劉衛(wèi)兵，葉邦策

（華東理工大學微分析與生物系統(tǒng)工程實驗室，生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237）

聚酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物的總稱，也是次級代謝產(chǎn)物中最大的一類。聚酮化合物種類廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)的聚酮化合物超過10000種，由其衍生出的新化合物更是不計其數(shù)[1-2]。迄今已發(fā)現(xiàn)多種生物能合成聚酮化合物。如細菌（糖多孢紅霉菌合成紅霉素，erythromycin；金色鏈霉菌合成四環(huán)素，tetracycline）[3]、真菌（茄褐紋菌合成洛伐他汀，lovastatin）[4]、植物（大黃合成大黃素，emodin）[5]、昆蟲（來自藥材甲的雌性信息素，stegobinone）[6]等。其中，微生物生物合成是其主要來源途徑，微生物可以通過不同的生物合成途徑生成不同用途的藥物，包括抗生素（如通過糖多孢紅霉菌代謝合成紅霉素，erythromycin A）；抗真菌藥物（如通過結(jié)節(jié)鏈霉菌合成兩性霉素B，amphotericin B）；抗寄生蟲藥物（如通過阿維鏈霉菌代謝合成阿維菌素，avermectins）；殺蟲劑（如多刺甘蔗多孢菌代謝合成多殺菌素，spinosyn A）；免疫抑制劑（如吸水鏈霉菌合成雷帕霉素，rapamycin）及抗癌藥物（如利用天藍淡紅鏈霉菌合成多柔比星，doxorubicin）等[7-13]。目前，全球約有70%的抗生素是由微生物制造，其中使用最多的是放線菌，約占所有微生物的2/3[14]。

聚酮化合物具有廣泛的用途，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，每年聚酮來源的藥物銷售額超過200 億美元[15]。由于其在醫(yī)藥、健康等方面的巨大經(jīng)濟價值及應(yīng)用前景，吸引了大量科學家的關(guān)注。隨著合成生物學的發(fā)展及綠色制造的興起，越來越多的研究人員對聚酮化合物進行深入研究，包括其代謝通路、合成途徑、前體供應(yīng)、底盤細胞優(yōu)化、異源表達等，以期通過合成生物學的新技術(shù)不斷改造和優(yōu)化聚酮化學物的合成，同時利用綠色制造的理念，開發(fā)聚酮化合物生物合成的新思路。如Cheng 等[16]對正交檸檬烯生物合成（orthogonal limonene biosynthetic，OLB）途徑進行了改造，用以高效生產(chǎn)檸檬烯，從而使檸檬烯生物合成比傳統(tǒng)途徑提升6倍，在補料分批發(fā)酵中可達917.7mg/L，是目前已知的最高產(chǎn)量。洛伐他?。╨ovastatin）也是一種重要的聚酮類化合物，主要由土曲霉合成并被廣泛用作降血脂的藥物。包括洛伐他汀在內(nèi)的他汀類藥物占到降血脂藥物市場總額的80%以上。Itoh 等[17]通過對土曲霉ATCC20542 的代謝途徑進行改造，敲除其中甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白和分裂激活蛋白可將洛伐他汀產(chǎn)量提高2.6倍和5.1倍。紅霉素是一種典型的聚酮類化合物，也是醫(yī)藥和畜牧業(yè)中常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，本文作者課題組[18-22]通過翻譯后修飾代謝工程策略對紅霉素工業(yè)高產(chǎn)菌進行代謝及調(diào)控通路改造，實現(xiàn)其產(chǎn)量翻倍（下文將詳細介紹）。阿維菌素是知名的聚酮類大宗化學品，Wang等[23]通過改造阿維菌素合成途徑中碳代謝流的策略使阿維菌素B1a 的工業(yè)生產(chǎn)效價達到史無前例的9.31g/L（詳見下文介紹）。

聚酮化合物的生物合成途徑中通常有多種酶系參與，其中，聚酮合酶直接參與聚酮化合物的合成過程；同時，在底盤細胞營養(yǎng)代謝與前體合成中也有大量不同類型的酶參與。此外，底盤細胞的營養(yǎng)代謝不僅涉及細胞本身的營養(yǎng)利用與生存，同時也關(guān)系到次級代謝產(chǎn)物合成時前體的供應(yīng)。針對聚酮化合物生物合成途徑中酶的調(diào)控與工程化改造能進一步優(yōu)化聚酮化合物的生物合成網(wǎng)絡(luò)。聚酮化合物的合成是以?；o酶A為起始單元和延伸單元，同時，?；o酶A 也是翻譯后修飾中酰基化的供體。因此，酰基化等翻譯后修飾不僅影響?；o酶A的代謝流，而且也會影響聚酮化合物合成中一系列酶的活性及功能。近年來，CRISPR 技術(shù)的應(yīng)用為代謝途徑改造提供了便利的平臺，被大量用于聚酮化合物合成途徑的改造。此外，聚酮化合物代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化、異源合成等都是聚酮化合物生物合成中廣泛采用的策略，本文將針對以上幾個方面，結(jié)合國內(nèi)外最新研究成果，介紹當前聚酮化合物生物合成的研究進展。

1 放線菌聚酮類化合物的合成途徑

1.1 聚酮化合物與聚酮合酶

聚酮類化合物作為具有重要價值的生物活性物質(zhì)，其生物合成機制早期是由Birch 等[24]于1953 年提出的類似于脂肪酸生物合成的乙酰基合成途徑假說，而且得到了眾多實驗室通過同位素標記方法的證實。此后，1990 年，Cortes 等[25]對紅霉素的生物合成研究顯示其合成基因在染色體上是成簇排列的，這一發(fā)現(xiàn)成為聚酮類化合物生物合成的里程碑，在此基礎(chǔ)上，越來越多的聚酮類化合物生物合成基因簇被克隆。在聚酮化合物的合成中，聚酮合酶發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，其催化機制與脂肪酸合成中脂肪酸合酶的催化機制類似，即通過酰基輔酶A 活化的底物進行重復脫羧而成[26-27]。聚酮類化合物生物合成酶根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的組織形式可以分為三類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型聚酮合酶（polyketide synthases，PKSs）。其中，研究最清楚的是1990 年發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型PKS[28-29]，它由多個具有不同功能的多肽組成。每一個多肽含有不同的結(jié)構(gòu)域，它們分別參與聚酮鏈延伸時的單個生化反應(yīng)。Ⅰ型PKS催化生成的聚酮化合物包括紅霉素（erythromycin）、阿維菌素（avermectins）、利福霉素（rifamycin）、雷帕霉素（rapamycin）、洛伐他?。╨ovastatin）及埃博霉素（epothilone）等。與Ⅰ型PKS 不同，Ⅱ型PKS 被稱為迭代類（interative）PKS，其包含一套可重復多次催化相同反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域，此類PKS 是1984年首次在細菌中被報道[30-31]。Ⅱ型PKS催化生成的聚酮化合物包括富倫菌素（frenolicin）、放線紫紅素（actinorhodin）、多柔比星（doxorubicin）等。此外Ⅲ型PKS是在1999年被發(fā)現(xiàn)[32]，Ⅲ型PKS是同型二聚體酶，具有兩個同源的亞基，但是相比其他兩型PKS，Ⅲ型酶結(jié)構(gòu)更簡單，而且它不依賴于乙酰磷酸，其他兩類PKS常通過乙酰磷酸活化?；o酶A底物。Ⅲ型PKS主要催化芳香類聚酮化合物的生物合成，例如淡黃霉素（flaviolin）。除了結(jié)構(gòu)和功能的差異，在遺傳進化上，Ⅲ型PKS與其他兩類PKS及FAS（脂肪酸合酶）的距離也較遠。

通常絕大多數(shù)聚酮化合物都是由PKS催化，如紅霉素的母體大環(huán)內(nèi)酯糖苷配基是6-脫氧紅霉內(nèi)酯B（6-dEB），由一個起始單元丙酰輔酶A和六個甲基丙二酰輔酶A延伸單元經(jīng)六個縮合步驟縮合而成[25,29]。阿維菌素生物合成的起始單元是異丁酰輔酶A（來自纈氨酸）或2-甲基丁酰輔酶A（來自異亮氨酸），而延伸單元是七個丙二酰輔酶A（用于乙酸酯單元）和五個甲基丙二酰輔酶As（用于丙酸單位）[33]。以上兩種抗生素都是由Ⅰ型PKS 催化，Ⅱ型PKS催化的多柔比星是由丙酰輔酶A為起始單元，九個丙二酰輔酶A 為延伸單元縮合而成的[34]。大多數(shù)Ⅲ型PKS催化的聚酮化合物是以丙二酰輔酶A作為起始單元和延伸單元[35]（見圖1）。不同的聚酮化合物在結(jié)構(gòu)上具有豐富的多樣性，其中一個原因是合成過程中采用了不同的?；o酶A作為起始單元和延伸單元[36]。因此，作為聚酮合成前體的?；o酶A 的供給對于其生物合成是至關(guān)重要的。

1.2 聚酮類化合物生物合成的前體供應(yīng)及優(yōu)化

圖1 三類PKS催化的代表性反應(yīng)

聚酮化合物的生物合成過程中，?；o酶A是關(guān)鍵的前體物質(zhì)，也是必要的延伸單元。其中，丙二酰輔酶A是重要的中心代謝產(chǎn)物，是微生物合成許多可藥用的聚酮化合物以及包括生物燃料在內(nèi)的脂肪酸衍生化合物的基本組成部分[37]。胞內(nèi)產(chǎn)生的丙二酰輔酶A會被優(yōu)先用于脂肪酸的合成而不是其他衍生物，這會導致胞內(nèi)合成聚酮化合物等次級代謝產(chǎn)物的前體不足，從而限制聚酮化合物的生物合成[38-40]。因此，抑制脂肪酸的合成通路，有利于增加丙二酰輔酶A對聚酮類化合物合成的供給[41-44]。

隨著合成生物學的發(fā)展，挑選合適的底盤宿主進行聚酮化合物等生物活性物質(zhì)的異源合成已被普遍使用[45]。近年來，特別是釀酒酵母、大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌已被工程化改造以部分替代放線菌用于聚酮化合物的生物合成。然而，發(fā)達的菌株和工藝通常有生產(chǎn)率不足的困擾。通常，細胞內(nèi)被嚴格調(diào)控的丙二酰輔酶A的可用性被認為是限制整體產(chǎn)品合成的決定性瓶頸。因此，為改善丙二酰輔酶A的利用率而進行的代謝工程改造對于設(shè)計高效的微生物細胞工廠以生產(chǎn)聚酮化合物至關(guān)重要[46]（見圖2）。

在大多數(shù)有機體中，丙二酰輔酶A是由乙酰輔酶A 羧化酶催化的乙酰輔酶A 羧化作用專一性合成。增加乙酰輔酶A的供給對于改善丙二酰輔酶A用于聚酮化合物合成的可用性是非常關(guān)鍵的。通常，調(diào)整中心碳代謝以使乙酰輔酶A作為直接的丙二酰輔酶A前體分子增加可用性，對于丙二酰輔酶A 合成和所有丙二酰輔酶A 衍生的產(chǎn)品都是有益的。如通過部分消除丙酮酸的羧化作用將糖酵解的代謝流集中于乙酰輔酶A，有助于促進在谷氨酸棒桿菌中合成丙二酰輔酶A 依賴的去甲丁香色原酮（一種藥用植物蘆薈中的五肽）[47]。谷氨酸棒桿菌中解除對iolT1 的表達限制，可以改善葡萄糖的吸收，提高?；o酶A的代謝池，進而增加聚酮化合物和羥基苯甲酸的合成[48-49]。

酰基輔酶A不僅作為起始單元和延伸單元參與聚酮化合物的合成，同時，在翻譯后修飾中，酰基輔酶A也是?；闹饕w，參與聚酮化合物合成通路的翻譯后修飾調(diào)控前體的供應(yīng)。丙酰輔酶A是紅霉素合成的直接前體，在紅霉素生物合成過程中，一方面，丙酰輔酶A的積累有益于紅霉素生物合成，另一方面，丙酰輔酶A 作為丙酰化的供體，其積累也有利于丙酰化的發(fā)生，但賴氨酸丙酰化會抑制紅霉素生物合成途徑中重要酶的活動。研究顯示，NAD+依賴性的去?；傅某磉_可以規(guī)避高酰基輔酶A濃度的抑制作用。在其他酰基輔酶A衍生天然產(chǎn)物的生物合成中也存在類似的賴氨酸?；瘷C制，如丙二酰輔酶A來源的生物堿和丁酰輔酶A來源的生物酒精等[50]。此外，為了提高紅霉素合成前體（丙酰輔酶A）的供應(yīng)，研究顯示，還可以通過敲除丙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶基因acuA 和過表達SACE_1780 來繞過由丙酰化引起的反饋抑制作用，并使紅霉素的產(chǎn)量提高22%[51]。這些改造不僅改善了前體供應(yīng)以提高紅霉素的產(chǎn)量，同時也為合成生物學提供了有效的翻譯后修飾代謝工程學策略（PTM-ME），以改善次級代謝產(chǎn)物（見圖3）。

圖2 不同微生物合成的丙二酰輔酶A衍生產(chǎn)物

1.3 聚酮類化合物合成代謝途徑改造

對聚酮類化合物代謝途徑的改造主要包括聚酮生物合成相關(guān)基因簇的工程化改造、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)改造及合成途徑改造等。在基因工程改造方面，可以通過對目標產(chǎn)物生物合成代謝旁路的相關(guān)基因的精簡、優(yōu)化，從而減少底物的消耗，強化目標產(chǎn)物的生物合成，提高其產(chǎn)量。如在新型的鏈霉菌底盤細胞FR-008 中，通過選擇合適的元件即可高效地表達聚酮化合物[52]。又如在納他霉素的產(chǎn)生菌Streptomyces chattanoogensis L10 中通過敲除1.3Mb和0.7Mb 的非必需基因后得到的底盤細胞能明顯提高聚酮天然產(chǎn)物的合成效率[53]。隨著CRISPR 技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用，基因工程操作更加便捷和精準，這也使得CRISPR 技術(shù)被越來越多的合成生物學研究人員所關(guān)注，并被大量用于鏈霉菌的基因工程改造[54]。鏈霉菌作為天然產(chǎn)物合成的底盤細胞具有酵母、大腸桿菌或其他微生物所不具有的諸多優(yōu)點，CRISPR 等新技術(shù)的應(yīng)用，更使這些優(yōu)點得以充分發(fā)揮[55]。近年來，CRISPR-Cas9 作為“經(jīng)典”的CRISPR 系統(tǒng)，被廣泛用于鏈霉菌基因編輯。如通過CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在基因組中插入啟動子激活PKS、NRPS 等基因簇用以在多個鏈霉菌中合成新的產(chǎn)物[56]。在糖多孢紅霉菌中，使用CRISPR-Cas9敲入啟動子Pj23119-PkasO替換基因組上原生啟動子用以激活紅霉素的合成，能使得紅霉素的產(chǎn)量提高58.3%[57-58]。隨著CRISPR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的CRISPR 系統(tǒng)被開發(fā)出來用于鏈霉菌的代謝工程改造。Tong 等[59]開發(fā)了一套綜合的CRISPR 工具包，其中包括CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的多種變體，以及用于鏈霉菌的CRISPRi 和基于CRISPR 的編輯系 統(tǒng)（CRISPR-base editing systems， CRISPRBEST）。這些CRISPR 工具可用于生成隨機大小的缺失文庫，引入小插入或缺失，生成特定靶基因的框內(nèi)缺失，可逆地抑制基因轉(zhuǎn)錄以及替代鏈霉菌基因組中的單堿基對等。此外，該工具包還包含基于Csy4 的多路復用選項，可在單個實驗中引入多個編輯內(nèi)容。通過使用該工具包，可以將鏈霉菌中失活靶基因的時間縮短到10 天以內(nèi)，比其他可選方案要快得多。此外，Cobb 等[60]基于CRISPR-Cas 平臺建立的pCRISPomyces 技術(shù)也能對多種鏈霉菌進行高效的基因編輯，快速獲得20bp～30kb等長度不等的基因缺失。

聚酮生物合成相關(guān)基因簇的工程化改造中，大片段的克隆一直是一個難點。然而，大多數(shù)聚酮合酶的基因簇約為70～80kb，如何克隆這些大片段是對其進行工程化改造，特別是異源表達的關(guān)鍵。最近，Liang 等[61]結(jié)合CRISPR-Cas12a 剪切和細菌人工 染 色 體（bacterial artificial chromosome，BAC）文庫構(gòu)建的優(yōu)勢開發(fā)了一種簡單、快速和高效的基因簇克隆方法（CAT-FISHING），即CRISPRCas12a 介導的快速直接生物合成基因簇克隆，可以直接克隆49～139kb 的基因簇。經(jīng)過進一步優(yōu)化后，該方法能夠在鏈霉菌底盤中以較低的時間成本有效地克隆并表達87kb 長、富含GC（76%）的生物合成基因簇。

圖3 ?；o酶A前體供應(yīng)與?；w對?；o酶A合成天然產(chǎn)物的功能相互作用［50］

聚酮化合物合成基因簇的表達，受到諸多調(diào)控因子的嚴謹控制，因此，對各類調(diào)控因子的改造也是眾多研究人員關(guān)注的重點之一，同時也是聚酮化合物代謝網(wǎng)絡(luò)改造的常見策略。微生物具有復雜精密的初級和次級代謝網(wǎng)絡(luò)，這其中，各種調(diào)控因子發(fā)揮著四兩撥千斤的作用，其受到修飾、改造及調(diào)控時，會直接或間接影響相關(guān)的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些調(diào)控因子有些能控制全局，有些只參與特定的專一途徑的調(diào)控。因此，對這些調(diào)控因子進行改造或修飾，可以實現(xiàn)微生物次級代謝網(wǎng)絡(luò)的精細化調(diào)控。如通過對Streptomyces albus J1074 中調(diào)控因子CRP 的過表達，及基因pfk 的缺失突變等操作，可以實現(xiàn)放線紫紅素的異源表達[62]。微生物的營養(yǎng)吸收與利用對初級代謝和次級代謝都至關(guān)重要，不僅關(guān)系底盤細胞的生長，還是次級代謝前體物資的重要來源。在碳、氮、磷等營養(yǎng)素代謝過程中，有多重調(diào)控因子參與其中。如DasR 作為鏈霉菌中的多效調(diào)控因子，能在多種鏈霉菌中調(diào)控N-乙酰氨基糖、檸檬酸鹽等的利用，從而影響鏈霉菌的初級及次級代謝[63-65]。氮代謝全局調(diào)控因子GlnR不僅調(diào)控鏈霉菌的氮源代謝，同時也參與碳源的代謝。如在糖多孢紅霉菌中，GlnR 不僅調(diào)控作為聚酮合成前體的?；o酶A的代謝，同時也能調(diào)控作為紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)的底物淀粉的代謝[65-70]。鏈霉菌中磷源代謝受雙組分調(diào)控因子PhoR-PhoP 的控制，同時還參與呼吸作用、細胞分化和抗生素的生物合成調(diào)控及與其他營養(yǎng)素的協(xié)同調(diào)控。在糖多孢紅霉菌中，PhoP 在轉(zhuǎn)錄水平上可以通過直接和間接兩種方式控制紅霉素生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在翻譯后修飾水平上，PhoP 的活性受到賴氨酸丙酰化調(diào)控[18,68,71]。在天藍色鏈霉菌中，PhoP 抑制了幾種分化和多效性調(diào)控基因，這影響了菌體生長并間接影響了抗生素的生物合成。在阿維鏈霉菌中也存在類似的調(diào)控機制[72-73]。此外，GlnR 和PhoP 也可以協(xié)同調(diào)控氮、磷的代謝，從而影響鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的合成[67-68]（見圖4）。

圖4 GlnR和PhoP介導的糖多孢紅霉菌中初級代謝與紅霉素生物合成之間的交叉調(diào)控

除了產(chǎn)物合成相關(guān)基因的工程化改造以及調(diào)控因子的改造外，通過對聚酮化合物的傳統(tǒng)合成途徑進行改造，以減少能源消耗，提高經(jīng)濟效率，是當前綠色生物制造的發(fā)展趨勢。在傳統(tǒng)的聚酮合成途徑中，乙酰輔酶A是連接糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸合成的主要代謝節(jié)點。當前大多數(shù)的聚酮化合物生產(chǎn)平臺都依靠漫長的糖酵解步驟來提供乙酰輔酶A，這一過程需要消耗大量輔酶和ATP，同時天然受到復雜的調(diào)控影響。通過探索使用乙酸代謝提供乙酰輔酶A可以作為乙酰輔酶A供給的捷徑，從而規(guī)避傳統(tǒng)糖酵解途徑的缺點，相關(guān)策略已應(yīng)用在聚酮化合物三乙酸內(nèi)酯（triacetic acid lactone,TAL）的合成中[74]。三乙酸內(nèi)酯是聚酮合酶合成的典型副產(chǎn)物，同時也是很多聚酮化合物合成的前體[75]。目前，已經(jīng)有諸多代謝工程研究人員用大腸桿菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母等建立了許多產(chǎn)TAL 的宿主菌株[74-78]。其中，Liu等[74]通過改造解脂耶氏酵母中乙酸鹽的吸收途徑，用于高效生產(chǎn)TAL，同時便捷獲得乙酰輔酶A用于聚酮化合物的高效、經(jīng)濟性的生物合成。通過此乙酰輔酶A代謝捷徑的碳通量超過了天然糖酵解途徑提供的碳通量。與葡萄糖相比，這種替代性碳源具有代謝優(yōu)勢，可釋放內(nèi)源性代謝途徑的限制從而提高碳的轉(zhuǎn)化效率和降低成本效益（見圖5）。

在自然界中發(fā)現(xiàn)的聚酮類化合物是在聚酮合成酶（PKSs） 催化下，通過克萊森縮合反應(yīng)（Claisen condensation）進行迭代脫羧合成的骨架。這一傳統(tǒng)的代謝途徑依賴于PKSs 的催化。然而，PKSs 存在復雜的結(jié)構(gòu)、能源效率低下、復雜的調(diào)控以及與延伸單位丙二酰輔酶A 的必要代謝途徑的競爭等缺點，這些因素會限制聚酮類生物合成的通量。Tan 等[79]在傳統(tǒng)的PKS 催化途徑之外，開發(fā)了一條新的依賴聚酮酰輔酶A 硫醚酶（PKTs）的代謝途徑來催化聚酮類主鏈的形成，這一過程通過迭代非脫羧克萊森縮合反應(yīng)來實現(xiàn)，因此提供了一種綜合和高效的PKSs 替代方案（見圖6）。并已實際用于具有代表性的內(nèi)酯、烷基間苯二酚酸、烷基間苯二酚、羥基苯甲酸和烷基酚聚酮族的聚酮骨架的合成。PKT 催化的反應(yīng)提供了一種聚酮合成的新途徑，這一途徑利用硫醚酶的簡單結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)更高的ATP 效率，并減少與基本代謝途徑的競爭，所有這些都規(guī)避了PKSs 合成聚酮產(chǎn)物的低效率等缺點。

圖5 解脂耶氏酵母TAL合成代謝途徑

圖6 聚酮生物合成中PKS途徑與PKT途徑的比較

2 放線菌聚酮類化合物合成的應(yīng)用

聚酮類化合物數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)多樣、活性豐富，是新藥開發(fā)的重要前體。在聚酮化合物生物合成的多種底盤細胞中，放線菌具有多種不同的系統(tǒng)，可以用于合成不同結(jié)構(gòu)和功能的聚酮化合物[80]。隨著合成生物學的興起和應(yīng)用，在傳統(tǒng)聚酮化合物合成機理的基礎(chǔ)上，充分運用合成生物學系統(tǒng)化設(shè)計和工程化構(gòu)建的策略，對聚酮化合物的合成途徑進行改造在眾多聚酮化合物的合成中取得了成功。如針對底盤細胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化、代謝流的改造以及聚酮合成基因簇的異源表達等在紅霉素、阿維菌素及多殺菌素的生物合成中的應(yīng)用，使得相關(guān)聚酮化合物的產(chǎn)量得到了突破性的提升。

2.1 紅霉素的生物合成研究進展

紅霉素及其衍生物在臨床治療及畜牧業(yè)中應(yīng)用廣泛，目前有大量研究工作以提高糖多孢紅霉菌的紅霉素產(chǎn)量，并且糖多孢紅霉菌已作為一個抗生素生產(chǎn)系統(tǒng)模型被廣泛研究[81]。在紅霉素生物合成過程中，改善前體供應(yīng)[51]、改造糖多孢紅霉菌的次級代謝通路[57]、優(yōu)化紅霉素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[18,66,71,82]是常見的幾種提高紅霉素產(chǎn)量的策略。在紅霉素生物合成中，丙酰輔酶A是其直接前體，同時也是丙?；孽；w。丙酰輔酶A的過量供應(yīng)會引起超丙?；?，這被證明對糖多孢紅霉菌中紅霉素的合成有害[18,50-51,83]。紅霉素的高效生物合成需要作為前體的丙二酰輔酶A的充足供應(yīng)，但是過量的?；o酶A 激活代謝酶的?；瑥亩答佉种飘a(chǎn)物的合成。Xu 等[18]使用酰基化修飾組學技術(shù)結(jié)合生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)?；o酶A濃度與蛋白質(zhì)酰基化水平及紅霉素產(chǎn)量之間的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，通過酰基化組學與酶學分析，研究人員揭示了丙?；怯绊懠t霉素合成的關(guān)鍵因素，并提出了阻礙丙?；皟?yōu)化PhoP 介導的磷源與碳源協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而對?；该撁粢韵；瘜t霉素合成的抑制作用。通過PTM-ME 策略實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)用糖多孢紅霉菌中紅霉素的產(chǎn)量翻倍[18-22]（見圖7）。

2.2 阿維菌素的生物合成研究進展

阿維菌素作為制藥公司的大宗商品，年銷售額達10 億美元，其生物合成主要通過阿維鏈霉菌在發(fā)酵生長的穩(wěn)定期作為次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。阿維菌素的合成前體主要是丙二酰輔酶A，其主要是通過乙酰輔酶A和丙酰輔酶A羧化產(chǎn)生。其中?；o酶A 羧化酶（ACCases）起到了關(guān)鍵的作用，通過對ACCases 的調(diào)控，能影響阿維菌素合成的前體供應(yīng)。研究人員發(fā)現(xiàn)阿維鏈霉菌AccR 能結(jié)合并抑制accD1A1-hmgL-fadE4 操縱子進而抑制胞內(nèi)乙酰輔酶A和丙酰輔酶A的同化。而甲基巴豆酰-、丙酰-和乙酰輔酶A 能充當效應(yīng)子，將AccR 從其靶DNA釋放，從而通過去阻遏作用增強靶基因的轉(zhuǎn)錄，提高前體供應(yīng)。甲基巴豆酰-和丙酰輔酶A對AccR的親和力強于乙酰輔酶A。敲除accR能使短鏈?；o酶A（乙酰-、丙酰-、丙二酰-和甲基丙二酰輔酶A）的濃度增加，從而使阿維菌素產(chǎn)量增加14.5%[84]。在微生物的初級代謝和次級代謝中都存在碳代謝阻遏現(xiàn)象。Lu 等[85]的研究顯示，ROK 家族調(diào)控因子Rok7B7 直接控制阿維鏈霉菌中碳分解代謝物的阻遏、抗生素的生物合成和形態(tài)發(fā)育，通過敲除Rok7B7 解除碳代謝阻遏，可以增加阿維菌素的產(chǎn)量。與改造前體供應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不同，Wang 等[23]采用重構(gòu)阿維菌素合成通路中的碳代謝流的策略來提高阿維菌素的產(chǎn)量。首先通過多組學技術(shù)揭示了在初級代謝過程中積累的細胞內(nèi)三?；视停═AGs）在穩(wěn)定期被降解。這個過程中將碳流量從細胞內(nèi)TAG 和細胞外底物引導到聚酮化合物的生物合成中。他們設(shè)計了一種名為“TAG 的動態(tài)降解”（ddTAG）的策略，以調(diào)動TAG 池并增加聚酮化合物的生物合成。使用ddTAG，提高了天藍色鏈霉菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、龜裂鏈霉菌和阿維鏈霉菌中放線紫素、杰多霉素B、土霉素和阿維菌素B1a 的滴度。將ddTAG 策略應(yīng)用在180m3工業(yè)規(guī)模發(fā)酵中將阿維菌素B1a 的效價提高了50%，達到9.31g/L，這是有史以來最高的效價（見圖8）。

2.3 多殺菌素的生物合成研究進展

多殺菌素是具有重大商業(yè)價值的廣譜殺蟲劑之一，是由刺糖多孢菌合成的一組大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑。盡管刺糖多孢菌可用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)多殺菌素，但是卻具有諸多缺點，包括生長周期長、發(fā)酵生物量低和淀粉利用效率低等。為了克服這些缺點，通過合成生物學的手段進行多殺菌素異源表達合成具有重要的意義。Zhao等[86]通過BAC載體將完整的多殺菌素合成基因簇（74kb）以及結(jié)合轉(zhuǎn)移和位點特異性整合所需的元件引入不同的鏈霉菌宿主中用以構(gòu)建多殺菌素的異源生產(chǎn)菌株。使用這種方法構(gòu)建的天藍色鏈霉菌和淡紫色鏈霉菌異源合成菌株，多殺菌素的產(chǎn)量可分別達到1μg/mL和1.5μg/mL[86]。此外，基于多組學分析的異源表達改造可以使異源表達突變株的構(gòu)建更高效且具有針對性，Tan 等[87]使用多組學方法指導鏈霉菌內(nèi)多殺菌素異源表達的代謝途徑優(yōu)化，使多殺菌素的產(chǎn)量比原始菌株提高了1000 倍。這些研究提供了通過異源宿主中的遺傳操作生產(chǎn)多殺菌素及其類似物的潛在替代途徑，也為聚酮化合物綠色制造提供了可選的策略。

圖7 PTM-ME應(yīng)用促進紅霉素的高效合成

圖8 ddTAG策略在阿維菌素B1a生物制造中的應(yīng)用

3 結(jié)語及展望

聚酮化合物應(yīng)用廣泛，其工業(yè)化生產(chǎn)主要利用微生物特別是放線菌發(fā)酵。隨著合成生物學的蓬勃發(fā)展，全球的研究人員以產(chǎn)物為導向，圍繞微生物底盤細胞進行全方位的改造與優(yōu)化，不僅涉及前體供應(yīng)、底物利用、代謝途徑改造、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化，還涉及目標產(chǎn)物的異源表達與合成等。在這些方面的努力已經(jīng)取得了一定的成績，但是依然有眾多瓶頸亟待解決。

首先，如何更好地平衡初級代謝與次級代謝，最大化地利用底物和前體合成目標產(chǎn)物依然是亟待解決的問題。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有很多研究人員采用阻斷競爭旁路、強化前體利用的代謝途徑來提高前體的利用效率，但是如何智能、精準地找到初級代謝和次級代謝的平衡點，使前期初級代謝進行細胞富集與后期次級代謝產(chǎn)品合成最優(yōu)化的配合，依然是巨大的難點。這可能需要計算機、數(shù)學、分析化學、合成生物學等多學科配合進行進一步的探索。

其次，隨著合成生物學的發(fā)展，在改造傳統(tǒng)底盤細胞的同時，不斷開發(fā)生長快速、操作簡單的新型底盤細胞用于聚酮化合物的異源表達與合成也是目前合成生物學的熱點。通過基因工程手段將聚酮化合物代謝通路移植到新的底盤細胞并與其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行優(yōu)勢互補，構(gòu)建新型、優(yōu)勢底盤細胞，解決異源代謝網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的適配性是目前面臨的又一個難點。

最后，隨著環(huán)保、綠色制造的理念日益深入人心，聚酮化合物的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)也面臨碳排放與綠色經(jīng)濟的壓力。在傳統(tǒng)利用PKS催化進行聚酮化合物生物合成過程中，存在反應(yīng)動力學緩慢、能源效率低、碳經(jīng)濟性差等缺點。在這一過程中，約有1/3 的碳以二氧化碳的形式損失掉，這不僅增加了碳排放的壓力，同時也是碳源的損失。因此，通過合成生物學手段進行聚酮化合物生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計與改造，在降低能耗與碳損失的同時，不斷提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量是當前合成生物學面臨的挑戰(zhàn)。相信隨著研究的不斷深入，以上這些瓶頸和挑戰(zhàn)終將被克服。