王宗秀,戴霞,葉珂禎,陳熙,張煒

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

碳基納米材料(carbon-based nanomaterials,CBN)具有比表面積大、強(qiáng)度及韌性高、光電性能優(yōu)等特點(diǎn),在人工光合作用、生物傳感器、生物成像、基因及藥物載體等方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。盡管許多研究證明碳基納米材料具有不同程度的生物毒性,但均呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng),而且對(duì)其進(jìn)行表面功能化改性可以有效降低毒性,提高生物相容度[1]。近年來(lái),植物與納米材料的相互作用引起了人們的廣泛關(guān)注。Liu等[2]證明單壁碳納米管(SWCNT)可以穿透煙草懸浮細(xì)胞的細(xì)胞壁和質(zhì)膜定位于細(xì)胞質(zhì);用植物細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑(wortmannin)處理可以顯著降低其在細(xì)胞質(zhì)中的定位,提示SWCNT可能是通過(guò)液相內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。Kwak等[3]利用殼聚糖-SWCNT復(fù)合物作為載體實(shí)現(xiàn)葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明殼聚糖-SWCNT利用表面攜帶的高電荷穿過(guò)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和葉綠體被膜,定位在葉綠體。目前的研究表明,CBN對(duì)植物生長(zhǎng)的影響與其化學(xué)結(jié)構(gòu)、大小、形狀、濃度和表面積密切相關(guān)。例如,帶負(fù)電荷的多壁碳納米管(MWCNT)比帶正電荷的MWCNT能夠更有效地促進(jìn)種子萌發(fā)[4],而較高濃度的MWCNT會(huì)產(chǎn)生毒性效應(yīng),導(dǎo)致紅莧菜根長(zhǎng)減少[5]。氧化石墨烯(GO)對(duì)藻類(lèi)的生物毒性則主要體現(xiàn)在遮光效應(yīng)、氧化脅迫和機(jī)械損傷等方面[6]。Wang等[7]在可見(jiàn)光照射下研究了表面沉積有硫化鎘納米顆粒的大腸桿菌的產(chǎn)氫能力,發(fā)現(xiàn)光催化硫化鎘納米顆粒激發(fā)的光電子與大腸桿菌產(chǎn)氫途徑發(fā)生了相互作用,胞內(nèi)乳酸發(fā)酵受到抑制,導(dǎo)致丙酮酸和甲酸濃度增加,NADH/NAD比例升高,產(chǎn)氫酶活性提升,進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)氫量顯著增加。

作為生物制氫的優(yōu)勢(shì)藻種,萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)因其以乙酸鹽為唯一碳源的非光合生長(zhǎng)能力和在厭氧環(huán)境下的高氫化酶活性而受到人們的關(guān)注[8]。目前,在萊茵衣藻體系中促進(jìn)光合產(chǎn)氫主要在供氧水平和電子調(diào)節(jié)水平兩個(gè)方面進(jìn)行。在供氧水平上,萊茵衣藻培養(yǎng)基中硫缺乏會(huì)影響光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中D1蛋白的周轉(zhuǎn),從而降低光合作用效率[9-10]。但與此同時(shí),缺硫并不影響衣藻的呼吸速率,這樣呼吸耗氧維持不變,光合放氧逐漸下降,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)逐漸形成厭氧環(huán)境,厭氧條件有效誘導(dǎo)氫化酶表達(dá),進(jìn)而增加產(chǎn)氫量。在缺硫培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,其他微生物如日本慢生大豆根瘤菌和萊茵衣菌共培養(yǎng)可以提高產(chǎn)氫量[11]。在電子調(diào)節(jié)水平上,Tolleter等[12]自萊茵衣藻中分離了PGRL1蛋白缺失突變體,該突變體中圍繞光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)的環(huán)式電子流受到抑制,導(dǎo)致更多電子流向氫化酶,因此在缺氧條件下,該突變體的產(chǎn)氫量大幅增加。此外人們還發(fā)現(xiàn),Rubisco缺失導(dǎo)致CO2固定減少,更多的電子流向氫化酶,從而有效增加氫的產(chǎn)生[13]。Giraldo等[14]的研究已證明,SWCNT可定位于植物葉綠體并促進(jìn)光合活性,同時(shí)也提高最大電子傳遞速率。然而,CBN對(duì)藻類(lèi)光合產(chǎn)氫是否具有同樣的促進(jìn)作用,目前尚不清楚。

前期研究中我們分析了單鏈DNA修飾的SWCNT對(duì)萊茵衣藻光合產(chǎn)氫的影響,初步證明ssDNA/SWCNT可有限提高光合產(chǎn)氫量[15]。本研究選擇了3種具有良好水溶性的碳納米管,即ssDNA修飾的單壁碳納米管(ssDNA/SWCNT)、羧基修飾的多壁碳納米管(MWCNT)和氧化石墨烯(GO),分別與衣藻細(xì)胞共培養(yǎng),分析3種不同類(lèi)型CBN對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)和光合活性的影響,闡明不同類(lèi)型CBN影響萊茵衣藻光合產(chǎn)氫的機(jī)制,為利用萊茵衣藻高效產(chǎn)氫提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SWCNT:純度95%,外徑×長(zhǎng)度為(0.8～1.2)nm×(0.1～1.0)μm,購(gòu)自南京XFNANO材料科技有限公司。MWCNT:純度>95%,外徑×長(zhǎng)度為(8～15)nm×50 μm,—COOH含量為2.56%。GO:純度>98%,厚度為(0.55～1.20)nm,尺寸為(0.5～3.0)μm,層數(shù)<3,購(gòu)自成都有機(jī)化工有限公司。單鏈DNA聚(AT)15和ssDNA-HEX由通用生物系統(tǒng)公司(中國(guó))合成。萊茵衣藻GY-D55購(gòu)自上海光宇生物科技有限公司。其他化學(xué)物質(zhì)均為分析純。

1.2 碳基納米材料(CBN)懸浮物的制備

ssDNA/SWCNT的制備參照文獻(xiàn)[16-18]。將1 mg SWCNT添加至1 mL ssDNA(MilliQ水溶解)溶液,將所得溶液置于冰上并用超聲波處理1 h,然后以12 000 r·min-1離心30 min,以去除獨(dú)立SWCNT。然后溶液通過(guò)離心管(截留相對(duì)分子質(zhì)量為1×105,Millipore)以4 500 r·min-1超濾15 min,以去除未結(jié)合的游離ssDNA。在不添加任何分散劑的情況下,在MilliQ水中分別制備濃度為1 mg·mL-1的MWCNT和GO懸浮液,并在室溫下超聲處理30 min,然后以12 000 r·min-1離心30 min,去除上清液后將納米材料重新懸浮。懸浮液在使用前均在紫外光下處理30 min以上。

1.3 CBN 懸浮物的鑒定

采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(BIOMATE 3S,Thermo Fisher Scientific,USA)測(cè)定200～800 nm SWCNT和ssDNA/SWCNT懸浮液的吸收波長(zhǎng)。3種納米材料懸浮液的形貌用裝備CCD相機(jī)的透射電子顯微鏡(Hitachi H7650,Japan)觀察。用拉曼光譜儀(InVia,Renishaw,England)測(cè)定3種材料懸浮液中碳結(jié)構(gòu)缺陷程度。用Zetasizer納米分析儀(Zetasizer Nano ZS90,Malvern panalytic,UK)表征3種材料懸浮液的電荷分布。

1.4 萊茵衣藻的培養(yǎng)

萊茵衣藻GY-D55藻株在TAP(tris-acetate-phosphate,pH7.2)瓊脂平板或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行光異養(yǎng)培養(yǎng)。培養(yǎng)物在恒溫(25.0±0.5) ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光/暗時(shí)間為14 h/10 h,冷白色熒光強(qiáng)度約為 60 μmol·m-2·s-1,每6 d在液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1次。培養(yǎng)物每天搖動(dòng)3次,并在培養(yǎng)箱中仔細(xì)定位以盡量減少任何可能的光照和溫度變化,并確保最佳生長(zhǎng)。固體培養(yǎng)基上的藻種每2周接種1次。制備缺硫TSP培養(yǎng)基(TAP-S)時(shí)硫酸鹽化合物用氯化物替代。

1.5 萊茵衣藻與CBN共培養(yǎng)

衣藻培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)后期離心收集,用TAP培養(yǎng)基洗滌3次,然后在新鮮TAP培養(yǎng)基中重懸至5×105mL-1,然后將3種納米材料懸浮液與衣藻細(xì)胞分別混合,以不添加納米材料的細(xì)胞培養(yǎng)物為對(duì)照。所有培養(yǎng)物在(25.0±0.5) ℃、60 μmol·m-2·s-1光照下培養(yǎng)6 d,3種納米材料的懸浮液質(zhì)量濃度分別設(shè)置為1、2、10、50或100 μg·mL-1。

1.6 CBN對(duì)萊菌衣藻生長(zhǎng)的影響

3種納米材料分別與萊茵衣藻共培養(yǎng)不同時(shí)間后,用95%乙醇提取衣藻細(xì)胞總?cè)~綠素,用分光光度法測(cè)定其含量。利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)每隔24 h測(cè)定750 nm處的光密度(D),同時(shí)在光鏡下觀察細(xì)胞聚集情況。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 CBN在萊茵衣藻細(xì)胞中的分布

為了研究CBN在C.reinhardtii細(xì)胞中的分布,將羅丹明B(RhoB,1 mg·mL-1,0.3 mL)與CBN(0.1 mg·mL-1,5 mL)在25 ℃的培養(yǎng)箱搖瓶中混合,未結(jié)合的RhoB用蒸餾水透析48 h去除,制備的混合物在4 ℃保存后使用。C.reinhardtii細(xì)胞與制備的混合物以終濃度為10 μg·mL-1孵育,并使用激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal System-UitraView VOX,Perkin Elmer)在指數(shù)期進(jìn)行觀察。

1.8 葉綠素?zé)晒夂蜌浜繙y(cè)定

暗適應(yīng)PSⅡ最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)和電子傳輸速率(ETR)采用脈沖調(diào)制成像PAM M系列熒光計(jì)(MAXI-version,Heinz Walz GmbH,Effeltrich,Germany)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量前將細(xì)胞樣本置于成像系統(tǒng)攝像機(jī)下進(jìn)行30 min暗適應(yīng)。測(cè)量光、光化光和飽和脈沖光強(qiáng)度分別為0.25、110和 6 000 μmol·m-2·s-1。將3種CBN的懸浮液按終質(zhì)量濃度10 μg·mL-1與萊茵衣藻共培養(yǎng)7 d,使用葉綠素?zé)晒夥y(cè)定Fv/Fm和ETR。

衣藻細(xì)胞分別與3種10 μg·mL-1CBN在TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在指數(shù)晚期離心收集藻細(xì)胞,用缺硫TAP-S培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌,以保證徹底除硫。重懸后測(cè)定葉綠素含量,將清洗后的細(xì)胞放入柱形玻璃瓶中并用氣密隔膜密封,在黑暗中培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)厭氧條件。從第2天起,將密封瓶子放置在 60 μmol·m-2·s-1的連續(xù)光照下,利用注射器從瓶子頂部收集逸出的氣體,并注入帶有熱導(dǎo)檢測(cè)器的氣相色譜(GC7890,Techcomp)中檢測(cè)H2濃度。以氬氣作載氣,用外標(biāo)法計(jì)算H2體積。所有測(cè)量均獨(dú)立進(jìn)行3次。

1.9 [Fe-Fe]氫化酶活性和光合放氧活性測(cè)定

體內(nèi)氫化酶活性測(cè)定采用文獻(xiàn)[19-20]的方法。試驗(yàn)前測(cè)氫管充氬氣1 min,然后立即用橡皮塞密封以清除瓶中的氧氣。在7、11和14 d分別測(cè)定相應(yīng)樣品細(xì)胞中的氫化酶活性。用注射器將5 mL培養(yǎng)物樣品注入測(cè)氫管,用蠟密封后在光照下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)1 h,然后用微注射器抽取瓶中0.5 mL氣體,用氣相色譜法進(jìn)行分析。根據(jù)測(cè)氫管中的總?cè)~綠素含量計(jì)算產(chǎn)氫率。

用Clark氧電極(Lab-2,Hansatech,UK)在25 ℃下測(cè)量衣藻培養(yǎng)物中的放氧速率。從培養(yǎng)物中取 2 mL 細(xì)胞樣本放置在氧電極室中,添加0.5 mol·L-1NaHCO3后,在60 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度下照射 5 min,然后記錄初始放氧水平用于計(jì)算光合速率。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 多壁碳納米管(MWCNT)和氧化石墨烯(GO)的性質(zhì)鑒定

ssDNA/SWCNT、MWCNT和GO的zeta電位分別為(-56.85±0.93)、(-32.97±1.19)和(-43.20±0.56)mV,表明MWCNT和GO由于其結(jié)構(gòu)中存在親水的—COOH或—OH基團(tuán),因此可以穩(wěn)定地分散在水溶液中。3種CBN在水溶液中的分散度從大到小依次為ssDNA/SWCNT、GO、MWCNT。

MWCNT和GO懸浮液的拉曼光譜分別在1 586 cm-1顯示出特征性G-帶,在1 336 cm-1顯示出特征性D-帶(圖1-A)。相比較而言,ssDNA/SWCNT的拉曼光譜中存在相對(duì)高強(qiáng)度的D-帶,這與ssDNA處理導(dǎo)致的納米管壁缺陷相關(guān)。ssDNA/SWCNT、MWCNT和GO的ID/IG比值分別為0.17、0.81和0.79,表明3種CBN的純度從大到小依次為ssDNA/SWCNT、GO、MWCNT。進(jìn)一步利用透射電鏡(TEM)分析ssDNA/SWCNT、MWCNT和GO懸浮液的形貌和粒徑(圖1-B)。經(jīng)羧基化的MWCNT外徑為8～15 nm,長(zhǎng)度約為50 μm,顯著大于ssDNA/SWCNT的外徑(0.8～1.2 nm)和長(zhǎng)度(0.1～1.0 μm);GO小于3層,橫向尺寸為0.5～3.0 μm。綜上所述,化學(xué)改性提高了CBN的純度和溶解度,適于進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)的研究。

圖1 碳基納米材料的性質(zhì)鑒定Fig.1 Characterization of the carbon-based nanomaterials(CBN) A. ssDNA/SWCNT、MWCNT及GO的拉曼光譜;B. ssDNA/SWCNT、 MWCNT和GO的高分辨透射電子顯微鏡圖。A. Raman spectra of single-stranded DNA wrapped single-walled carbon nanotube(ssDNA/SWCNT),multi-walled carbon nanotube(MWCNT)and graphene oxide(GO);B. High-resolution TEM images of ssDNA/SWCNT,MWCNT and GO.

2.2 CBN在萊茵衣藻細(xì)胞中的分布

從圖2可知:共培養(yǎng)的藻細(xì)胞與對(duì)照相比,除了葉綠體的自發(fā)熒光外,Rho B熒光在細(xì)胞質(zhì)中呈點(diǎn)狀分布,顯示CBN能夠穿過(guò)衣藻細(xì)胞壁和質(zhì)膜,定位于細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)一步將CBN與衣藻共培養(yǎng)3 d,經(jīng)透射電鏡觀察3種CBN在衣藻細(xì)胞中的分布。與對(duì)照相比,與CBN共培養(yǎng)的衣藻細(xì)胞的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間隙和細(xì)胞質(zhì)中均可檢測(cè)到CBN顆粒(圖3),證明3種CBN經(jīng)與萊茵衣藻共培養(yǎng),均能定位在細(xì)胞質(zhì)。

圖2 CBN/Rho B在萊茵衣藻細(xì)胞中的分布Fig.2 Distribution of CBN/Rho B in Chlamydomonas reinhardtii

圖3 萊茵衣藻與碳基納米材料孵育前、后的透射電子顯微鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy images of C.reinhardtii cells incubated with/without three CBN a. 高倍視野下衣藻細(xì)胞(對(duì)照);b—d. 衣藻細(xì)胞分別與10 μg·mL-1 ssDNA/SWCNT、MWCNT和GO孵育。Cw:細(xì)胞壁;Cm:細(xì)胞膜;Cy:細(xì)胞質(zhì);Thy:類(lèi)囊體。紅色箭頭所指為納米材料。a. High-magnification view of the cells(control);b-d. The cells incubated with 10 μg·mL-1 ssDNA/SWCNT,MWCNT and GO,respectively. Cw:Cell wall;Cm:Cell membrane;Cy:Cytoplasm;Thy:Thylakoid. Red arrows indicate the CBN.

2.3 MWCNT和GO對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)及光合活性的影響

3種CBN對(duì)衣藻生長(zhǎng)具有抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)。與對(duì)照相比,在2 μg·mL-1或更低濃度下,3種CBN對(duì)衣藻的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響(結(jié)果未列出)。從圖4可見(jiàn):在10 μg·mL-1時(shí),3種CBN均一定程度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞聚集。與ssDNA/SWCNT類(lèi)似,MWCNT處理后細(xì)胞生長(zhǎng)密度和葉綠素含量只有輕微下降,但GO處理前期,藻細(xì)胞生長(zhǎng)密度以及葉綠素含量明顯低于對(duì)照(圖4-A),說(shuō)明GO相較碳納米管對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制更加明顯。然而,隨著共培養(yǎng)3～4 d后,衣藻生長(zhǎng)逐漸恢復(fù),細(xì)胞生長(zhǎng)密度及葉綠素含量達(dá)到或接近對(duì)照水平。形態(tài)觀察也證明,在共培養(yǎng)前期,GO誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生聚集,培養(yǎng)3～4 d后,細(xì)胞團(tuán)聚現(xiàn)象逐漸消失(圖4-B)。

我們進(jìn)一步研究了MWCNT和GO對(duì)萊茵衣藻光合作用的影響。CBN在培養(yǎng)前期,ssDNA/SWCNT和GO分別處理的藻細(xì)胞最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)低于對(duì)照細(xì)胞(圖5-A),表明GO和ssDNA/SWCNT具有比MWCNT更強(qiáng)的光合活性抑制能力。已有研究表明,Fv/Fm對(duì)某些環(huán)境應(yīng)力不敏感,因此我們又采用電子傳遞速率(ETR)評(píng)估3種CBN對(duì)光合活性的影響(圖5-B)。共培養(yǎng)7 d時(shí),與其他2種CBN相比,GO處理的藻細(xì)胞ETR顯著降低。綜合上述結(jié)果表明,GO具有比MWCNT更強(qiáng)的光合活性抑制能力。

圖5 碳基納米材料對(duì)正常生長(zhǎng)條件下萊茵衣藻光合活性的影響Fig.5 Effect of the CBN on photosynthetic activity of C.reinhardtii in TAP medium**P<0.01,***P<0.001. The same as follows.

2.4 缺硫培養(yǎng)條件下MWCNT和GO對(duì)萊茵衣藻光合活性的影響

對(duì)照培養(yǎng)物在缺硫密閉的條件下,藻細(xì)胞PSⅡ的活力逐漸降低,培養(yǎng)7 d時(shí),Fv/Fm和ETR分別僅為0.49和3.17,共培養(yǎng)物中,MWCNT、GO和ssDNA/SWCNT進(jìn)一步降低了藻細(xì)胞的Fv/Fm和ETR(圖6),而且加入GO的共培養(yǎng)物在培養(yǎng)11 d后,已檢測(cè)不到Fv/Fm和ETR(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖6 碳基納米材料對(duì)缺硫培養(yǎng)條件下萊茵衣藻光合活性的影響Fig.6 Effects of the CBN on photosynthetic activity of C.reinhardtii in TAP-S medium*P<0.05. The same as follows.

為了進(jìn)一步研究MWCNT和GO對(duì)衣藻光合產(chǎn)氫的影響,我們用氧電極測(cè)定缺硫條件下共培養(yǎng)藻細(xì)胞的凈光合速率。由于在缺硫條件下培養(yǎng)藻細(xì)胞的PSⅡ活性和光合放氧受到嚴(yán)重抑制(圖6),凈光合速率顯示為負(fù)值,表明在缺硫條件下衣藻細(xì)胞的呼吸速率大于光合放氧速率。在培養(yǎng)1 d時(shí),共培養(yǎng)物的凈光合速率就低于對(duì)照組,尤其是添加GO的藻細(xì)胞凈光合速率更低。說(shuō)明在培養(yǎng)前期缺硫效應(yīng)的基礎(chǔ)上,MWCNT和GO進(jìn)一步降低了藻細(xì)胞的PSⅡ活性,造成光合放氧速率下降,從而誘導(dǎo)衣藻細(xì)胞加快建立缺氧狀態(tài)。

2.5 MWCNT和GO對(duì)萊茵衣藻光合產(chǎn)氫的影響

已知?dú)浠傅谋磉_(dá)受無(wú)氧條件誘導(dǎo),根據(jù)上述研究結(jié)果,我們測(cè)定了產(chǎn)氫條件下萊茵衣藻氫化酶活性。結(jié)果(圖7)表明:在缺硫培養(yǎng)最初4 d內(nèi),MWCNT和GO共培養(yǎng)衣藻細(xì)胞及對(duì)照衣藻細(xì)胞的氫化酶活性幾乎檢測(cè)不到(數(shù)據(jù)未顯示),MWCNT和GO共培養(yǎng)7 d時(shí),衣藻細(xì)胞內(nèi)氫化酶活性顯著高于對(duì)照組,這與缺硫條件下MWCNT和GO抑制萊茵衣藻的光合活性相一致,證明加快建立缺氧狀態(tài)是誘導(dǎo)氫化酶表達(dá)的先決條件。未經(jīng)CBN處理的對(duì)照組和MWCNT處理組的衣藻細(xì)胞,培養(yǎng)11 d時(shí),它們的氫化酶活性最高,隨后呈下降趨勢(shì)。在培養(yǎng)7 d時(shí),GO和ssDNA/SWCNT處理組藻細(xì)胞的氫化酶活性最高。

圖7 碳基納米材料對(duì)缺硫培養(yǎng)條件下萊茵衣藻氫化酶活性及光合產(chǎn)氫的影響Fig.7 Effect of CBN on hydrogenase activity and photosynthetic hydrogen production of C.reinhardtii in TAP-S medium

由圖7可知:對(duì)照組在缺硫培養(yǎng)前4 d基本沒(méi)有氫的釋放,隨后開(kāi)始迅速增加,14 d時(shí)產(chǎn)氫量達(dá)205.87 μL·mg-1。與對(duì)照相比,MWCNT、GO及ssDNA/SWCNT處理均提高了衣藻的產(chǎn)氫量。在缺硫培養(yǎng)7 d時(shí),ssDNA/SWCNT或MWCNT共培養(yǎng)物的產(chǎn)氫量(179.10和100.53 μL·mg-1)分別比對(duì)照(78.22 μL·mg-1)高2.2和1.2倍,GO共培養(yǎng)物的產(chǎn)氫量(357.52 μL·mg-1)比對(duì)照高4.5倍左右。共培養(yǎng)物繼續(xù)在缺硫條件下密閉培養(yǎng),產(chǎn)氫量持續(xù)增加,但增幅減緩,培養(yǎng)14 d后,ssDNA/SWCNT、MWCNT和GO共培養(yǎng)物的產(chǎn)氫量分別為289.12、205.58和519.83 μL·mg-1,分別是對(duì)照的1.3、0.9和2.4倍。

3 討論

隨著納米材料的應(yīng)用,其對(duì)土壤、水體、有機(jī)體和食品的影響已引起廣泛關(guān)注。衣藻中的研究主要集中在納米材料在細(xì)胞中的積累以及其對(duì)衣藻生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)、群體結(jié)構(gòu)和光合作用的影響,以此作為評(píng)估納米材料對(duì)水體污染的一項(xiàng)指標(biāo)。目前CBN毒性作用主要?dú)w因于納米材料中金屬催化劑的含量與類(lèi)型、團(tuán)聚程度與種類(lèi)、物理特征(如形狀和表面積)等[21-22]。研究表明,對(duì)納米顆粒進(jìn)行修飾以提高純度,改善可溶性和分散度是降低或避免毒性的重要方法。R?hder 等[23]研究結(jié)果表明,團(tuán)聚態(tài)納米顆?？稍斐梢略寮?xì)胞中活性氧的形成,并輕度抑制光合作用;相反,可溶性分散態(tài)的納米顆粒對(duì)衣藻的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。本研究中,經(jīng)單鏈DNA和羧基修飾后的單壁碳納米管和多壁碳納米管純度及在水溶液中的分散度提高,微觀結(jié)構(gòu)缺陷度減少,對(duì)于萊茵衣藻在正常條件下的生長(zhǎng)僅有輕微抑制,這進(jìn)一步證明碳基納米材料對(duì)細(xì)胞的毒性與其生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)(如金屬氧化物和無(wú)定形碳)密切相關(guān)[24]。對(duì)納米材料進(jìn)行純化并提高其在溶液中的可溶性和穩(wěn)定性,可以有效降低細(xì)胞毒性,擴(kuò)大其在生物體系中的應(yīng)用。

氧化石墨烯在水溶液中具有良好的分散性及表面反應(yīng)活性,因此對(duì)水生生物的毒性研究也是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。Yin等[6]系統(tǒng)觀察氧化石墨烯對(duì)綠藻、藍(lán)藻、硅藻的毒性,證明萊茵衣藻是對(duì)氧化石墨烯最具耐受性的藻種。本研究中,10 μg·mL-1氧化石墨烯對(duì)衣藻細(xì)胞密度、葉綠素含量的影響有限,處理早期會(huì)引起衣藻細(xì)胞發(fā)生一定程度的團(tuán)聚,但培養(yǎng)后期團(tuán)聚現(xiàn)象逐漸消失。Wang等[25]研究TiO2和QDs NMs對(duì)萊茵衣藻的毒性,也觀察到類(lèi)似的生長(zhǎng)恢復(fù)現(xiàn)象。這些特征表明氧化石墨烯在用于萊茵衣藻生物產(chǎn)氫方面具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

正常生理?xiàng)l件下綠藻的產(chǎn)氫過(guò)程只能短暫出現(xiàn),因此,目前通用的產(chǎn)氫條件就是對(duì)衣藻進(jìn)行缺硫脅迫。在此基礎(chǔ)上,人們提出不同方法來(lái)進(jìn)一步提高缺硫狀態(tài)下的萊茵衣藻產(chǎn)氫,例如優(yōu)化衣藻培養(yǎng)物的葉綠素濃度、培養(yǎng)基組成、光照和pH。Giraldo等[14]發(fā)現(xiàn)葉綠體定位的SWCNT顯著提高植物葉片的光合作用活性,最大電子傳遞速率提高30%。本研究發(fā)現(xiàn),不同類(lèi)型的碳納米管和氧化石墨烯在光照條件下并沒(méi)有增加衣藻葉綠體中的電子產(chǎn)量及最大電子傳遞速率,原因可能在于納米材料僅定位在衣藻細(xì)胞質(zhì),沒(méi)有進(jìn)入葉綠體,因此即使納米材料吸收光能并激發(fā)出更多光電子,也無(wú)法有效傳遞至氫化酶。正常生理?xiàng)l件下GO處理的藻細(xì)胞中,PSⅡ的最大光化學(xué)效率和電子傳遞速率顯著低于對(duì)照和碳納米管處理組,顯示GO具有比ssDNA/SWCNT和MWCNT更強(qiáng)的PSⅡ活性抑制能力。缺硫培養(yǎng)條件下,這一抑制效果更加明顯,GO處理組在缺硫培養(yǎng)11 d后,已檢測(cè)不到Fv/Fm和ETR。對(duì)PSⅡ活性的抑制也導(dǎo)致藻細(xì)胞的光合放氧速率小于呼吸速率,GO處理組的凈光合速率顯著低于對(duì)照和碳納米管處理組,證明氧化石墨烯與產(chǎn)氫條件下的衣藻共培養(yǎng),可以加速建立缺氧環(huán)境,為進(jìn)一步提高產(chǎn)氫效率打下基礎(chǔ)。檢測(cè)缺硫培養(yǎng)過(guò)程中氫化酶活性也證明了這一點(diǎn),我們觀察到氫化酶活性在缺硫培養(yǎng)期間經(jīng)歷一個(gè)先升后降的過(guò)程,未經(jīng)處理的衣藻細(xì)胞其氫化酶活性峰值出現(xiàn)在缺硫培養(yǎng)11 d,但GO處理使該峰值提前到7 d,這直接導(dǎo)致氫氣產(chǎn)量比未經(jīng)處理時(shí)提高4.5倍。Volgusheva等[26]的研究證明,缺硫條件下衣藻PSⅡ的活性下降90%以上,但仍保留約9%的水平以完成光照條件下電子的生成和傳遞。衣藻Stm6突變體可以在相同條件下維持25%的PSⅡ活性用于傳遞電子給氫化酶,因此產(chǎn)氫量顯著提升。這也證明,在密閉缺硫的條件下有活性的PSⅡ越多,產(chǎn)氫越多。因此,氫化酶活性峰值提前出現(xiàn)可以在PSⅡ受傷害程度較輕時(shí)獲得更多電子,有利于氫的合成。

值得注意的是,氧化石墨烯促進(jìn)萊茵衣藻光合產(chǎn)氫在缺硫培養(yǎng)7 d后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期,培養(yǎng)14 d時(shí)產(chǎn)氫量?jī)H為對(duì)照的2.4倍。可能的原因在于氧化石墨烯與缺硫條件對(duì)PSⅡ的影響存在疊加效應(yīng),在培養(yǎng)后期PSⅡ的活性持續(xù)下降可能影響了對(duì)氫化酶的電子供應(yīng)。后續(xù)研究將重點(diǎn)優(yōu)化氧化石墨烯的工作濃度,例如將目前的10 μg·mL-1降低到適當(dāng)?shù)臐舛?分析在缺硫培養(yǎng)過(guò)程中氧化石墨烯添加的時(shí)機(jī),以平衡缺氧環(huán)境與PSⅡ活性之間的關(guān)系。

綜上所述,本文對(duì)碳基納米材料進(jìn)行純化及化學(xué)修飾,可以顯著提高其在溶液中的穩(wěn)定性和分散度,減少結(jié)構(gòu)缺陷,進(jìn)而降低其細(xì)胞毒性。親水的多壁碳納米管、氧化石墨烯和經(jīng)修飾的ssDNA/單壁碳納米管可穿過(guò)衣藻細(xì)胞壁及細(xì)胞膜定位在細(xì)胞質(zhì)。在標(biāo)準(zhǔn)光合產(chǎn)氫條件下,上述納米材料均可通過(guò)抑制PSⅡ光合活性、在細(xì)胞內(nèi)提前建立缺氧狀態(tài)、盡快誘導(dǎo)氫化酶活性的方式提高光合產(chǎn)氫量,其中氧化石墨烯促進(jìn)產(chǎn)氫的作用最強(qiáng),可顯著提高光合產(chǎn)氫量達(dá)4倍以上。