王冕,丁羽萱,王堯,王沛,顧振新,楊潤強

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

酚類物質(zhì)是植物主要的次生代謝產(chǎn)物,廣泛分布于水果、蔬菜、谷物、豆類中,其具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、預(yù)防心血管疾病等多種保健功能。目前,酚類物質(zhì)在植物體中的代謝和積累已有大量研究,例如:Tian等[1]發(fā)現(xiàn)發(fā)芽糙米中游離酚類如阿魏酸、香豆酸和芥子酸均明顯高于未發(fā)芽糙米,且不溶性酚類含量增加;Xu等[2]研究發(fā)現(xiàn)燕麥發(fā)芽后香豆酸、阿魏酸和總酚含量顯著增加。此外,在籽粒萌發(fā)階段逆境脅迫可有效提高酚類物質(zhì)含量,例如生菜在100 mmol·L-1NaCl處理12 d后,總酚和類黃酮含量分別增加1.3倍和14.5倍[3];適度的鹽脅迫處理時,烤煙幼苗中綠原酸、類黃酮、花青苷等酚類物質(zhì)含量顯著增加[4];Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn),亞麻籽萌發(fā)第8天時植物化學(xué)成分顯著富集,其中維生素C含量增加22.1倍,酚類物質(zhì)含量增加2.67倍,類黃酮含量增加5.48倍。

乙烯(ETH)參與植物次生代謝過程,可促進生菜、胡蘿卜、綠豆中總酚酸的積累[6]。曲文穎等[7]研究發(fā)現(xiàn),乙烯利可有效促進藍莓果實中黃酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)的積累,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性。劉紅開[8]研究發(fā)現(xiàn),乙烯處理綠豆芽,不僅促進綠豆芽下胚軸的橫向生長,改善其外觀品質(zhì)及營養(yǎng)價值,亦可增強酶促氧化和非酶氧化系統(tǒng),提高SOD、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性。此外,發(fā)芽過程中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)和苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)活性的增加促進酚類物質(zhì)的合成[8]。由此可見,乙烯不僅可有效促進植物芽苗生長發(fā)育,而且作為一種信號分子,促進酚類物質(zhì)的積累及其抗氧化能力的提高。

大豆(GlycinemaxL.)籽粒富含酚類物質(zhì),發(fā)芽過程中會經(jīng)歷復(fù)雜的生理生化變化,使生理活性成分不斷積累,營養(yǎng)價值進一步提高。其中黃酮類物質(zhì)是天然的抗氧化劑,主要分布于大豆種子和胚軸部位,并隨著發(fā)芽過程含量不斷增加;此外,異黃酮、β-葡萄糖苷、γ-氨基丁酸(GABA)[9]等功能性成分較發(fā)芽前大量累積,抗氧化能力進一步提高[10]。研究發(fā)現(xiàn)大豆在發(fā)芽過程中酚類物質(zhì)會發(fā)生不同程度的變化,營養(yǎng)成分也會顯著提高[11]。目前,乙烯對大豆發(fā)芽過程中酚類物質(zhì)的富集過程及其變化情況的研究較少,相關(guān)機制還需深入研究。

因此,本試驗采用不同濃度乙烯利處理大豆芽菜,分析其總酚、總黃酮、酚酸、異黃酮等物質(zhì)的含量,篩選適宜的乙烯利濃度,旨在為高品質(zhì)大豆芽菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

供試大豆品種‘云鶴’,收獲后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。乙烯?有效成分含量≥90%)購自北京索萊寶科技有限公司。

稱取適量顆粒飽滿的大豆種子,先用去離子水洗去浮沉與污漬后,置于1%(體積分數(shù))次氯酸鈉水溶液中浸泡消毒15 min,然后再用去離子水沖洗3～5次至pH呈中性,最后加入去離子水于30 ℃下浸泡6 h。將浸泡后的大豆籽粒均勻鋪在發(fā)芽機(夢飛揚科技有限公司)苗盤上,在30 ℃黑暗條件下恒溫發(fā)芽,分別用濃度為0.025、0.050、0.100和0.500 mmol·L-1的乙烯利培養(yǎng)液處理大豆,以去離子水為對照,每24 h換培養(yǎng)液1次,每次2 L。取處理4 d時的大豆芽菜進行各項指標分析。

1.2 指標測定

芽長:隨機選取25株大豆芽菜,游標卡尺測定其芽長并取平均值。

鮮/干重比:隨機選取大豆芽菜50株,稱鮮重,然后經(jīng)真空冷凍干燥后稱干重。重復(fù)3次,計算鮮/干重比。

呼吸速率:采用小籃子法[12]測定呼吸速率。

酚類物質(zhì)提取:采用Ma等[13]的方法。取發(fā)芽4 d大豆芽菜,經(jīng)真空冷凍干燥,粉碎后過孔徑380 μm的篩得到豆粉,提取游離酚和結(jié)合酚。

總酚含量:采用Ma等[13]的方法測定大豆芽菜的總酚含量?？偡雍恳詻]食子酸(GAE)當量計,單位為mg·100 g-1。結(jié)果以干重計。

酚酸含量:采用Chen等[14]的方法測定大豆芽菜的酚酸含量。結(jié)果以干重計。

總黃酮含量:采用Islam等[15]的方法。稱取0.2 g豆粉,測定大豆芽菜的總黃酮含量?？傸S酮含量以蘆丁(RE)當量計,單位為mg·100 g-1。結(jié)果以干重計。

異黃酮含量:采用Jiao等[16]的方法測定大豆芽菜的異黃酮含量。結(jié)果以干重計。

2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)自由基清除能力的測定:參考Islam等[17]的方法。將7 mmol·L-1ABTS與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀等體積混合,室溫下避光反應(yīng)12～16 h,用純甲醇稀釋至734 nm下吸光度為0.7左右,即A液。取100 μL適當稀釋的樣品提取液,加入3 mL A液于室溫下避光反應(yīng)30 min,測定734 nm下吸光值。以Trolox繪制標準曲線,蒸餾水為對照。ABTS自由基清除能力以干重計。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力的測定:參考He等[18]的方法。稱取11.8 mg DPPH,純甲醇定容至500 mL,即60 μmol·L-1B液。取200 μL適當稀釋的樣品提取液,加入3.8 mL B液,室溫下避光反應(yīng)30 min,于515 nm處測定吸光值。以Trolox繪制標準曲線,蒸餾水為對照。DPPH自由基清除能力以干重計。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析、鄧肯氏多重比較和相關(guān)性分析,顯著性水平為P<0.05。試驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙烯利濃度對大豆芽菜生理代謝的影響

由圖1可知:不同乙烯利濃度處理下大豆芽菜生長形態(tài)存在差異。對照大豆芽菜芽長最長,乙烯利處理后大豆芽菜生長受到抑制,且隨乙烯利濃度的增加,大豆芽菜下胚軸的縱向生長抑制程度增加,但對橫向生長先促進后抑制。當乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時,側(cè)根生長最為旺盛。此后繼續(xù)增加乙烯利濃度時,大豆芽菜整體生長逐漸受到顯著抑制。隨著乙烯利濃度增加,大豆芽菜鮮/干重比呈先增加后降低的趨勢,且當乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時,其鮮/干重比達到最大值,比對照增加18.25%(P<0.05),說明適宜的乙烯利濃度可有效促進大豆芽菜的鮮重累積。當乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時大豆芽菜的呼吸速率最高,比對照增加43.57%。而乙烯利濃度進一步增加時,大豆芽菜的呼吸速率與對照相比則無顯著性差異,說明一定濃度的乙烯利可有效提高大豆芽菜的呼吸速率和生長代謝水平。

圖1 乙烯利對大豆芽菜生長發(fā)育的影響Fig.1 Effects of ethephon on the growth and development of soybean sprouts不同小寫字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level among different treatments. The same as follows.

2.2 不同乙烯利濃度下大豆芽菜總酚和總黃酮含量變化

由圖2可知:大豆芽菜中總酚含量隨乙烯利濃度的增加呈先增加后降低的趨勢,當乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時總酚含量達到最大值,說明適宜的乙烯利可促進大豆芽菜中總酚的合成,但濃度過高時總酚合成會受到抑制。大豆芽菜中總黃酮含量與總酚含量變化基本一致。當乙烯利濃度為0.025和 0.050 mmol·L-1時,大豆芽菜中總黃酮顯著富集,比對照分別增加30.37%和30.43%,說明一定濃度的乙烯利可有效促進大豆芽菜中總黃酮的合成水平。

圖2 乙烯利對大豆芽菜總酚和總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ethephon on phenolics and flavonoids contents of soybean sprouts

2.3 不同乙烯利濃度下大豆芽菜異黃酮含量變化

由表1可知:大豆芽菜中總異黃酮含量變化趨勢與總黃酮基本一致,乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時總異黃酮含量達最大值。大豆芽菜中異黃酮組分,如:黃豆苷、染料木苷、黃豆苷元含量均在0.025 mmol·L-1乙烯利處理時達到最大值。丙二?；S豆苷含量在乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時達到最大值,比對照增加30.11%。丙二酰基黃豆黃苷和丙二?；玖夏拒蘸侩S乙烯利濃度增加均有不同程度地下降,說明一定濃度乙烯利處理可提高異黃酮總量,但對各組分的調(diào)控作用存在差異,主要表現(xiàn)為促進黃豆苷元、丙二?；S豆苷等組分的合成。

表1 乙烯利處理下大豆芽菜中異黃酮各組分含量Table 1 The individual isoflavone contents of soybean sprouts with different ethephon treatments

2.4 不同乙烯利濃度下大豆芽菜酚酸組成成分的變化

由表2可見:大豆芽菜中總酚酸含量在乙烯利濃度為0.025 mmol·L-1時達到最大值,比對照增加34.79%。當用0.050 mmol·L-1乙烯利處理后,大豆芽菜中結(jié)合酚酸和總酚酸比對照分別增加47.43%和16.48%。乙烯利濃度為0.500 mmol·L-1時,大豆芽菜中酚酸總量顯著低于對照,說明適宜乙烯利濃度可有效促進大豆芽菜中酚酸的富集,過高的乙烯利濃度對酚酸的合成會產(chǎn)生抑制作用。

表2 不同乙烯利濃度下大豆芽菜中酚酸含量的變化Table 2 The individual phenolic acid of soybean sprouts with different ethephon concentrations

乙烯利處理后大豆芽菜酚酸各組分含量變化趨勢不同。大豆芽菜中沒食子酸含量在乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時達到最大值;原兒茶酸在乙烯利濃度為0.025 mmol·L-1時顯著增加并達到最大值,比對照增加5.86%。當乙烯利濃度大于0.025 mmol·L-1時,原兒茶酸的合成受到抑制,含量顯著下降。在乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時,大豆芽菜中香草酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸含量均顯著增加,分別比對照增加1.17、0.49、0.68、2.88倍。大豆芽菜中對羥基苯甲酸含量極低,且丁香酸主要以游離態(tài)存在。

續(xù)表2 Table 2 continued

2.5 不同乙烯利濃度下大豆芽菜抗氧化能力的變化

由圖3可知:當乙烯利濃度為0.025和0.050 mmol·L-1時,大豆芽菜中ABTS和DPPH自由基清除能力均比對照顯著提高;而乙烯利濃度為0.500 mmol·L-1時,大豆芽菜的ABTS自由基清除能力受到抑制,說明一定濃度乙烯利可以有效提升大豆芽菜的抗氧化能力,但濃度過高時會影響大豆芽菜的生長發(fā)育,酚類物質(zhì)積累水平受到影響,從而降低自身抗氧化能力。

圖3 乙烯利對大豆芽菜抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of ethephon on the antioxidant ability of soybean sprouts ABTS:2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid;DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl.

經(jīng)0.050 mmol·L-1乙烯利處理的大豆芽菜,其游離酚、結(jié)合酚的ABTS、DPPH自由基清除能力均達到最大值,其中大豆芽菜中游離酚和結(jié)合酚的ABTS自由基清除能力分別是對照的1.1和1.3倍,DPPH自由基清除能力分別是對照的1.04和1.3倍。大豆芽菜中總酚主要以游離酚形式存在,經(jīng)0.05 mmol·L-1乙烯利處理后,其游離酚的ABTS、DPPH自由基清除能力顯著增加,是影響總酚抗氧化能力的重要因素。

3 討論

研究表明,大豆芽菜在發(fā)芽形成芽苗過程中,不僅保持部分原有營養(yǎng)成分,而且膳食纖維、γ-氨基丁酸(GABA)和酚類等功能成分大量累積,其營養(yǎng)和功能品質(zhì)均得到提高[19]。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度乙烯利處理對大豆芽菜的芽長、鮮/干重比、呼吸速率等生理指標均有顯著影響,且適宜濃度的乙烯利可增強大豆芽菜中細胞的生長代謝水平,改變外觀及營養(yǎng)品質(zhì)。劉紅開[8]研究表明乙烯利處理綠豆芽可促進綠豆芽下胚軸的橫向生長以及細胞壁的合成代謝,從而增加其體積和鮮重,改善外觀品質(zhì)及營養(yǎng)價值。此外,施加外源乙烯利可促進植物內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生,增加植物的呼吸強度[20]。Jiao等[16]研究發(fā)現(xiàn),一定濃度的乙烯利會引起藍莓內(nèi)源乙烯的積累,提高藍莓呼吸代謝速率,本研究結(jié)果與之相一致。

本研究表明,乙烯利不僅改善大豆芽菜的外觀品質(zhì),對其內(nèi)部酚類物質(zhì)的合成也有顯著影響,其中在乙烯利濃度為0.050 mmol·L-1時,大豆芽菜的總酚含量比對照增加7.26%,尤其結(jié)合酚比對照增加40%;總黃酮、異黃酮比對照分別增加30.43%、11.84%;酚酸中沒食子酸含量變化較大,比對照增加131.92倍。乙烯利(0.05 mmol·L-1)可調(diào)控大豆芽菜中酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶的活性,如PAL、POD、肉桂醇脫氫酶(CAD)等,促進酚類物質(zhì)的富集,顯著提高ABTS、DPPH自由基清除能力,增強植物自身抗氧化能力[21]。劉紅開[8]研究發(fā)現(xiàn),PAL活性與總酚含量成正相關(guān),綠豆芽經(jīng)乙烯利處理后PAL活性顯著提高,總酚含量顯著增加。Guo等[22]研究表明,大豆發(fā)芽5 d后,PAL基因表達水平顯著提高,內(nèi)源總酚和總黃酮大量富集。Tian等[23]發(fā)現(xiàn),發(fā)芽能夠提高燕麥酚類物質(zhì)的含量,歸因于谷物發(fā)芽時酶活性的提高。蕎麥萌發(fā)過程中可生成酚酸、黃酮等重要的植物次生代謝產(chǎn)物,主要通過苯丙烷代謝途徑合成,其中PAL是重要限速酶[24]。另有研究認為,PAL酶異構(gòu)體亞細胞定位的特異性可能和該酶的代謝活性調(diào)節(jié)密切相關(guān)[25]。因此,PAL作為苯丙烷代謝過程的關(guān)鍵限速酶,在酚類物質(zhì)合成途徑中具有重要作用。乙烯利可通過提高大豆芽菜中苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶活性,促進酚類物質(zhì)的富集以及自身抗氧化能力的提高。本研究表明,乙烯利可促進大豆芽菜中總酚、總黃酮及異黃酮的合成,其中黃豆苷、染料木苷、丙二?；S豆苷、黃豆苷元等異黃酮單一組分均比對照顯著增加,但丙二?；S豆黃苷和丙二?；玖夏拒盏暮坑兴档?說明乙烯利對大豆芽菜中異黃酮單一組分的富集作用存在差異。

綜上,濃度為0.050 mmol·L-1的乙烯利可促進大豆芽菜下胚軸的橫向生長,改善大豆芽菜的外觀品質(zhì),同時促進大豆芽菜中酚酸、黃酮等功能成分的累積,有效提高大豆芽菜的營養(yǎng)品質(zhì)。乙烯利濃度過高則會對大豆芽菜的生理代謝和酚類物質(zhì)合成產(chǎn)生抑制。乙烯利是否通過影響苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達調(diào)控酚類物質(zhì)的合成有待研究。