劉 鵬王廣新蘇國海

(山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,濟南 250013)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性炎癥性疾病,是大多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)。 而冠狀動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定和破裂是發(fā)生急性冠狀動脈事件和猝死的最重要原因,所以心血管疾病早已成為威脅人類健康的頭號殺手[1]。 目前,AS 的發(fā)生機制尚未完全闡明,為了更好地研究AS,需借助與臨床相似的AS 動物模型,以此來研究其病理發(fā)生機制及診療等。 以兔建立的AS 模型,有助于進一步研究AS 發(fā)病機制,也有助于研發(fā)治療AS 的新方法和新藥物。

1 選擇兔建立AS 模型的優(yōu)勢及評價標(biāo)準(zhǔn)

利用動物模型來研究人類AS 的機制已經(jīng)有很長的歷史。 1908 年,俄羅斯醫(yī)生Ignatowski 和實驗病理學(xué)家Anitschkow 用牛奶、肉和蛋等高膽固醇食物喂養(yǎng)兔子后,觀察到主動脈內(nèi)存在大量透明細胞(現(xiàn)在稱為泡沫細胞)積聚的內(nèi)膜損傷,這是最先建立的兔AS 模型[2]。 歷經(jīng)一個多世紀(jì)的發(fā)展,越來越多的學(xué)者認為,建立一種與人類相似的實驗性AS動物模型對AS 的研究具有十分重要的作用。 常用于構(gòu)建AS 模型的動物有小型豬、大鼠、小鼠、兔、非人靈長類動物等。 兔有獨特的脂質(zhì)代謝系統(tǒng),這有助于研究人的脂質(zhì)代謝。 其次,兔AS 的病理演化,從早期病變到晚期病變與人類相似[3]。 與大鼠相比,兔具有與人類相似的脂肪蛋白特征,并表達血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholesterolestertransferprotein,CETP)[3]。 可以增加AS 易感性和循環(huán)游離脂肪酸,這也是兔是對膽固醇最敏感的原因[4]。 除此之外,成年兔的體重比成年大鼠重約10 倍,因此兔子的脈管系統(tǒng)使得外科實驗的研究成為可能。 例如支架和導(dǎo)管等介入治療研究[5]中的冠狀動脈插管以及結(jié)扎兔前降支結(jié)扎制備心肌梗死模型等。 與豬相比,兔AS 造模周期較短且花費較低,可選擇性明顯優(yōu)于小型豬AS 模型[6]。

目前,一般選擇血脂水平測定作為AS 模型是否建立成功的指標(biāo),這些指標(biāo)主要包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL)等[7]。 病理形態(tài)學(xué)檢查主要觀察是否有內(nèi)膜增厚及斑塊表面纖維帽改變等。 除此之外,多種成像系統(tǒng)(包括超聲波、磁共振成像和正電子發(fā)射斷層掃描)已被用于量化實驗性AS 的大小或表征病變成分。

2 用于建立AS 模型的兔品種

目前用于建立兔AS 模型的有日本大耳白兔、新西蘭白兔、青紫藍兔、中國本兔四個品種,均屬于封閉群動物,其中,前兩者常用于建立兔AS 模型,后兩者在文獻中少有涉及[8]。 日本大耳兔的優(yōu)點在于兔耳大,耳緣靜脈血管清晰,便于重復(fù)取血及注射,如果采用小牛血清白蛋白或脂多糖等靜脈注射法來建立兔AS 模型,日本大耳兔是一種理想的實驗用兔。 新西蘭白兔是目前用于心血管研究最常用的兔模型,與其它品系的兔相比,選育后的新西蘭白兔具有生長速度快、飼料報酬高、繁殖性能優(yōu)良、適應(yīng)性能好、抗病力強、遺傳性能穩(wěn)定等特點。 而青紫藍兔和中國本兔因體型偏小、生長速度緩慢,可選擇性較差。

3 兔AS 模型的建立方法

3.1 喂養(yǎng)法建立兔AS 模型

兔在脂肪代謝方面與人類有相似之處,且血漿中富含的CETP 在AS 發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。兔可以在肝中只合成對外源性膽固醇加快轉(zhuǎn)運的載脂蛋白B,這就是兔可以短時間內(nèi)僅通過單純喂養(yǎng)高脂飼料就形成高膽固醇血癥的最大優(yōu)點,從而有利于兔AS 模型的制備。

3.1.1 單純高脂飼料喂養(yǎng)法兔

張夢云等[9]選擇高脂兔飼料(含1%膽固醇,7.5%蛋黃粉,8%豬油,0.5%膽酸鈉,0.1%丙硫氧嘧啶和81%普通兔飼料)喂養(yǎng)4 周后發(fā)現(xiàn)兔高脂喂養(yǎng)組TC、LDL-C、HDL-C、VLDL 分別為對照組的17.7、29.2、4.2、25.8 倍,病理顯示83%的兔模型存在早期AS,證明造模成功。 因為該方法造模操作過程簡單,人工及外界因素干預(yù)少,而且成本相對低。 近年來, 有學(xué)者研究相關(guān)的非編碼RNA,均采用了單純高脂飼養(yǎng)的辦法進行兔AS 造模。 缺點:造模時間相對較長,一些不穩(wěn)定因素容易干擾造模的結(jié)果[10-12]。 例如,兔的個體差異會影響到高脂的實際攝入量。 另外,腹瀉、食欲下降等個體因素可能會導(dǎo)致造模失敗。

3.1.2 靜脈注射脂多糖聯(lián)合高脂飼料法

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分,也是內(nèi)毒素的一種,是可以引起嚴(yán)重全身炎癥反應(yīng)的外源性物質(zhì)之一,內(nèi)皮細胞的損傷和LPS 有著密切關(guān)系。 而AS 形成過程中的始動環(huán)節(jié)就是內(nèi)皮細胞的損傷和功能的改變[13]。 王縣委等[14]采用靜脈注射脂多糖聯(lián)合高脂飼料的方法,在相同實驗條件下,通過兔耳緣靜脈注射不同劑量(100、200、1 000、2 000 ng/kg)的高純級脂多糖引起發(fā)熱性炎癥反應(yīng),同時聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)建立兔AS 模型。 在造模的第5 周時,血脂檢測已達到高血脂水平,病理形態(tài)學(xué)顯示有粥樣壞死斑塊形成,說明靜脈注射LPS 配合高脂飼料成功建立兔AS 模型。 Yang 等[15]在研究藥物抗動脈粥樣硬化作用與降血脂、減少泡沫細胞數(shù)量和內(nèi)皮細胞損傷中選擇了該建模方法。 這種利用炎癥反應(yīng)建立兔AS 的優(yōu)點在于:可以在較短時間內(nèi)成功建立與人類AS 病理形態(tài)學(xué)特點相似的兔AS 模型,用于今后AS 中炎癥信號通路的研究。 這種方法建立兔AS 模型的缺點:容易在注射后引起兔的感染性休克,甚至導(dǎo)致死亡。

3.1.3 皮下注射L-蛋氨酸法

由于高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是AS 形成的一個獨立危險因素,因此高同型半胱氨酸所致的AS 越來越受到重視[16]。 王曉萍等[17]采用L-蛋氨酸皮下注射法建立HHcy 兔AS 模型, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-蛋氨酸皮下注射80 mg/(kg·d)4 周可建立HHcy 模型,12 周時動脈粥樣硬化表現(xiàn)明顯。 本方法建立兔AS 模型的最大優(yōu)點:克服了單純高脂喂養(yǎng)法建立AS 動物模型的不穩(wěn)定性及周期長的缺點,另外,相對于注射脂肪乳和LPS,這種建立方法大大降低了因人工干預(yù)而導(dǎo)致的兔死亡率。 整個操作過程簡單,且L-蛋氨酸相對容易獲取,易于推廣。 皮下注射L-蛋氨酸能建立特殊的兔Hhcy-AS 模型,對進一步探索HHcy 與AS 之間的聯(lián)系,以及今后診療AS患者伴HHcy 都能起到十分關(guān)鍵的作用。

3.1.4 靜脈注射小牛血清白蛋白法

李琳等[18]在喂養(yǎng)高脂飼料的基礎(chǔ)上,喂養(yǎng)第1周初兔耳緣靜脈一次性注射250 mg/kg 的牛血清白蛋白,10 周后進行血脂水平的測定和標(biāo)本的采集。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型兔TC、TG、LDL 和HDL 水平均明顯升高,病理檢查發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增厚,纖維帽薄在斑塊表面形成,斑塊壞死,視野內(nèi)平滑肌細胞稀少,呈現(xiàn)典型的動脈粥樣硬化斑塊,證明兔AS 模型建立成功。近年來,唐云等[19]在中醫(yī)藥在AS 中的研究中均采用了此種建模方法,時間短、成活率高、模型穩(wěn)定、可控性好是該方法建立AS 模型的優(yōu)點。

3.2 機械損傷建立兔AS 模型

3.2.1 動脈球囊拉傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)法

球囊拉傷加高脂飼料喂養(yǎng)建立頸、腹主、髂AS模型廣泛應(yīng)用于AS 的研究,模型建立方法也日趨成熟。 球囊拉傷建立過程:實驗兔術(shù)前12 h 禁食,不禁水。 以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 靜脈麻醉,從耳緣靜脈給予肝素200 U/kg,仰面固定[20]。 頸動脈球囊拉傷在正中切開皮膚5.0 cm 左右,暴露右側(cè)頸總動脈后,遠心端結(jié)扎,近心端用線提起,距頸內(nèi)外動脈分叉點0.5 cm 約45 度角V 形剪開頸外動脈,逆行插入球囊(直徑為2.5 mm×1.0 mm)約5 cm,再連接壓力泵,注入肝素生理鹽水,加壓2 個大氣壓,自近心端緩慢回拉,反復(fù)3 次后撤出導(dǎo)管即可。股動脈拉傷是經(jīng)右側(cè)股動脈遠端置入2.5 mm×20.0mm 球囊至股動脈近端,加壓8 ～10 個大氣壓,然后拉動球囊由近端向遠端剝脫血管內(nèi)皮,最后抽出球囊即可。 球囊拉傷聯(lián)合高脂飲食建立AS 模型的優(yōu)點:內(nèi)皮細胞經(jīng)外力損傷誘發(fā)的AS 病變損傷接近于人AS 病變的發(fā)生發(fā)展過程,易于確定損傷病變部位,方便取材,成為目前建立兔AS 模型最常選用的方法。 缺點:血管內(nèi)徑與球囊內(nèi)徑較難匹配,兔血管直徑相對較小,如多次穿刺失敗容易導(dǎo)致血管痙攣或閉塞。

目前全球能源處于石油向清潔能源過渡的時代,原油和天然氣在世界一次能源消費結(jié)構(gòu)中占比呈下降趨勢(仍超過50%)。但是隨著能源需求的不斷增長,再加上較低的油藏采收率(≤60%),可用的油藏消耗速度仍然日益加快。在節(jié)能減排的背景下,提高油藏的采收率對于保障能源安全具有重要意義[1]。

3.2.2 動脈球囊拉傷聯(lián)合免疫注射法

兔的AS 病變可以通過單獨喂食高膽固醇飲食或結(jié)合動脈球囊損傷而容易誘發(fā)。 與其他動物相比,兔對高膽固醇飲食敏感,可迅速發(fā)展為高膽固醇血癥。 張曉奇等[21]通過超聲結(jié)合病理,來評價斑塊數(shù)量、大小、回聲情況,以及制備病理切片,在HE染色及油紅O 染色下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化及脂肪浸潤情況。 發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)加腹主動脈球囊拉傷術(shù)加注射小牛血清白蛋白比傳統(tǒng)的高脂喂養(yǎng)加腹主動脈球囊拉傷所建立的AS 模型,更穩(wěn)定、更高效。 這種方法最明顯的優(yōu)勢在于:可以在相對短的時間內(nèi)建立AS 模型,形成腹主動脈的動脈粥樣斑塊。

3.2.3 機械損傷聯(lián)合維生素D 法

維生素D 可通過損傷動脈壁來誘發(fā)AS 形成,如平滑肌細胞增殖形成增生性纖維斑塊。 李躍華等[22]運用球囊拉絲損傷腹主動脈內(nèi)膜后,除每日的基礎(chǔ)飼料外,再給實驗兔每日每只加1.5 g 膽固醇,到術(shù)后的第11、12 周給實驗兔皮下注射維生素D50萬IU/kg,術(shù)后13 周取材,結(jié)果顯示,皮下注射維生素D 的實驗兔AS 病變脂質(zhì)條紋面積和纖維斑塊面積的百分比分別為9.64%和1.56%,證明可成功建立AS 斑塊模型。 機械損傷聯(lián)合維生素D 注射建立AS 模型的優(yōu)點:可以模擬人體病理狀態(tài)下血管內(nèi)鈣化的病理生理改變,對于進一步研究藥物治療血管內(nèi)鈣化起到獨特的優(yōu)勢。 弊端是操作過程中,注射維生素D 可能導(dǎo)致斑塊內(nèi)大范圍、不均勻鈣化,容易導(dǎo)致實驗兔的死亡。

3.2.4 溫控氣體損傷與液氮冷凍損傷法

動脈粥樣硬化易損斑塊研究對急性心肌梗死、急性腦梗死等急性心腦血管疾病的治療與預(yù)防都具有重要臨床意義,但現(xiàn)今缺乏供研究的優(yōu)質(zhì)動物模型,但現(xiàn)在研究易損斑塊的實驗中,通常選用溫控氣體損傷法和液氮冷凍損傷兩種辦法。 路懷志等[23]利用恒定低溫氣體損傷兔頸動脈內(nèi)膜,再結(jié)合高脂飲食12 周后發(fā)現(xiàn),溫控氣體損傷組取材后病理下可見薄的纖維帽,內(nèi)膜有巨噬細胞及泡沫細胞浸潤,斑塊出現(xiàn)裂隙,局部小血栓形成,形成典型的易損斑塊,說明利用溫控氣體造模可以形成AS 模型。程衛(wèi)平[24]通過實施液氮冷凍損傷,然后飼養(yǎng)高脂飼料8 周,再行液氮凍傷誘發(fā)斑塊破裂試驗后,病理下發(fā)現(xiàn)兔子均有斑塊或閉塞性血栓形成。 李枚娟等[25]等人進一步確定了兔AS 易損斑塊模型的建立方法,其優(yōu)點在于:損傷血管可控,方法快速、廉價、可重復(fù),而且大大降低了實驗兔的死亡率,未來在AS 易損斑塊研究中必然起到十分重要的作用。

3.3 其它方法建立兔AS 模型

3.3.1 空氣干燥法

王琮等[26]采用頸總動脈內(nèi)膜空氣干燥法建立AS 模型,暴露右側(cè)頸總動脈后,動脈夾夾閉血管近心端及遠心端后,用4 號頭皮針沿血管長軸刺穿,生理鹽水沖管后通氣(120 mL/min)5 min,隨后再次往管腔內(nèi)注入生理鹽水,松開動脈夾,按壓止血。 待出血停止后,縫合皮膚。 4 周后實驗病理結(jié)果顯示頸動脈可見內(nèi)膜不規(guī)則增厚,證明建模成功。 上述方法建立兔AS 模型的優(yōu)點在于:可以在最短時間內(nèi)、在指定部位明確預(yù)定的斑塊,但是最大的缺點是:操作過程中,大大增加了實驗兔的死亡率。

3.3.2 基因敲除法

兔的脂質(zhì)代謝特點十分接近于人體,因兔體內(nèi)低密度脂蛋白含量高,且兔的肝不能編碼載脂蛋白B48mRNA,只能合成載脂蛋白B100,這些都成為選擇建立兔AS 基因模型的優(yōu)勢所在。 因此選兔作為制作ApoE-/-動物AS 模型的研究對象,也能更好地研究Apo E 在AS 中的作用[27]。 而利用基因編輯技術(shù),敲除載脂蛋白E(ApoE)后,就可以建立穩(wěn)定遺傳的動物模型[28]。 現(xiàn)國內(nèi),袁婷婷等[29]借助近幾年新興的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù),編輯新西蘭兔的ApoE 基因,并經(jīng)PCR、TA 克隆、Sanger 測序、Western blot 和血脂檢測鑒定ApoE 靶向敲除驗證,已經(jīng)成功建立F0代ApoE-/-模型兔,且可穩(wěn)定遺傳。相對于傳統(tǒng)的ZENS、TALEN 等基因編輯技術(shù),CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)具有操作簡單、敲除效率高、多位點同時進行等優(yōu)點[30]。 Yuan 等[31]人利用多sgRNAs 引導(dǎo)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對兔胚胎LDLR 和ApoE 基因進行編輯,成功建立了低密度脂蛋白受體(LDLR)和/或載脂蛋白(ApoE)基因大片段缺 失 的 兔 敲 除(KO) 模 型。 Lu 等[32]利 用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯低密度脂蛋白受體(LDLR)外顯子7,成功建立了在正常飲食下自發(fā)地引起高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的LDLR-KO 模型兔,這在未來研究AS 以及家族性高脂血癥都起到了十分重要的作用。

除了上述的基因編輯技術(shù),渡邊遺傳性高膽固醇血癥(WHHL)兔,現(xiàn)也常用于AS 研究。 WHHL兔是1973 年發(fā)現(xiàn)的一個突變體,現(xiàn)已證明,WHHL兔體內(nèi)VLDL 殘留物和LDL 不會被肝中LDLR 缺陷的肝細胞攝取,因此WHHL 兔體內(nèi)保持LDL 等脂蛋白形式存在的高水平血漿膽固醇血癥,且該品系相比日本大白兔的血清膽固醇和甘油三酯水平,升高約8～14 倍,除此之外,通過近親交配可以持續(xù)傳代高脂血癥性狀的品系。 隨著科學(xué)的進步,通過CRISPR/Cas9 基因編輯建立的LDLR-KO 以及WHHL 兔會越來越多的應(yīng)用到AS 疾病研究中,將會在心腦血管疾病研究中大放光彩。

4 展望

目前可用于建立AS 模型的動物主要有兔、鼠、豬和猴等,但沒有任何一種動物模型是完美的。 兔是草食性動物,因此通過高脂飼養(yǎng)形成的AS 斑塊纖維帽、脂質(zhì)壞死核心等典型病理變化與人體存在一定的差異。 但是憑借著對外源性膽固醇較高的吸收率,以及對高脂血癥的較低清除力,學(xué)者們依舊偏向于選兔來建立AS 模型。 多年來,國內(nèi)外報道了很多兔AS 模型的建立方法,但大多數(shù)都是建立在高脂喂養(yǎng)和機械損傷的基礎(chǔ)上。 除此之外,還有靜脈注射維生素D、小牛血清白蛋白等方法。 機械損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)建立AS 模型雖然應(yīng)用廣泛,但可能會出現(xiàn)黃瘤病樣斑塊等問題。

隨著基因編輯技術(shù)的崛起,相比鼠更接近與人類親緣關(guān)系(基于DNA 序列分析)的兔,相信也會越來越多的應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。 像CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的慢慢興起,可以對兔基因組進行更有效和精確的編輯,以復(fù)制人類疾病建立模型,加快心腦血管等疾病的研究,應(yīng)用前景也更加廣闊。

AS 的發(fā)病機制和病理生理尚未完全闡明,將動物模型的研究應(yīng)用推廣到人類自身仍有許多困難。人體AS 斑塊形成絕非炎癥刺激、自身免疫反應(yīng)等任何一種單一因素所導(dǎo)致。 未來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的道路上,應(yīng)將遺傳、飲食、外界刺激等影響因素結(jié)合起來,建立最接近人體病理生理演變的兔AS 模型,并將兔AS 模型建立與臨床藥物試驗和治療有機結(jié)合,才能對人類AS 研究奠定堅實的基礎(chǔ)。