侯曉蓉，肖玲琳，單偉光

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

醋氯芬酸(Aceclofenac，ACF)是一種新型的非甾體苯醋酸類抗炎癥類藥物制劑，具有較強(qiáng)效的止痛、退熱和抗關(guān)節(jié)炎癥等臨床作用[1]。據(jù)報(bào)道：與其他非甾體抗炎藥物(NSAIDs)相比較，ACF治療指數(shù)更好，對(duì)胃腸道的耐受性更高，胃潰瘍發(fā)病機(jī)率更低，是一種療效好、安全性高的藥物[2-4]，主要用于治療關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎或風(fēng)濕性強(qiáng)直脊椎炎等炎癥性疾病，在臨床治療上具有非常廣闊的應(yīng)用前景[5-6]。由于工藝的改變，會(huì)引入一個(gè)醫(yī)藥中間體醋氯芬酸叔丁酯(Aceclofenac tert-butyl ester)[7-8]。醋氯芬酸叔丁酯作為醋氯芬酸的關(guān)鍵中間體，在醋氯芬酸原料藥或制劑中屬于有關(guān)物質(zhì)，對(duì)藥品的質(zhì)量會(huì)造成一定的影響。因此需要對(duì)醋氯芬酸生產(chǎn)工藝中的中間體醋氯芬酸叔丁酯進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)，以確保醋氯芬酸的質(zhì)量。在國(guó)內(nèi)外的研究中，有大量對(duì)醋氯芬酸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，但針對(duì)醫(yī)藥中間體醋氯芬酸叔丁酯目前還沒(méi)有相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。因此建立一種醋氯芬酸叔丁酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)方法尤為重要。藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法有滴定法、色譜法和燃燒法等。其中色譜法由于其專屬性好、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于各類藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)[9-11]。筆者通過(guò)參照中國(guó)藥典[12]和文獻(xiàn)[13]中對(duì)醋氯芬酸制劑的相關(guān)檢測(cè)方法，建立一套適用于醫(yī)藥中間體醋氯芬酸叔丁酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)的液相色譜方法。

1 儀器與試劑

UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津)；UltiMate 3000液相色譜儀(賽默飛)；XS205十萬(wàn)分之一天平(Mettler toledo)；醋氯芬酸叔丁酯原料藥3 批(浙江尖峰藥業(yè)提供)；醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，99.6%)；乙腈試劑(Tedia，色譜級(jí))；磷酸試劑(阿拉丁，色譜級(jí))，其余相關(guān)試劑均為分析級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Utimate ODS-3(規(guī)格250 mm×4.6 mm，5 μm)；色譜儀的柱溫箱穩(wěn)定在25 ℃；紫外波長(zhǎng)設(shè)置為235 nm；流動(dòng)相：A相為磷酸鹽緩沖液(0.112 mg/mL磷酸水溶液，NaOH試液調(diào)節(jié)pH為7.0)，B相為V(純凈水)∶V(乙腈)=10∶90的溶液；采用梯度模式進(jìn)行洗脫，洗脫過(guò)程設(shè)置為0～25 min，0.080 mg/mL的A相→0.057 mg/mL的A相；25～30 min，0.057 mg/mL的A相→0.024 mg/mL的A相；30～60 min，0.024 mg/mL的A相；60～62 min，0.024 mg/mL的A相→0.080 mg/mL的A相；62～65 min，0.080 mg/mL的A相；流動(dòng)相速度設(shè)置為0.9 mL/min；液相色譜單次進(jìn)樣量為10 μL；稀釋溶劑為V(流動(dòng)相A)∶V(流動(dòng)相B)=3∶7。

2.2 溶液的配制

將10 mg醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品置于10 mL容量瓶中，用溶劑溶解后，定容，搖勻，配制成1.0 mg/mL的溶液。將1 mL配制好的對(duì)照品溶液移取到25 mL 容量瓶中，加入溶劑至恒定位置并搖勻，制成40 μg/mL的溶液，作為醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品溶液。將100 mg醋氯芬酸叔丁酯供試品置于容量瓶中，加入稀釋溶劑至100 mL，搖勻，配制成1.0 mg/mL的溶液。準(zhǔn)確取上述醋氯芬酸叔丁酯溶液1 mL 放置于25 mL容量瓶中，加入稀釋溶劑至刻度并搖勻，配制成40 μg/mL的溶液，作為供試品溶液。取適量稀釋溶劑，過(guò)濾，裝入樣品瓶，然后將其作為陰性空白對(duì)照溶液。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

量取醋氯芬酸叔丁酯供試品溶液和對(duì)照品溶液，在紫外檢測(cè)器中200～400 nm波長(zhǎng)范圍下對(duì)其進(jìn)行吸收值掃描，扣除空白溶劑影響，結(jié)果顯示：待測(cè)試液溶液在235 nm處有最大吸收值，故確定235 nm為醋氯芬酸叔丁酯的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1 干擾性試驗(yàn)

10 μL醋氯芬酸叔丁酯的對(duì)照品溶液以及供試品溶液和空白溶劑溶液過(guò)濾后分別進(jìn)入液相檢測(cè)器，并記錄相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果圖譜，通過(guò)結(jié)果對(duì)比顯示，主峰的測(cè)定未被干擾。

2.4.2 強(qiáng)制破壞試驗(yàn)

取500 mg醋氯芬酸叔丁酯供試品于容量瓶中，添加稀釋溶劑定容至50 mL，搖勻，作為破壞性試驗(yàn)的備用試液。取6 份2 mL的試液，分別置于20 mL容量瓶中，在不同條件下強(qiáng)制進(jìn)行破壞測(cè)試。試驗(yàn)溶液具體分為1) 未破壞樣品；2) 酸破壞：加入1 mL備好的1.0 mol/L 鹽酸溶液，充分搖勻，于室溫25 ℃左右放置1 h，用堿中和；3) 堿破壞：加入濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液約0.1 mL，充分搖勻，于室溫25 ℃左右放置0.15 h，用酸中和；4) 氧化破壞：加入提前配制好的3% H2O2溶液約1 mL，在室溫條件下約放置1 h；5) 高溫破壞：置于80 ℃烘烤箱中加熱10 h(加熱過(guò)程中若溶劑蒸發(fā)，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)加適量甲醇，使樣品處于溶液狀態(tài))；6) 光照：在(4 500±500) lx條件下持續(xù)光照7 h。將上述6 種溶液用溶劑稀釋至恒定體積并搖勻，然后按照2.1節(jié)設(shè)定的色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在各項(xiàng)破壞條件下，該方法可較好地分離主成分峰與相關(guān)雜質(zhì)峰，該液相檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量的醋氯芬酸叔丁酯供試品，溶解在溶劑中，配制成每1 mL溶液中約含0.1 mg醋氯芬酸叔丁酯的供試品溶液，在室溫約25 ℃條件下，將其放置24 h左右，定時(shí)采樣，然后根據(jù)2.1節(jié)設(shè)定的色譜條件進(jìn)行分析。按藥典中的外標(biāo)法以醋氯芬酸叔丁酯峰面積計(jì)算出質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果表明：醋氯芬酸叔丁酯穩(wěn)定性試驗(yàn)其峰面積的RSD為0.55%；該供試品溶液配制完成后，放置24 h內(nèi)峰面積基本無(wú)變化，表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定所用溶液的穩(wěn)定性良好。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

取適量的醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品溶液，過(guò)濾后，依次測(cè)定5 針(每針進(jìn)樣10 μL)，并記錄相關(guān)色譜結(jié)果，計(jì)算該樣品主成分色譜峰面積的RSD值，結(jié)果顯示主成分峰面積的RSD為0.78%，表明該質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法精密度良好。

2.7 線性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取24.96 mg醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品，并置于容量瓶中，加稀釋溶劑準(zhǔn)確溶解至25 mL，得醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品備用試液。分別準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL備用試液于容量瓶中，加稀釋溶劑準(zhǔn)確定容至10 mL，混勻，即得質(zhì)量濃度分別為49.9，74.8，99.8，125，149 μg/mL的對(duì)照品溶液。根據(jù)2.1節(jié)設(shè)定的相關(guān)色譜條件，將上述樣品按質(zhì)量濃度從低到高依次進(jìn)行檢測(cè)，并記錄相關(guān)色譜結(jié)果。由樣品質(zhì)量濃度對(duì)測(cè)得的峰面積作線性回歸方程為：y=1 249.85x+10.89，R2=0.990。結(jié)果表明：醋氯芬酸叔丁酯在 49.9～149 μg/mL范圍內(nèi)，其供試品質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取適量醋氯芬酸叔丁酯供試品，加稀釋溶劑溶解，配制成每1 mL中約含1.0 mg醋氯芬酸叔丁酯的溶液，作為樣品的備用試液。同法配制1.0 mg/mL的醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品備用試液。移取對(duì)照品備用試液300，500，700 μL至對(duì)應(yīng)容量瓶中，再分別移取0.5 mL供試品儲(chǔ)備試液至容量瓶中，并加稀釋溶劑定容至10 mL，可得3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的供試品溶液。上述各質(zhì)量濃度的溶液分別配制3 份。根據(jù)2.1節(jié)色譜條件對(duì)9 個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算出樣品的加樣回收率以及RSD值。結(jié)果顯示：該試驗(yàn)的加樣回收率平均值為100.07%，RSD為1.07%，表明該質(zhì)量分?jǐn)?shù)的液相測(cè)定方法準(zhǔn)確度符合規(guī)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取6 份醋氯芬酸叔丁酯供試品，按照2.2節(jié)方法將其配制成供試品溶液；再準(zhǔn)確稱取10 mg醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品，按照2.2節(jié)所示方法將其配制成對(duì)照品溶液。并根據(jù)2.1節(jié)所設(shè)定的相關(guān)液相色譜條件，每個(gè)樣品各進(jìn)2 針，記錄色譜峰面積。計(jì)算結(jié)果顯示：該峰面積的RSD為0.69%，表明該檢測(cè)方法的可重復(fù)性較好。

2.10 耐用性試驗(yàn)

通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的流速、柱溫箱的溫度以及色譜柱的品牌型號(hào)等研究該方法的耐用性。液相條件輕微改動(dòng)如下：流速由1.0 mL/min變化±0.2 mL/min，柱溫由25 ℃變化±5 ℃，色譜柱的品牌類型由Ultimate ODS-3改為Agilent Eclipse XDB-C18和Shim-pack VP-ODS。根據(jù)2.1節(jié)設(shè)定的色譜條件分別注入供試樣品，記錄相關(guān)色譜結(jié)果，并與原方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算RSD值，條件和結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：各種因素的輕微變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有明顯影響，則表明該液相色譜方法的耐用性較好。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果匯總

2.11 樣品測(cè)定

取3 批次醋氯芬酸叔丁酯供試品適量，用稀釋溶劑配制成每1 mL溶液中含0.1 mg醋氯芬酸叔丁酯的供試品溶液，根據(jù)2.1節(jié)所設(shè)定的色譜條件，將過(guò)濾后的供試品注入色譜儀中進(jìn)行測(cè)定。另以相同方式對(duì)醋氯芬酸叔丁酯對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)根據(jù)峰面積按藥典中規(guī)定的外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：3 批次自制醋氯芬酸中間體樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于99%。

表3 醋氯芬酸叔丁酯樣品HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，在特定波長(zhǎng)(200～400 nm)范圍內(nèi)對(duì)供試品進(jìn)行UV波長(zhǎng)掃描，排除溶劑峰的干擾，其在235 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收值，因此將醋氯芬酸叔丁酯的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為235 nm。由于該試驗(yàn)樣品溶于乙腈、甲醇等溶劑，通過(guò)試驗(yàn)篩選后，確定該試驗(yàn)流動(dòng)相為乙腈和磷酸鹽緩沖液。按照要求對(duì)該液相方法進(jìn)行了一系列的方法學(xué)考察。結(jié)果顯示：在49.9～149 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.990)，準(zhǔn)確度RSD為1.07%，精密度RSD為0.78%，表明該液相方法具有較優(yōu)異的特異性、精密度、線性、準(zhǔn)確度、可重復(fù)性和耐用性。該方法可作為醫(yī)藥中間體醋氯芬酸叔丁酯的質(zhì)量控制方法，并可為醋氯芬酸藥物制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。