感的三級和四級結構[19]，苦蕎抗氧化肽AFYRW是只有5個氨基酸的小肽，過高溫度處理，時間過長，可能并不會改變苦蕎抗氧化肽AFYRW的結構，也沒有影響其抗氧化活性，這與WONG等[20]研究黃貂魚水解液抗氧化肽的結果相一致。這表明苦蕎抗氧化肽AFYRW在生產加工中是耐高溫的。

圖3 溫度對苦蕎抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

2.3 反復凍融對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

反復凍融對苦蕎活性肽AFYRW的抗氧化活性影響如圖4所示。

圖4 凍融對苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of freezing and thawing on antioxidant activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

從圖4中可以看出，即使反復凍融10次，苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性還保持在比較穩(wěn)定的狀態(tài)（P>0.05），說明反復凍融并不會影響苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性，這也表明苦蕎抗氧化肽AFYRW在生產加工過程中是可以凍融、耐低溫的。

2.4 金屬離子對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

金屬離子對苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性如圖5、圖6所示。

圖5 金屬離子對苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率的影響Fig.5 Effect of metal ions on·OH clearance of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

圖6 金屬離子對苦蕎抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of metal ions on DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

由圖 5 和圖 6 可以看出，Mg2+、Na+在 0～0.20 mol/L時，對苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性影響不顯著（P>0.05）；K+可以提高苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率，濃度為0.20 mol/L時，·OH清除率相比未添加K+時可以提高9.67%（P<0.05），K+對苦蕎活性肽AFYRW的DPPH自由基清除率的影響不顯著（P>0.05）；Ca2+在 0～0.10mol/L 時，對苦蕎抗氧化肽 AFYRW的DPPH自由基清除率的影響不顯著（P>0.05），Ca2+在0.20 mol/L時，抑制了苦蕎抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率，比未添加Ca2+低4.4%左右（P<0.05）；Ca2+對苦蕎抗氧化肽的·OH清除率沒有顯著影響（P>0.05）。結果表明，苦蕎抗氧化肽AFYRW在加工儲存過程中，可以與含有Mg2+、Na+、K+的原輔料一起加工，但應該盡量避免與Ca2+接觸。

2.5 體外模擬胃腸道消化對苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

模擬胃腸道消化對苦蕎抗氧化肽的抗氧化活性影響如圖7所示。

圖7 模擬胃腸消化對苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of simulated gastrointestinal digestion on antioxidant activity of antioxidant peptide AFYRW in tartary buckwheat

經過2 h模擬胃液消化后，與消化前相比，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了12.03%（P<0.05）、16.86%（P<0.05）；經過 2 h 模擬腸液消化后，與消化前相比，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了 9.02%（P<0.05）、11.63%（P<0.05）；先經過胃液消化2 h后，再經腸液消化2 h，與消化前相比，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了14.71%（P<0.05）、19.96%（P<0.05）。通常，胃蛋白酶會水解食源性蛋白質生成分子量超過10 kDa的肽混合物，后者會被胰蛋白酶進一步水解為小肽。CHITTCHANG等[21]發(fā)現分子量大于3 kDa的肽在胃消化過程中比分子量小于3 kDa的肽更容易被降解。然而，CING MARS等[22]發(fā)現低分子量的活性肽優(yōu)先比高分子量肽水解。研究結果表明，除了分子量外，肽的其它特性，如酸堿性、疏水性和碳氮末端氨基酸組成也對肽的胃腸消化穩(wěn)定性有影響[23]。因此，苦蕎抗氧化肽AFYRW的胃腸消化穩(wěn)定性還需要進一步研究和分析。

2.6 苦蕎抗氧化肽AFYRW溶血活性

苦蕎抗氧化肽AFYRW對紅細胞的溶血作用如圖8所示。

由圖8可以看出，苦蕎抗氧化肽AFYRW的濃度達到500 μg/mL時，其吸光度與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液吸光度無差異（P>0.05），溶血率為0，說明苦蕎抗氧化肽AFYRW對紅細胞無溶血作用，這一結果也與YANG等[24]研究的抗菌肽AMP-17對紅細胞的作用相一致。因此，苦蕎抗氧化肽AFYRW對人的紅細胞是安全的。

3 結論

以苦蕎抗氧化肽AFYRW為對象，研究了不同因素和體外模擬胃腸消化對其抗氧化活性的影響，以及抗氧化肽AFYRW對紅細胞的溶血作用。結果表明：苦蕎抗氧化肽AFYRW具有較好的熱穩(wěn)定性；反復凍融、Na+、Mg2+對抗氧化肽AFYRW抗氧化活性無顯著變化；Ca2+會降低抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率，K+會提高抗氧化肽AFYRW的·OH清除率；隨著pH值升高，抗氧化肽AFYRW的·OH和DPPH自由基清除率下降，不利于苦蕎抗氧化肽AFYRW活性的保持。不同因素對苦蕎抗氧化肽AFYRW活性影響不同，因此，在苦蕎抗氧化肽AFYRW的生產加工中，采用合理優(yōu)化的條件有利于避免其活性的下降。苦蕎抗氧化肽AFYRW對紅細胞無溶血作用，說明苦蕎抗氧化肽AFYRW無毒性作用。但模擬胃腸消化后發(fā)現苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性下降，說明胃腸消化道酶可能會降解肽或改變其結構，因此在整個胃腸消化過程中可能需要使用一些策略來提高其生物利用度，在這方面，還需要進一步研究，以評價肽作為功能性食品的生物活性和生物利用度，以及可能對人體產生的生理影響。