李嘉慧王欣佩冷 靜

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,南寧 530021； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530200； 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因。 據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization, WHO)統(tǒng)計(jì),每年約有1790 萬(wàn)的人死于CVD,占全球死亡人數(shù)的31%,超過(guò)75%的CVD 發(fā)生在中低收入水平國(guó)家。 致CVD 的病因有多種,大多數(shù)CVD 的根本原因是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的發(fā)生[1]。

AS 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,然而某些因素能夠增加AS 的發(fā)病概率,包括遺傳、環(huán)境和個(gè)體習(xí)慣,如吸煙、肥胖、糖尿病、高血壓等等[2]。

血脂升高是AS 發(fā)展的核心,近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),慢性炎癥在AS 發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[3-4]。 這種炎癥信號(hào)與天然免疫和適應(yīng)性免疫均有聯(lián)系[5]。 固有免疫作為機(jī)體抵抗外來(lái)病原菌的第一道防線,近年來(lái)較多的研究其在AS 發(fā)病中的影響。 Toll 樣受體(Toll-like receptor, TLR),TLR4 作為TLR 家族中的一員,通過(guò)激活下游炎性因子的分泌參與AS 從內(nèi)膜脂質(zhì)積聚到斑塊破裂的各個(gè)階段,因而被認(rèn)為是影響AS 發(fā)生發(fā)展的重要靶點(diǎn)之一。

1 TLR4 的概述

1.1 TLR4 分布及分子結(jié)構(gòu)

TLR 是一種重要的模式識(shí)別受體,通過(guò)識(shí)別各種病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMP)在天然免疫中發(fā)揮重要的作用[6]。TLR4 是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的受體,分布于B 細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞表面,能夠識(shí)別廣泛的危險(xiǎn)信號(hào)分子,包括微生物成分,如脂多糖(LPS)和經(jīng)過(guò)內(nèi)源性修飾的分子,如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)[7]。

TLR4 是一型跨膜蛋白,由胞外域、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三部分組成。 胞外域由亮氨酸富集的重復(fù)序列組成,參與對(duì)PAMP 的識(shí)別,通過(guò)跨膜區(qū)將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 胞漿區(qū)因與IL-1R 家族成員的胞漿區(qū)高度同源,因此稱為Toll/IL-1 受體(Toll/IL-1 receptor, TIR)結(jié)構(gòu)域,用于募集含有TIR 結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白,進(jìn)行下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。 Toll 樣受體識(shí)別PAMP 在固有免疫中發(fā)揮作用,激活樹突狀細(xì)胞表達(dá)共刺激分子,將主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)二類分子攜帶的抗原表達(dá)于樹突狀細(xì)胞表面,T 細(xì)胞識(shí)別發(fā)揮適應(yīng)性免疫應(yīng)答,因此Toll 樣受體在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮橋梁作用[9-10]。

1.2 TLR4 的兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路

TLR4 識(shí)別配體發(fā)生在細(xì)胞表面,受體內(nèi)化進(jìn)行信號(hào)的傳導(dǎo)。 TLR4 是唯一可以激活兩條信號(hào)通路的TLR 受體:MyD88 依賴型信號(hào)通路和MyD88 非依賴型信號(hào)通路[11]。 分別由MyD88 和TRIF 兩種銜接蛋白與受體結(jié)合激活下游信號(hào),分別產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和干擾素,進(jìn)而激活T、B 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,進(jìn)一步殺傷入侵的病原微生物[12]。

1.2.1 MyD88 依賴性信號(hào)通路

MyD88 依賴型信號(hào)通路是在質(zhì)膜上介導(dǎo)除TLR3 以外所有TLR 的共同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。 髓樣分化蛋白88 (myeloid differential proteiN-88,MyD88)是一種銜接蛋白,有兩個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)域N端和C 端。 C 端含有TLR 結(jié)構(gòu)域,其作用是募集受體激活信號(hào)通路。 N 端又稱為死亡結(jié)構(gòu)域,其與IL-1R 相關(guān)激酶4(IL-1R related kinases-4, IRAK-4)相互作用,IRAK-4 磷酸化IRAK-1,IRAK-1 進(jìn)一步激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6, TRAF6)[14]。 TRAF6 是一種E3 泛素連接酶,TRAF-6 與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 活化激酶-1(TAK1)相互作用,TAK1 與TAK1 結(jié)合蛋白1 和2(TAB1 和TAB2)結(jié)合后。 活化的TAK1 進(jìn)一步激活NF-κB 抑制蛋白激酶復(fù)合物(IKK α、β、ε)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),進(jìn)而激活NF-κB 和AP-1 蛋白,激活后的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核,產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子,如白介素-6(interleukiN-6, IL-6)、白介素-1β(interleukiN-1β, IL-1β)、腫 瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白- 1 (monocyte chemoattractant proteiN-1, MCP-1)等[15-17]。

1.2.2 MyD88 非依賴性信號(hào)通路

MyD88 非依賴性信號(hào)通路是內(nèi)體發(fā)生的另一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 TLR4 通過(guò)銜接蛋白TRAM 與TRIF 結(jié)合后,激活TRIF,TRIF 與TRAF3、TRAF6 以及受體相互作用蛋白1 和3(RIP1、RIP3)結(jié)合后,TRAF3 和TRAF6 活化,分別行使不同的激活通路[18-19]:TRAF3 與IKKε 結(jié)合,活化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor3, IRF3),一型干擾素(interferon, IFN)產(chǎn)生[20]；TRAF6 在RIP1 的作用下與TAK1 結(jié)合,激活NF-κB 和MAPK 誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。

2 TLR4/NF-κB 在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的作用

TLR4 作為天然免疫TLR 家族中一員,它的上調(diào)及其下游通路的激活在AS 的發(fā)生中有著一定的地位。 TLR4 在人和小鼠的AS 過(guò)程中均有過(guò)表達(dá),主要在病變的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi),參與AS 的各個(gè)階段[21]。 有研究發(fā)現(xiàn),與C57BL/6 小鼠相比,C3H/HeJ 小鼠在高膽固醇和飲食中具有抗AS 的能力。 這是由于C3H/HeJ 小鼠在TLR4 細(xì)胞質(zhì)區(qū)存在點(diǎn)突變,導(dǎo)致TLR4 無(wú)功能,因此TLR4 可能是小鼠體內(nèi)發(fā)生AS 的一種重要因素[22]。 Michelsen等[23]人通過(guò)抑制TLR4 和MyD88 基因表達(dá),顯著降低Apo-e-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變面積、斑塊脂質(zhì)含量、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞的黏附及循環(huán)促炎細(xì)胞因子,如MCP-1、IL-12 等的循環(huán)水平。 Edfeldt 等[24]研究發(fā)現(xiàn),TLR4 在人AS 的內(nèi)皮細(xì)胞、動(dòng)脈粥樣斑塊上表達(dá)高度上調(diào),因此TLR4 在人AS 的形成過(guò)程中有著重要的作用。

2.1 TLR4 在脂肪條紋形成中的作用

AS 是由于脂肪、血栓等在血管內(nèi)皮沉積的一種慢性血管疾病。 血管內(nèi)皮具有抗炎、抗凝血的功能,在維持血管完整性方面有著重要的作用。 脂質(zhì)代謝障礙是AS 的病變基礎(chǔ),它觸發(fā)了由慢性炎癥介導(dǎo)的免疫反應(yīng),導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能異常[25]。

血脂中的低密度脂蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用是AS 發(fā)生的開始。 美國(guó)心臟協(xié)會(huì)將血脂中的LDL增加到1.81～4.89 mmol/L 定義為高脂血癥[26]。 由于血脂負(fù)荷,血脂中LDL 增加后,LDL 被攝入內(nèi)膜修飾為ox-LDL。 oxLDL 可激活T 細(xì)胞,分泌細(xì)胞因子和黏附分子,使得單核細(xì)胞阻滯,與內(nèi)皮細(xì)胞接觸后形成巨噬細(xì)胞[27]。 oxLDL 的激活可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面的TLR4 表達(dá)上調(diào),促炎巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞,泡沫細(xì)胞的積累形成了脂肪條紋,是AS 的第一個(gè)標(biāo)志。 Howell 等[28]人對(duì)TLR4活性和TLR4 缺陷的C3H/HeN 小鼠巨噬細(xì)胞體外進(jìn)行oxLDL 誘導(dǎo)后,TLR4 活性的小鼠巨噬細(xì)胞分化為泡沫細(xì)胞的比例出現(xiàn)上調(diào),此外,研究者在給予oxLDL 誘導(dǎo)前,用TLR4 單克隆抗體預(yù)處理C3H/HeN 小鼠巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞分化的比例從29%降到13%,因此他們認(rèn)為TLR4 是oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞分化所必須的。 然而oxLDL 激活巨噬細(xì)胞表面TLR4 和引發(fā)的炎癥反應(yīng)的確切機(jī)制尚不清楚。 最新的一項(xiàng)研究表明髓樣分化蛋白- 2 (myeloid differentiation protein 2,MD2),巨噬細(xì)胞表面的一種受體,在oxLDL 激活TLR4 中發(fā)揮著重要的作用,oxLDL 可直接與MD2結(jié)合,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MD2/TLR4 復(fù)合物的形成和TLR4/MyD88/NF-κB 促炎級(jí)聯(lián)而引起TLR4 激活觸發(fā)炎癥反應(yīng),并發(fā)現(xiàn)MD2 缺乏或抑制可以阻止AS的發(fā)生[29]。 因此MD2 的作用為oxLDL 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)提供了機(jī)制基礎(chǔ)。

單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞是脂質(zhì)斑塊形成的主要細(xì)胞。 Xu 等[30]研究表明TLR4 在人類和小鼠富含脂質(zhì)的AS 病變中優(yōu)先在巨噬細(xì)胞表達(dá)。Stoletor 等[31]給予斑馬魚高膽固醇飲食誘導(dǎo)血管脂質(zhì)積累形成中,研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞攝取LDL 需要TLR4 參與。 平滑肌細(xì)胞在AS 形成的每一個(gè)階段也起著重要的作用。 Kiyan 等[32]研究發(fā)現(xiàn)oxLDL 通過(guò)與TLR4 結(jié)合誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell, SMC)釋放粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)與粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 ( granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF),提示SMC 參與巨噬細(xì)胞的主動(dòng)調(diào)節(jié)。 Aviram 等[33]研究發(fā)現(xiàn)SMC 通過(guò)攝取oxLDL,使其表面的TLR4 上調(diào),激活下游NF-κB通路,并釋放IL-1β、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子,促炎的SMC 轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,加速脂肪條紋的形成。

2.2 TLR4 在動(dòng)脈斑塊形成中的作用

隨著病變的發(fā)展,SMC 由靜息狀態(tài)遷移至內(nèi)膜活化參與動(dòng)脈斑塊的形成,血管內(nèi)膜發(fā)生增厚,SMC是內(nèi)膜增厚的主要類型細(xì)胞[34]。 有研究發(fā)現(xiàn)在AS脂質(zhì)核心區(qū)SMC 的TLR4 表達(dá)上調(diào),因此TLR4 在動(dòng)脈粥樣斑塊形成中起著重要的作用[35]。

Michelsen 等[23]用Apo-E-/-小鼠模型研究表明,TLR4 及其MyD88 的缺失使得主動(dòng)脈斑塊的面積顯著減小,降低了AS 的嚴(yán)重程度。 Bj?rkbacka 等[36]用MyD88 缺失小鼠證明,TLR4 缺乏與冠狀動(dòng)脈斑塊組成的改變有關(guān),這種改變降低了促炎因子和趨化因子的表達(dá)。

2.3 TLR4 在AS 病變后期的作用

在AS 的病變后期,炎性細(xì)胞分泌的蛋白酶降解彈性蛋白、纖維蛋白、基質(zhì)蛋白,斑塊不穩(wěn)定甚至發(fā)生破裂。 基質(zhì)金屬蛋白酶 - 9 ( matrix metalloproteinase-9, MMP-9)在動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定和破裂過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。 oxLDL 通過(guò)TLR4/NF-κB 依賴途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放IL-8、IL-1β、TNF-α,上調(diào)MMP-9,加速斑塊的破裂[3]。

臨床研究表明,急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)患者的破裂和易損斑塊的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris,SA)患者的細(xì)胞高,提示免疫反應(yīng)的激活與斑塊破裂和易損斑塊進(jìn)展有關(guān)。 組織學(xué)研究表明TLR4 在尸檢獲得的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的冠狀動(dòng)脈斑塊中高表達(dá),表明TLR4 參與動(dòng)脈斑塊的破裂過(guò)程[37]。 Yu等[38]通過(guò)抽取AMI 患者破裂斑塊局部標(biāo)本,分離單核細(xì)胞,患者斑塊周圍浸潤(rùn)單核細(xì)胞的TLR4 高于全身水平。 說(shuō)明TLR4 在冠狀動(dòng)脈浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞中的表達(dá)可能是冠狀動(dòng)脈斑塊失穩(wěn)和破裂的重要因素。 Montecucco 等[39]給予ApoE-/-小鼠抗-apoA-1 抗體,研究發(fā)現(xiàn)該抗體通過(guò)TLR4 途徑導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和MMP-9 含量增加,膠原含量降低,進(jìn)而增加動(dòng)脈斑塊的易損性,致小鼠的死亡率增加23%。 纖維連接蛋白含有的額外結(jié)構(gòu)域A(FNEDA)作為TLR4 的內(nèi)源性配體,可激活TLR4 通路。Doddapattar 等[40]對(duì)Apo-/-小鼠的研究結(jié)果表明,FN-EDA 富集的微環(huán)境是通過(guò)TLR4 途徑誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定。

2.4 NF-κB 在AS 發(fā)病過(guò)程中的作用

炎癥最重要的調(diào)節(jié)因子之一是轉(zhuǎn)錄因子NFκB。 NF-κB 被認(rèn)為是一種促AS 的因子,它參與了AS 形成過(guò)程中的多個(gè)病理過(guò)程[41]。

人和動(dòng)物模型的研究均表明了NF-κB 參與了AS 的病變過(guò)程。 Methe 等[42]發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征和不穩(wěn)定型心絞痛患者的外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的NF-κB 被激活,提示NF-κB 的激活是免疫介導(dǎo)的AS 進(jìn)展的一種信號(hào)機(jī)制。 Tang 等[43]用siRNA敲低Apo-E KO 小鼠的TLR4 后,NF-κB 表達(dá)隨之被抑制,同時(shí)血漿中IL-1β、TNF-α 和MCP-1 水平也顯著降低。 Wolfrum 等[44]用NF-κB 抑制劑后,降低了Apo-E-/-小鼠主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化病變面積。

在AS 病變的初期,oxLDL 激活內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng),NF-κB 參與激活內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子如e-選擇素、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecules-1, VCAM - 1)、 細(xì) 胞 間 粘 附 分 子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1),內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子通過(guò)與單核細(xì)胞的粘附作用,促進(jìn)了AS 的發(fā)生[45]。 Plotkin 等[46]人給Apo-E-/-小鼠應(yīng)用NF-κB 抑制劑后,減少了泡沫細(xì)胞的形成。

炎癥介導(dǎo)的VSMC 功能障礙導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜增生是AS 發(fā)生的關(guān)鍵一步。 血管內(nèi)皮損傷后,VSMC 由靜息狀態(tài)變?yōu)榛罨倪^(guò)程中,NF-κB 家族成員p50、p65、p52、c-rel 和RelB 出現(xiàn)上調(diào),抑制蛋白發(fā)生下調(diào)。 并且在VSMC 激活后,巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與VCAM-1、MCP-1 表達(dá)平行,血管經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的受損,腔面SMC 繼續(xù)高表達(dá)VCAM-1 和MCP-1,巨噬細(xì)胞持續(xù)增多,逐漸形成動(dòng)脈斑塊[47]。 在對(duì)頸動(dòng)脈狹窄患者的動(dòng)脈粥樣斑塊研究中,NF-κB 過(guò)度激活,FasL 表達(dá),NF-κB 參與促凋亡蛋白Fas 配體(Fas ligand,FasL)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,因此NF-κB/FasL 參與斑塊不穩(wěn)定的機(jī)制[48]。

3 TLR4 作為靶點(diǎn)治療AS

AS 是作為一種其他心血管疾病的主要誘因,預(yù)防和治療AS 成為我們重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。 TLR4 因在AS 的發(fā)生過(guò)程中有重要的作用,因此TLR4 及其下游通路可作為潛在的治療靶點(diǎn)。 Shen 等[49]研究發(fā)現(xiàn),給予高脂飲食誘導(dǎo)的AS 模型兔子相比于阿托伐他汀治療組的TLR4/NF-κB 表達(dá)明顯升高,因此阿托伐他汀可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 途徑治療AS。 Boekholdt 等[50]對(duì)有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病人研究發(fā)現(xiàn)TLR4Asp299Gly 多態(tài)性與疾病的發(fā)生有關(guān)。 在使用普伐他汀治療后,病人動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度變薄, 斑塊減??； 并且研究發(fā)現(xiàn)攜帶TLR4Asp299Gly 基因的心血管事件風(fēng)險(xiǎn)低于非攜帶者,使攜帶該變異等位基因從普伐他汀的獲益更多。 有研究表明,聯(lián)合使用阿托伐他汀和普羅布考對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的Apo-E-/-缺乏的小鼠AS 作用比單獨(dú)使用阿托伐他汀對(duì)AS 的作用強(qiáng),通過(guò)增加抑制NF-κB 調(diào)節(jié)的TLR4,對(duì)AS 的恢復(fù)具有一定的意義[51]。

4 討論

TLR4/NF-κB 是固有免疫的一條重要通路,其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AS 的形成、發(fā)展等各個(gè)階段發(fā)揮重要的作用。 近年來(lái),越來(lái)越多的研究通過(guò)基因誘導(dǎo)、敲除等方法,證實(shí)了TLR4 及其下游信號(hào)通路與AS 發(fā)病的相關(guān)性,并且作為治療AS 的一個(gè)重要靶點(diǎn)。 但目前還存在一些問(wèn)題需要更深入研究:oxLDL/TLR4 通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞表面的CD36 引起巨噬細(xì)胞的泡沫化,進(jìn)而引起細(xì)胞因子的釋放誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),但是并未有研究證實(shí)TLR4 與細(xì)胞因子釋放的直接作用機(jī)制,也未有研究表明TLR4 在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝中膽固醇蓄積中的作用；其次TLR4基因多態(tài)性與AS 等心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生關(guān)系存在著爭(zhēng)議。 有研究表明攜帶TLR4Asp299Gly 患者給予他汀類藥物治療獲益更多, 因此TLR4Asp299Gly 基因多態(tài)性對(duì)AS 的發(fā)生有保護(hù)作用,而也有研究發(fā)現(xiàn)Asp299Gly 攜帶者男性患者心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)是增加的,而女性無(wú)關(guān)聯(lián)。 因此需要更多的臨床樣本進(jìn)一步闡明TLR4 基因多態(tài)性與AS發(fā)生的關(guān)系。 因此我們期望在今后的研究中,通過(guò)新發(fā)現(xiàn)為防治AS 及AS 的發(fā)生機(jī)制提供新見解。