易 品 綜述，邵超鵬，顧大勇，董瑞玲 審校

(1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510515；2.深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東深圳 518033)

?

·綜 述·

瘧色素應(yīng)用于拉曼光譜技術(shù)檢測瘧疾研究進(jìn)展

易 品1綜述，邵超鵬1，顧大勇2，董瑞玲2審校

(1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510515；2.深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東深圳 518033)

光譜分析,拉曼； 瘧疾; 實驗室技術(shù)和方法; 瘧色素； 特征峰

瘧疾是一種由瘧原蟲感染引起的威脅生命的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新情況，2013年仍有共計約1.98億瘧疾患者，其中58.4萬人死亡。瘧原蟲侵入人體后早期寄生在肝細(xì)胞中，后期主要寄生在紅細(xì)胞內(nèi)。瘧原蟲在宿主紅細(xì)胞內(nèi)以血紅蛋白中的珠蛋白部分為營養(yǎng)來源，而血紅蛋白的血紅素部分則被釋放出來成為游離血紅素，為避免游離血紅素對瘧原蟲自身的殺傷作用，瘧原蟲將游離血紅素轉(zhuǎn)化成不可溶的高鐵血紅素結(jié)晶，即瘧色素[1-2]。目前針對瘧色素檢測的研究取得許多進(jìn)展，尤其是拉曼光譜技術(shù)。拉曼光譜技術(shù)的基本原理是利用激光照射介質(zhì)后會產(chǎn)生與入射波長不同的光譜，從而獲得分子振動的相關(guān)信息，進(jìn)而獲得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。瘧色素具有特殊的二聚體分子結(jié)構(gòu)[3]，拉曼激光照射瘧色素會產(chǎn)生不同于血紅蛋白的拉曼光譜,即特征峰，這為早期診斷瘧疾帶來希望。

1 拉曼光譜技術(shù)檢測瘧色素的優(yōu)勢

1.1 樣本處理 拉曼光譜技術(shù)所需樣品量非常少，樣本無需進(jìn)行染色或去除雜質(zhì)等處理，液體、固體均可，甚至活細(xì)胞原位也能進(jìn)行檢測，而且檢測后對樣本無影響[4-5]，可避免常規(guī)檢測手段樣本處理過程中待檢物的損失和待檢物理化性質(zhì)的改變。國內(nèi)外學(xué)者將拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于瘧疾患者血清[5]、瘧疾感染紅細(xì)胞裂解液等的檢測，通過分析拉曼光譜技術(shù)，可深入了解血清中瘧色素是否存在，進(jìn)而判斷是否感染瘧疾。此外活細(xì)胞原位拉曼光譜技術(shù)檢測可以準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)細(xì)胞和物質(zhì)的實時信息如Frosch等[6]將顯微共聚焦拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于瘧原蟲感染紅細(xì)胞原位檢測，獲得分辨率較高的瘧色素在紅細(xì)胞的分布圖。在瘧疾的檢測方面，活細(xì)胞原位檢測雖然直觀高效但耗時長，而血清檢測既簡便、快速又準(zhǔn)確。此外拉曼光譜技術(shù)具有無需標(biāo)記且無波壞性的特點，對臨床應(yīng)用具有極重要的意義。

1.2 檢測靈敏度 目前瘧原蟲感染的檢測方法主要分為3種：(1)血涂片鏡檢，血涂片鏡檢仍然是目前臨床瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然準(zhǔn)確度高，但其有對檢測者的要求高、耗時長和靈敏度差等缺點；(2)核酸檢測，以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)檢測瘧原蟲的特異性核苷酸片段來判斷是否有瘧原蟲感染[7-8]，其靈敏度雖然有所提高(在瘧原蟲大于或等于5個/μL時其檢測陽性率可達(dá)100%)，但對實驗條件要求高且達(dá)不到快速檢測的要求[9]；(3)抗原抗體反應(yīng)，檢測瘧原蟲的特異抗原如ELSIA、免疫膠體金技術(shù)等[9]，雖然具有操作簡便、快速等特點，但靈敏度不高(陽性率為77%～98%，且是在瘧原蟲大于100個/μL條件下)[10]。總之，目前已有的檢測手段存在靈敏度不夠及實驗條件要求高等缺點，而臨床亟須一種靈敏度高又快速的檢測手段。近年來隨著拉曼光譜技術(shù)不斷發(fā)展，市場上出現(xiàn)如顯微共聚焦拉曼、激光共振拉曼、表面增強(qiáng)拉曼、便攜式拉曼儀等新技術(shù)，這些新技術(shù)大大提高了拉曼光譜技術(shù)檢測的靈敏度。顯微共聚焦拉曼光譜儀測量樣品可以小到1 μmoL的量，激光共振拉曼產(chǎn)生的信號強(qiáng)度可達(dá)到正常拉曼譜帶的104～106倍，表面增強(qiáng)拉曼產(chǎn)生的拉曼信號較普通拉曼強(qiáng)104～107倍。便攜式拉曼儀的應(yīng)用使瘧疾檢測儀器小型化，便于開展瘧疾的篩查。有文獻(xiàn)報道，將瘧原蟲的檢測濃度下限降低至5 nmol/L的極限(相當(dāng)于每微升體積中含有30個早期瘧原蟲體)[11]，在活細(xì)胞原位檢測時甚至可以達(dá)到納米級的信號收集，掃描的分辨率達(dá)0.5 μm。

2 瘧色素結(jié)構(gòu)特性及拉曼光譜技術(shù)特點

2.1 瘧色素結(jié)構(gòu)及順磁性 瘧色素是由2個高鐵原卟啉環(huán)[Fe(Ⅲ)PPIX]通過疏水鍵連接形成的二聚體結(jié)構(gòu)[3,12]，見圖1。在瘧色素形成過程中血紅素中的二價鐵被氧化成三價鐵，使原子軌道外周含有不成對電子，故使瘧色素具有順磁性。這種特性使瘧色素在外加磁場作用下，產(chǎn)生磁力而被吸引，可用于與外周血中其他細(xì)胞或物質(zhì)分離[13]。國外文獻(xiàn)報道，基于外加磁場的瘧原蟲感染紅細(xì)胞富集效果(富集效率為98%)優(yōu)于密度梯度離心(富集效率為90%～97%)[14-15]，且具有磁性的表面增強(qiáng)其瘧色素的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)明顯強(qiáng)于無磁性的表面增強(qiáng)[16]。

圖1 瘧色素二聚體結(jié)構(gòu)

2.2 瘧色素的拉曼光譜技術(shù)特點 瘧色素在拉曼光譜技術(shù)激光照射下會產(chǎn)生特異性拉曼光譜，且在不同波長(532、568、633、647、676、830、1 064 nm)下照射下會產(chǎn)生不同特征的拉曼光譜[17]，見圖2，可能與不同波長激光照射時激光頻率與分子內(nèi)部相應(yīng)分子鍵或結(jié)構(gòu)共振有關(guān)。瘧色素的拉曼光譜總結(jié)起來有以下幾個特點：(1)在568、830 nm波長下，拉曼位移1 372 cm-1處拉曼強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他幾個波長，且瘧色素拉曼位移在1 372 cm-1處峰強(qiáng)度較血紅蛋白高，這與瘧色素二聚體之間的四吡喏重疊區(qū)域共振有關(guān)，1 372 cm-1反映卟啉環(huán)反π*軌道電荷濃度相關(guān)[18]；(2)由于血紅蛋白衍生物在400 nm附近均有強(qiáng)大的吸收帶[邵氏帶(Soret band)]的存在，在420 cm-1處附近有較強(qiáng)的峰，這與卟啉化合物結(jié)構(gòu)有關(guān)，可依據(jù)此鑒定是否為卟啉化合物；(3)Q帶，其在未插入金屬離子時會出現(xiàn)4個峰，插入金屬離子后減少到1～2個峰；(4)在532～647 nm波長中343、368 cm-1處峰強(qiáng)度隨著波長增加而增強(qiáng)，且343 cm-1峰強(qiáng)度強(qiáng)于368 cm-1處。但當(dāng)波長超過647 nm時343、368 cm-1處慢慢減弱，這與瘧色素二聚體之間形成的丙酸酯鍵有關(guān)；(5)755 cm-1峰強(qiáng)度在633、647、676 nm波長激光檢測時明顯高于其他波長，755 cm-1反映卟啉呼吸環(huán)振動[19]；(6)1 623、1 568 cm-1除在568、830 nm波長處的強(qiáng)度稍弱外，其他波長下的強(qiáng)度均較強(qiáng)，這與吡咯環(huán)振動有關(guān)，1 623、1 568 cm-1不僅能反映鐵離子的自旋狀態(tài)，還能反映卟啉環(huán)中心孔徑(core size,鐵離子到吡喏氮離子的距離)的大小[20]。瘧色素與血紅蛋白的拉曼光譜比較見表1，瘧色素的主要拉曼光譜特征峰見表2。

圖2 不同波長下瘧色素的拉曼光譜

血紅蛋白(cm-1)感染紅細(xì)胞中的瘧色素(cm-1)瘧色素(cm-1)16381638-16181619-16041604-15811578158115651563-15461545-14281427143013981396139813671366-13421343--1310130812491249-12261225-11721174-11291131-10901087-996998--972971-796797-757754

-：無數(shù)據(jù)。

表2 瘧色素的特征峰[22]

注：此表根據(jù)平面對稱卟啉系統(tǒng)評價，其中ν為伸縮振動，vinyl為乙烯基，δ為平面內(nèi)變形振動，pyr為吡咯，deform為變形，sym為對稱性，half-ring為半環(huán)；-無數(shù)據(jù)。

3 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)在瘧色素檢測中的應(yīng)用

拉曼光譜技術(shù)檢測最大的缺點是拉曼散射信號弱，在瘧原蟲感染率極低的情況下，拉曼光譜技術(shù)檢測可能出現(xiàn)假陰性，如果拉曼信號能被增強(qiáng)，將大大提高檢出率。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的發(fā)現(xiàn)，使瘧原蟲的檢測信號大大增強(qiáng)，可達(dá)普通拉曼的104～107倍。SERS定義為當(dāng)物質(zhì)分子吸附在一些特定粗糙的金屬表面時分子的拉曼散射強(qiáng)度得到大大提升[23]，國外許多文獻(xiàn)報道了SERS在拉曼光譜檢測瘧色素應(yīng)用中的不錯表現(xiàn)如2011年Yuen等[11]設(shè)計了一種以Fe3O4納米顆粒為核心，以納米銀顆粒為包殼模式的表面增強(qiáng)，使得這種表面增強(qiáng)帶有磁性富集作用，提升了檢測靈敏度，達(dá)到5 nM的濃度極限(相當(dāng)于每微升體積中含有30個早期瘧原蟲體)；2年后Yuen等[24]調(diào)整了Fe3O4納米顆粒厚度及納米銀包殼大小，優(yōu)化了以上表面增強(qiáng)，更進(jìn)一步增強(qiáng)了拉曼信號；Garrett等[16]根據(jù)蝴蝶翅膀納米結(jié)構(gòu)設(shè)計了一種在以蝴蝶翅膀的納米結(jié)構(gòu)為基質(zhì)表面鍍納米金的表面增強(qiáng)，這種增強(qiáng)能使檢測極限達(dá)到蟲血率為0.000 05%；Wood等[25]結(jié)合納米探針技術(shù)與表面增強(qiáng)技術(shù)，設(shè)計了一種針尖增強(qiáng)拉曼散射(TERS)，克服了普通表面增強(qiáng)信號收集范圍廣所帶來的信號干擾，實現(xiàn)了納米級信號的收集，極大地提高了檢測分辨率。新型材料石墨烯，具有理想的單層碳原子的二維結(jié)構(gòu)，形成一個蜂窩狀晶格平面，具有做表面增強(qiáng)的特性，最近研究表明，石墨烯具有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，存在表面增強(qiáng)效應(yīng)[26-27]。

4 瘧色素應(yīng)用于拉曼光譜技術(shù)檢測瘧疾的前景

拉曼光譜技術(shù)作為新興手段應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測方面具有獨特的優(yōu)勢，即高靈敏度、高分辨率、快速及標(biāo)本無需處理等特點，近年來該技術(shù)逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。拉曼光譜技術(shù)不僅用于血清、體液等的檢測，還拓展到活細(xì)胞或組織原位研究如正常和感染瘧疾的紅細(xì)胞原位檢測、血清中腫瘤標(biāo)記物檢測與定量分析、動脈粥樣硬化的早期診斷等，這些研究均取得較好的結(jié)果。同時伴隨著石墨烯表面增強(qiáng)納米材料、表面增強(qiáng)、微流控等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，檢測閾值和檢測時間進(jìn)一步縮小(或縮短)，這對早期診斷瘧疾意義非凡。但石墨烯材料作為新發(fā)現(xiàn)的材料本身具有做表面增強(qiáng)基底的特性，其將具有巨大應(yīng)用前景分子印跡技術(shù)結(jié)合表面增強(qiáng)將來會發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛力。拉曼光譜技術(shù)推廣到臨床使用還需要克服幾個缺點如固體(或晶體)樣品的檢測效果優(yōu)于液體、復(fù)雜樣品的信號會受到干擾、檢測范圍小及自動化程度差等。相信在未來這些缺點會被一一克服，拉曼光譜技術(shù)憑借其檢驗特性將有望為醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)科的發(fā)展增添新動力。

[1]Egan TJ.Recent advances in understanding the mechanism of hemozoin (malaria pigment) formation[J].J Inorg Biochem，2008，102(5/6):1288-1299.

[2]Carter WD.Raman spectroscopic study of single red blood cells infected by the malaria parasite plasmodium falciparum[D].Orlando：the University of Central Florida，2007.

[3]Bonifacio A，F(xiàn)inaurini S，Krafft C，et al.Spatial distribution of heme species in erythrocytes infected with Plasmodium falciparum by use of resonance Raman imaging and multivariate analysis[J].Anal Bioanal Chem，2008，392(7/8):1277-1282.

[4]韋娜，馮敘橋，張孝芳，等.拉曼光譜及其檢測時樣品前處理的研究進(jìn)展[J].光譜學(xué)與光譜分析，2013，33(3):694-698.

[5]Bilal M，Saleem M，Amanat ST，et al.Optical diagnosis of malaria infection in human plasma using Raman spectroscopy[J].J Biomed Opt，2015，20(1):17002.

[6]Frosch T，Koncarevic S，Zedler L，et al.In situ localization and structural analysis of the malaria pigment hemozoin[J].J Phys Chem B，2007，111(37):11047-11056.

[7]Ng J，Satkoski J，Premasuthan A，et al.A nuclear DNA-based species determination and DNA quantification assay for common poultry species[J].J Food Sci Technol，2014，51(12):4060-4065.

[8]Kain KC，Kyle DE，Wongsrichanalai C，et al.Qualitative and semiquantitative polymerase chain reaction to predict Plasmodium falciparum treatment failure[J].J Infect Dis，1994，170(6):1626-1630.

[9]Moody A.Rapid diagnostic tests for malaria parasites[J].Clin Microbiol Rev，2002，15(1):66-78.

[10]Srinivasan S，Moody AH，Chiodini PL.Comparison of blood-film microscopy,the OptiMAL dipstick,Rhodamine-123 fluorescence staining and PCR,for monitoring antimalarial treatment[J].Ann Trop Med Parasitol，2000，94(3):227-232.

[11]Yuen C，Liu Q.Magnetic field enriched surface enhanced resonance Raman spectroscopy for early malaria diagnosis[J].J Biomed Opt，2012，17(1):17005.

[12]董瑞玲，顧大勇，朱玉蘭，等.拉曼光譜技術(shù)在瘧疾檢測中的應(yīng)用[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14(10):1270-1275.

[13]姚美雪，王恒.瘧色素在瘧原蟲檢測方面的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2014，32(1):68-71.

[14]Trang DT，Huy NT，Kariu T，et al.One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells[J].Malar J，2004，3:7.

[15]Bhakdi SC，Ottinger A，Somsri S，et al.Optimized high gradient magnetic separation for isolation of Plasmodium-infected red blood cells[J].Malar J，2010，9:38.

[16]Garrett NL，Sekine R，Dixon MW，et al.Bio-sensing with butterfly wings:naturally occurring nano-structures for SERS-based malaria parasite detection[J].Phys Chem Chem Phys，2015，17(33):21164-21168.

[17]Frosch T，Koncarevic S，Becker K，et al.Morphology-sensitive Raman modes of the malaria pigment hemozoin[J].Analyst，2009，134(6):1126-1132.

[18]Wood BR，Caspers P，Puppels GJ，et al.Resonance Raman spectroscopy of red blood cells using near-infrared laser excitation[J].Anal Bioanal Chem，2007，387(5):1691-1703.

[19]賈文廣，陳萍.拉曼光譜在紅細(xì)胞及血紅蛋白研究中的應(yīng)用[J].內(nèi)科，2007，2(2):249-251.

[20]Hirota S，Mizoguchi Y，Yamauchi O，et al.Observation of an isotope-sensitive low-frequency Raman band specific to metmyoglobin[J].J Biol Inorg Chem，2002，7(1/2):217-221.

[21]Wood BR，Langford SJ，Cooke BM，et al.Raman imaging of hemozoin within the food vacuole of Plasmodium falciparum trophozoites[J].FEBS Lett，2003，554(3):247-252.

[22]Drescher D，Buchner T，Mcnaughton D，et al.SERS reveals the specific interaction of silver and gold nanoparticles with hemoglobin and red blood cell components[J].Phys Chem Chem Phys，2013，15(15):5364-5373.

[23]周明輝，廖春艷，任兆玉，等.表面增強(qiáng)拉曼光譜生物成像技術(shù)及其應(yīng)用[J].中國光學(xué)，2013，6(5):633-642.

[24]Yuen C，Liu Q.Optimization of Fe3O4@Ag nanoshells in magnetic field-enriched surface-enhanced resonance Raman scattering for malaria diagnosis[J].Analyst，2013，138(21):6494-6500.

[25]Wood BR，Bailo E，Khiavi MA，et al.Tip-enhanced Raman scattering (TERS) from hemozoin crystals within a sectioned erythrocyte[J].Nano Lett，2011，11(5):1868-1873.

[26]郭書鵬.石墨烯表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)的探究[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2013.

[27]劉智明，鐘會清，倪藝榕，等.氧化石墨烯-金屬納米復(fù)合物的綠色制備及其SERS效應(yīng)[G/OL].廣東省光學(xué)學(xué)會2013年學(xué)術(shù)交流大會“暨”粵港臺光學(xué)界產(chǎn)學(xué)研合作交流大會會議手冊論文集,2013-12-13.[2015-4-30].http://kreader.cnki.net/Kreader/CatalogViewPage.

國家質(zhì)檢總局科研基金項目(2014IK054)。 作者簡介：易品，男，在讀碩士研究生，主要從事光譜學(xué)方法在瘧疾的診斷中的應(yīng)用及血液免疫分子生物學(xué)的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.035

A

1673-4130(2016)02-0229-04

2015-08-27)