居述云，吳堅平，楊立榮

（1 浙江大學化學工程與生物工程學院，浙江杭州310027；2 浙江大學杭州國際科創(chuàng)中心，浙江杭州311200）

D- 氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase,DAAO,EC 1.4.3.3）是一類含有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的黃素蛋白。有氧條件下，該類酶能夠?qū)τ丑w選擇性催化D-氨基酸氧化脫氫，生成亞胺酸。后者自發(fā)水解生成相應(yīng)的α-酮酸和氨，見圖1。反應(yīng)過程中，還原型輔酶FADH2經(jīng)氧氣再氧化，產(chǎn)生過氧化氫。

圖1 DAAO催化D-氨基酸氧化脫氫反應(yīng)示意圖

迄今為止，已報道的DAAO主要來源于真核生物，如絲狀真菌、酵母菌、哺乳動物等[1]。其中，典型的DAAO 包括豬腎（porcine kidney）來源的pkDAAO[2]、紅酵母（Rhodotorula gracilis）來源的RgDAAO[3]和三角酵母（Trigonopsis variabilis）來源的TvDAAO[4]。此外，在放線菌屬的原核生物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了DAAO[5]，例如源自原玻璃蠅節(jié)桿菌（Arthrobacter protophormiae）的ApDAAO。這些不同來源的DAAO 不僅在D-氨基酸代謝過程中發(fā)揮重要作用[6]，同時也為該類酶在生物技術(shù)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

DAAO通常具有寬泛的底物譜和高度的對映體選擇性，已被成功用于多種生化反應(yīng)過程，相關(guān)研究引起了國內(nèi)外學者廣泛的關(guān)注[7-8]。多年來，DAAO在生物催化方面的應(yīng)用主要見于7-氨基頭孢烷酸、手性氨基酸以及α-酮酸的合成。最近，研究人員基于該類酶的蛋白結(jié)構(gòu)以及催化機制，通過蛋白質(zhì)工程改造酶的催化性能，使其能夠選擇性催化氧化胺類化合物并用于制備手性胺，不僅成功拓展了底物特異性，而且為后續(xù)以DAAO為蛋白骨架創(chuàng)制新的酶類提供了重要的理論依據(jù)。

本文介紹了DAAO的蛋白結(jié)構(gòu)特征及其催化機制，闡述了DAAO底物特異性和熱穩(wěn)定性分子改造的代表性成果。最后，總結(jié)了DAAO在生物催化與轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進展。

1 D-氨基酸氧化酶的結(jié)構(gòu)特征及催化機制

1.1 D-氨基酸氧化酶的蛋白結(jié)構(gòu)特征

到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）中已披露的DAAO 登錄號共有39 個，包括4 個RgDAAO[9-10]、16 個pkDAAO[11-12]以及19 個人體來源的hDAAO[13]。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)都是基于X 射線晶體衍射技術(shù)而獲得，分辨率在1.2～3.2?（1?=10－10m）。

RgDAAO、pkDAAO和hDAAO蛋白分子量大小相近，單個亞基所含有的氨基酸數(shù)目分別為368、347 和347，見表1。序列比對結(jié)果表明，pkDAAO（或hDAAO） 與RgDAAO 的序列一致性分別為28.73%（或27.73%）。

雖然RgDAAO、pkDAAO 和hDAAO 的氨基酸序列具有一定的差異，但在三維結(jié)構(gòu)上卻頗為相似[14-15]。一般而言，它們均為同源二聚體，每一個亞基都含有一個非共價結(jié)合的輔酶FAD。催化活性中心處與配體相互作用的氨基酸殘基具有高度的保守性。例如，在RgDAAO 與D-三氟丙氨酸的復合體晶體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號：1C0L[9]）中，D-三氟丙氨酸的α-羧基與R285位的精氨酸殘基以及Y223位的酪氨酸殘基相互作用，形成了鹽橋和氫鍵，見圖2(a)。pkDAAO與苯甲酸（PDB登錄號：1VE9[12]）[見圖2(b)]以及hDAAO與2-氨基苯甲酸（PDB登錄號：2E4A[13]）[見圖2(c)]的復合體晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明，與配體羧基作用的正是R283 位的精氨酸殘基以及Y228 位的酪氨酸殘基。此外，配體的取代基團都朝向由疏水性氨基酸殘基（如苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等）形成的口袋。DAAO蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析不僅有利于該類酶催化機制的研究，而且為后續(xù)蛋白質(zhì)工程改造酶的催化性能提供了重要的理論支撐。

1.2 D-氨基酸氧化酶的催化機制

Walsh 等[16]和Hersh 等[17]早 期 針 對DAAO 催 化的氧化脫氫反應(yīng)，分別提出了“負碳離子”和“Cα-H氫轉(zhuǎn)移”機制。隨著pkDAAO和RgDAAO的蛋白結(jié)構(gòu)相繼被解析，目前普遍認可的是“氫轉(zhuǎn)移”機制[9,18]。DAAO 利用輔酶FAD 在底物和O2之間進行電子和氫的轉(zhuǎn)運（見圖3），所催化的氧化脫氫反應(yīng)由兩個半反應(yīng)組成。①還原半反應(yīng)，底物進入DAAO 的活性中心后，以兼性離子的狀態(tài)與活性中心底物結(jié)合口袋處的氨基酸殘基相互作用，形成氫鍵、離子鍵等。這種狀態(tài)會發(fā)生動態(tài)平衡，底物Cα上的氫轉(zhuǎn)移到輔酶FAD 異咯嗪環(huán)的N(5)上，而氨基上的一個氫則釋放到反應(yīng)體系中，從而形成亞胺酸。該化合物不穩(wěn)定，自發(fā)水解生成相應(yīng)的α-酮酸和氨。②氧化半反應(yīng)，還原型輔酶被O2氧化，生成過氧化氫。整個反應(yīng)過程中，活性中心處的氨基酸殘基并沒有直接參與催化反應(yīng)，僅僅與底物的結(jié)合及其保持正確定向有關(guān)[7,9,19]。

表1 RgDAAO、pkDAAO和hDAAO的基本性質(zhì)比較

圖2 RgDAAO、pkDAAO和hDAAO分別與不同配體相互作用的二維平面圖

圖3 DAAO催化D-氨基酸氧化脫氫的反應(yīng)機制示意圖

2 D-氨基酸氧化酶的蛋白質(zhì)工程

2.1 D-氨基酸氧化酶底物特異性的分子改造

2.1.1 基于理性設(shè)計改變底物結(jié)合口袋處關(guān)鍵氨基酸殘基的帶電性質(zhì)

RgDAAO 的底物特異性偏好中性或堿性D-氨基酸。為提高該酶對酸性氨基酸的催化活力，Pollegioni 等[20]將D-天冬氨酸（1，見表2）分別與牛腎來源D-天冬氨酸氧化酶DASPO（同源模建）和RgDAAO（PDB 登錄號:1C0L）進行分子對接，選取底物結(jié)合口袋處的M213進行定點突變。結(jié)果表明M213 位甲硫氨酸殘基對于RgDAAO 正確識別D-天冬氨酸側(cè)鏈基團中帶負電荷的羧基具有重要影響，而在DASPO 模擬結(jié)構(gòu)中，與之相對應(yīng)的是側(cè)鏈基團帶正電荷的精氨酸殘基。當甲硫氨酸被精氨酸取代后，突變體M213R對D-天冬氨酸(1)和D-谷氨酸(2)的催化效率（kcat/Km值）分別是原始酶的74倍和37倍，而對D-丙氨酸(3)的催化效率卻顯著降低。

近年來，Asano 等[21]通過分析苯甲酸與pkDAAO的復合物晶體結(jié)構(gòu)，選取與苯甲酸的羧基形成鹽橋的R283作為定點飽和突變位點。當R283位側(cè)鏈基團帶正電荷的精氨酸殘基突變?yōu)椴粠щ姾傻母拾彼釟埢鶗r，突變體R283G 轉(zhuǎn)變成了具有嚴格(R)-構(gòu)型選擇性的胺氧化酶，能夠?qū)τ丑w選擇性識別(R)-α-苯乙胺(9)，同時喪失了對天然底物D-苯丙氨酸的催化活力，從而將pkDAAO的底物特異性由氨基酸拓展到了胺類化合物。

上述研究表明，DAAO底物結(jié)合口袋處關(guān)鍵氨基酸殘基的帶電性質(zhì)能夠顯著影響該酶對底物的識別能力。因此，對這些位點進行改造可以進一步拓展DAAO的底物特異性。

2.1.2 基于理性設(shè)計改變底物結(jié)合口袋處關(guān)鍵氨基酸殘基側(cè)鏈基團的大小

Pollegioni等[22]基于已有的RgDAAO晶體結(jié)構(gòu)和虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)M213位氨基酸殘基側(cè)鏈基團的大小顯著影響該酶對大位阻底物的催化活力。當M213 位側(cè)鏈基團較大的甲硫氨酸突變?yōu)檩^小的甘氨酸時，疏水性底物結(jié)合口袋的空間變大，突變體M213G對于D-1-萘基丙氨酸(4)和D-1-萘基甘氨酸(6)的催化效率相較于原始酶分別提高了8.4 倍和10.5倍。此外，對于結(jié)構(gòu)剛性較大的苯甘氨酸類衍生物(5)和(7)，該突變體的催化效率也有不同程度的提高[23]。

Asano 等[21]在pkDAAO 突變體R283G 的基礎(chǔ)之上，對與苯甲酸羧基相互作用的另一位點Y228 進行突變。其中，突變體Y228L/R283G 對(R)-9 的催化活力提高到了21.5U/mg。蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明在輔酶FAD 二甲苯環(huán)的旁邊產(chǎn)生了一個疏水口袋，從而有足夠的空間能夠容納(R)-9 的苯環(huán)。盡管底物特異性發(fā)生了改變，突變體Y228L/R283G依然通過α-質(zhì)子氫轉(zhuǎn)移機制來進行氧化脫氫反應(yīng)[24]。底物(R)-9 的Cα原子上的氫（α-質(zhì)子）更靠近輔酶FAD 的N(5)原子，而(S)-9 的α-質(zhì)子則朝向Y224，從而使得(R)-構(gòu)型底物的氧化脫氫反應(yīng)更容易進行。第一性原理計算結(jié)果表明，突變體Y228L/R283G 與(R)-9 的相互作用能比(S)-9 的相互作用能強達13kcal/mol（1kcal/mol=4.1840kJ/mol）。這些差異導致突變體Y228L/R283G 能夠特異性識別外消旋體中的(R)-構(gòu)型胺類化合物[25]。該課題組同時也發(fā)現(xiàn)pkDAAO 突變體Y228L/R283G 活性中心處F242 位氨基酸殘基側(cè)鏈基團的大小顯著影響該酶對較大位阻底物的催化活力，見表2。當該位點的苯丙氨酸突變?yōu)閭?cè)鏈基團較小的異亮氨酸時，活性中心處形成了更大的疏水口袋，突變體Y228L/R283G/F242I 對(R)-1-(2-萘基)-乙胺(10)的催化活力達4U/mg，催化效率相較于突變體Y228L/R283G 提高了0.6 倍[25]。雖然突變體Y228L/R283G 能夠催化氧化(R)-9 和(R)-10，但對于具有更大取代基的底物4-氯-二苯甲胺(11)卻沒有催化活力。Asano 等[26]根據(jù)已有的突變體Y228L/R283G晶體結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關(guān)系分析，推測活性中心處L51、I215和I230位氨基酸殘基可能在該酶催化大位阻底物氧化脫氫的反應(yīng)過程中起重要作用。因此，分別以突變體R283G 和Y228L/R283G 作為親本，對上述三個位點進行定點飽和突變。突變體I230A/R283G 對 rac-11 的催化效率最高（122.7mmol/L·min），并且具有嚴格(S)-對映體選擇性，見表2。

表2 DAAO底物特異性改造的代表性成果

續(xù)表2

由此可見，DAAO底物結(jié)合口袋的大小受關(guān)鍵氨基酸殘基側(cè)鏈基團空間位阻的影響。利用具有較小側(cè)鏈基團的氨基酸代替大位阻側(cè)鏈基團的氨基酸殘基，可以有效擴大底物結(jié)合口袋，增強酶與底物的相互作用，進而提高該類酶的催化活力。

2.1.3 基于理性設(shè)計改變底物結(jié)合口袋處氨基酸殘基的極性

到目前為止，TvDAAO的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)還未有報道。因此，通過同源建模獲得較為可靠的三維模型，考察酶與底物的相互作用，在此基礎(chǔ)上進行突變，可以獲得具有目標性能的突變體。

為進一步提高TvDAAO 對頭孢菌素C(8)的催化活力，Wong 等[27]基于底物8 與TvDAAO（同源模建）的分子對接結(jié)果，選取底物結(jié)合口袋處鄰近底物氨基的F54 位苯丙氨酸殘基作為定點突變位點。當疏水性苯丙氨酸殘基變?yōu)闃O性相對較大的酪氨酸殘基時，側(cè)鏈基團中的酚羥基與底物8的氨基形成了氫鍵，穩(wěn)定了底物在結(jié)合口袋處的構(gòu)象，突變體F54Y 對底物8 的催化效率相較于原始酶提高了1倍。

2.1.4 基于定向進化改變非底物結(jié)合口袋處的氨基酸殘基

理性設(shè)計主要基于酶與底物相互作用的氨基酸殘基而展開改造工作。此外，通過定向進化，可以發(fā)掘一些非活性中心處的氨基酸殘基對DAAO底物特異性的影響。

除上述疏水性底物結(jié)合口袋處的氨基酸殘基以外，Sacchi 等[28]通過易錯PCR 構(gòu)建了隨機突變體庫，結(jié)合過氧化物酶/鄰聯(lián)茴香胺介導的顯色法，進行高通量篩選。結(jié)果表明：位于RgDAAO 蛋白表面的L118，T60 以及Q144 位氨基酸殘基能夠顯著影響該酶的催化活力,見表2。例如，突變體L118H對底物3和1的催化效率分別是原始酶的1.9倍和2 倍。突變體T60A/Q144R/K152E 對1 的催化效率是原始酶的5.6倍。

2.2 D-氨基酸氧化酶熱穩(wěn)定性的分子改造

酶的熱穩(wěn)定性是影響生物催化反應(yīng)的重要因素。Bakke 等[29]通過易錯PCR 建立突變體庫，利用過氧化物酶/4-氨基安替比林介導的顯色反應(yīng)進行高通量篩選，獲得了熱穩(wěn)定性顯著提高的pkDAAO。55℃條件下孵育1h 后，突變體F42C 對(R)-3的殘余酶活達70%以上，而原始酶僅為10%。此外，2.1.3 節(jié)中通過理性設(shè)計獲得的突變體TvDAAO F54Y 不僅提高了該酶對底物8 的催化活力，而且也增強了熱穩(wěn)定性。55℃條件下保溫30min，突變體F54Y 對8 的殘余活力幾乎沒有影響，而原始酶卻喪失了40%。

3 D-氨基酸氧化酶在生物催化中的應(yīng)用

3.1 D-氨基酸氧化酶介導的兩步酶法催化合成7-氨基頭孢烷酸

7-氨基頭孢烷酸(14)是制備半合成頭孢菌素類抗生素的前體化合物。自20 世紀90 年代以來，以DAAO 和戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；笧樯锎呋瘎殉晒⒘藘刹矫阜ù呋D(zhuǎn)化頭孢菌素C(8)合成14 的生產(chǎn)工藝（見圖4），并進行了工業(yè)化生產(chǎn)[30]。在此過程中，DAAO催化8的D-α-氨基己二?；鶊F氧化脫氫生成α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸(12)，后者經(jīng)脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化成戊二酰-7-氨基頭孢烷酸(13)。最終，?；复呋?3進行脫?；磻?yīng)生成產(chǎn)物14[31-32]。

3.2 D-氨基酸氧化酶催化合成手性氨基酸和胺類化合物

手性氨基酸和胺類化合物是合成眾多醫(yī)藥、農(nóng)藥等高值化學品的前體化合物。例如，以(S)-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲酸(16)為底物，經(jīng)多步化學反應(yīng)，可合成一種靶向Keap1-Nrf2 相互作用的小分子抑制劑，從而有望用于癌癥、糖尿病等疾病的治療和預防[33]。(S)-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸(17)是降壓藥喹那普利的重要組成部分[34]，L-2-氨基丁酸(21)是抗癲癇藥物左乙拉西坦的前體化合物[35]。利用D-氨基酸氧化酶介導的去消旋化反應(yīng)制備該類化合物具有外消旋底物來源簡單、底物譜廣泛、反應(yīng)對映體選擇性高、反應(yīng)條件溫和等顯著特點。到目前為止，該方法主要有兩種反應(yīng)方式：①化學-酶法去消旋化；②多酶催化氧化還原級聯(lián)去消旋化。

圖4 兩步酶法合成7-氨基頭孢烷酸

3.2.1 化學-酶法去消旋化

DAAO 介導的化學-酶法去消旋化包含兩步反應(yīng)。①選擇性生物催化反應(yīng)：以外消旋氨基酸或胺為底物，利用氧化酶選擇性催化其中的一個構(gòu)型進行Cα-N 鍵氧化脫氫反應(yīng)生成亞胺，另一構(gòu)型保持不變。②非選擇性化學還原反應(yīng)：亞胺被非選擇性化學還原劑轉(zhuǎn)化為外消旋底物。兩步反應(yīng)在“一鍋”反應(yīng)體系中高效協(xié)同進行，見圖5。亞胺（特別是鏈狀亞胺）在水溶液中通常不穩(wěn)定，易水解開環(huán)生成醛（酮）和胺。因此，反應(yīng)需加入過量化學還原劑，如硼氫化鈉（NaBH4）[36]、氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）[37]、氨硼烷（NH3·BH3）[38]等，以確保亞胺能夠直接轉(zhuǎn)化為外消旋底物，盡可能避免副產(chǎn)物（如酮或醇）的生成。

Chen 等[39]利用硅藻土固定化的TvDAAO 和NH3·BH3（10個當量）進行去消旋化反應(yīng)，制備糖尿病藥物合成中間體(S)-α-氨基-6-(2-甲基苯)3-吡啶丙酸(15)，產(chǎn)率為68%，ee值＞99%。本文作者所在課題組[40]以來源于茄病鐮刀菌（Fusarium solani）M-0718 的FsDAAO 作為生物催化劑，構(gòu)建了“一鍋法”FsDAAO-NH3·BH3（4 個當量）去消旋化反應(yīng)體系，將外消旋四氫異喹啉羧酸類化合物轉(zhuǎn)化成了(S)-對映體，轉(zhuǎn)化率達98%以上，產(chǎn)率達82%，ee 值＞99%。Asano 等[21]利用pkDAAO Y228L/R283G 和NaBH4（20 個當量）進行去消旋化反應(yīng)，(R)-9完全轉(zhuǎn)化為(S)-對映體，產(chǎn)率為65%，ee值達99%。底物為rac-11 時，以pkDAAO I230A/R283G作為生物催化劑進行去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物(R)-11的產(chǎn)率為46%，ee值為96%[26]。

該方法通常只需要一種氧化還原酶參與反應(yīng)，并且所用化學還原劑來源簡單。不足之處在于反應(yīng)過程中通常需要加入過量的化學還原劑，不利于環(huán)境友好。反應(yīng)結(jié)束后，需要額外的分離純化步驟，用于除去剩余的化學還原劑，導致最終的產(chǎn)率有所下降。

3.2.2 多酶催化氧化還原級聯(lián)去消旋化

多酶催化氧化還原級聯(lián)去消旋化反應(yīng)是在上述D-氨基酸氧化酶介導的選擇性生物催化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用生物催化不對稱還原反應(yīng)來代替非選擇性化學還原反應(yīng)，從而將外消旋底物（通常為氨基酸及其衍生物）轉(zhuǎn)化成單一構(gòu)型的產(chǎn)物。當?shù)孜餅殒湢畎被釙r，其氧化脫氫產(chǎn)物亞胺酸通常不穩(wěn)定，易自發(fā)水解生成酮酸。后者可在氨基酸脫氫酶或者轉(zhuǎn)氨酶的催化下，進行不對稱還原胺化反應(yīng)，見圖6。

Findrik 等[41]利 用 ApDAAO 和 紅 球 菌 屬（Rhodococcus sp.） 來源的L-苯丙氨酸脫氫酶（L-PheDH） 進行生物催化級聯(lián)反應(yīng)，將D-甲硫氨酸(18)幾乎全部轉(zhuǎn)化成了L-甲硫氨酸。Chen等[39]以TvDAAO 和脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）來源的(S)-選擇性氨基酸脫氫酶（AADH）作為催化劑進行去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物(S)-15的最終分離產(chǎn)率為54%，ee 值＞99%。此外，該作者也利用伯克霍爾德菌（Burkholderia sp.）來源的(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶（TA）替代上述氨基酸脫氫酶，進行“一鍋法”去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物(S)-15 的產(chǎn)率達73%，ee值＞99%。Qi 等[42]以外消旋氨基酸為底物，利用TvDAAO 與谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）來源的亮氨酸酸脫氫酶（CgLeuDH）進行“一鍋法”去消旋化反應(yīng)，制備L-氨基酸。通過批次補料，反應(yīng)體系中產(chǎn)物L-正纈氨酸(19)的濃度達54.09g/L，轉(zhuǎn)化率＞96%，ee 值＞99%。Green等[43]利用RgDAAO和大腸桿菌來源轉(zhuǎn)氨酶EcgabT進行去消旋化反應(yīng)，將DL-草銨膦(20)轉(zhuǎn)化成了L-草銨膦，轉(zhuǎn)化率達85%，ee 值＞99%。Seo 等[44]在兩相體系中，利用表達VHb-RgDAAO 融合蛋白的全細胞與表達河流孤菌（Vibrio fluvialis）來源ω-轉(zhuǎn)氨酶（VfTA）的全細胞進行“一鍋法”去消旋化反應(yīng)，將底物rac-21 （500mmol/L）轉(zhuǎn)化成了(S)-21，轉(zhuǎn)化率達97%，ee 值＞99%。Liu 等[45]以基因組上攜帶有TvDAAO 和L-PheDH 基因的釀酒酵母作為宿主細胞，將前體化合物DL-甲硫氨酸經(jīng)L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成了S-腺苷-L-甲硫氨酸，產(chǎn)物積累量達10.3g/L。

不同于上述鏈狀亞胺酸，環(huán)狀亞胺酸在水溶液中較為穩(wěn)定，可被(S)-選擇性還原酶直接轉(zhuǎn)化為(S)-構(gòu)型環(huán)狀氨基酸，見圖7。例如，Yasuda 等[46]以外消旋哌啶酸(22)為底物，利用pkDAAO 與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 來源的還原酶PpDpkA 進行去消旋化反應(yīng)，產(chǎn)物為(S)-22，轉(zhuǎn)化率和ee 值均＞99%。本文作者課題組[47]基于反應(yīng)可行性及兼容性評估，成功耦合FsDAAO催化的對映體選擇性氧化脫氫反應(yīng)和PpDpkA介導的不對稱還原反應(yīng)，構(gòu)建了“一鍋法”多酶級聯(lián)去消旋化反應(yīng)體系，將底物rac-16轉(zhuǎn)化成了(S)-對映體，產(chǎn)率為89%，ee值＞99%。相較于化學-酶法去消旋化反應(yīng)，該反應(yīng)體系中的亞胺酸被直接轉(zhuǎn)化成了目標手性化合物，從而使得整個去消旋化反應(yīng)效率更高，并且反應(yīng)結(jié)束后，分離純化步驟簡單，產(chǎn)物的收率更高。不足之處在于具有相反對映體選擇性的氧化還原酶篩選困難，需要優(yōu)化獲得合適的反應(yīng)條件，以確保整個去消旋化反應(yīng)高效協(xié)同進行。

3.3 D-氨基酸氧化酶催化合成α-酮酸

圖7 DAAO介導的多酶催化級聯(lián)去消旋化制備手性環(huán)狀氨基酸

作為一種重要的化工原料，α-酮酸綠色高效的合成方法是近年來的熱點研究內(nèi)容之一。DAAO催化D-氨基酸氧化脫氫是合成相應(yīng)α-酮酸的重要途徑。例如，Orrego 等[48]以外消旋氨基酸為底物，利用霍亂弧菌（Vibrio cholera）來源的氨基酸消旋酶BsrV 將L-氨基酸轉(zhuǎn)化成D-氨基酸，后者經(jīng)TvDAAO 催化生成α-酮酸(23～25)，轉(zhuǎn)化率＞99%，見圖8。該方法的優(yōu)勢在于反應(yīng)效率高，環(huán)境友好，并且避免了使用價格昂貴的D-氨基酸作為原料。然而，相較于L-氨基酸氧化酶或氨基酸脫氨酶催化的“一步法”合成α-酮酸[49-52]，該三酶體系仍然較為復雜。

圖8 DAAO催化合成α-酮酸

4 結(jié)語

DAAO作為一種重要的生物催化劑，已成功用于制備7-氨基頭孢烷酸、手性氨基酸和胺類化合物等過程?；钚灾行奶幣c底物相互作用的氨基酸殘基主要與底物的正確定向有關(guān)。目前DAAO的分子改造工作也主要基于該處關(guān)鍵氨基酸殘基的突變而展開，相關(guān)成果加深了該酶構(gòu)效關(guān)系的理解。然而，到目前為止，能夠滿足生物合成需求的DAAO種類仍然相對較少，底物范圍主要集中于頭孢菌素C 和結(jié)構(gòu)較為簡單的D-氨基酸及其衍生物。后續(xù)的研究工作或許可以從以下三方面展開。

（1）挖掘具有不同底物特異性的DAAO，解析蛋白結(jié)構(gòu)，結(jié)合計算化學闡明其對映體選擇性及底物識別的分子機制。

（2）基于理性設(shè)計，對該類酶進行分子改造，以期獲得能夠催化不同非天然底物的突變體。此外，目前可用于生物催化過程的L-氨基酸氧化酶仍然稀少，如能翻轉(zhuǎn)現(xiàn)有DAAO 的對映體選擇性，使其能夠催化氧化L-氨基酸及其衍生物，必將擴大該類酶的應(yīng)用范圍。

（3）設(shè)計新穎的化學-酶或多酶耦合催化體系，以挖掘或改造獲得的DAAO作為催化劑，從而實現(xiàn)功能化學品生物催化合成新途徑的構(gòu)建。