韓香臣，李小光，胡 欣

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一項(xiàng)能在單細(xì)胞水平上進(jìn)行無偏倚、高通量、高分辨率全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的新技術(shù)［1］。針對(duì)腫瘤組織等異質(zhì)性高的樣本，傳統(tǒng)的高通量測(cè)序技術(shù)只能提供樣本中所有細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的平均值，但單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以精準(zhǔn)描繪樣本中每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以幫助我們了解組織學(xué)意義相同細(xì)胞的差異，進(jìn)一步探究細(xì)胞類型已知的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征或發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型［2］。

國家癌癥中心2019年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌占全部女性癌癥的17.1%，位于中國女性癌癥發(fā)病率首位，嚴(yán)重威脅中國女性健康［3］。有研究［4］表明，乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，傳統(tǒng)的高通量測(cè)序技術(shù)不足以解決腫瘤異質(zhì)性等難題。將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌，不僅可以解決腫瘤異質(zhì)性問題，還能為闡明腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移播散、治療耐藥等問題提供新思路。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)概述

近10年來，得益于新技術(shù)的出現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的規(guī)模呈指數(shù)增長，費(fèi)用不斷降低［5］。2009年，Tang等［6］運(yùn)用單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)，將卵細(xì)胞中的mRNA無偏倚地反轉(zhuǎn)錄成長達(dá)3 kb的cDNA，基于二代測(cè)序SOLiD平臺(tái)，首次獲得了單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組圖譜，描繪了卵細(xì)胞中5 270個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本信息。然而，該技術(shù)只能描繪單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，應(yīng)用范圍有限。2011年，Islam等［7］研發(fā)了單細(xì)胞標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄（single-cell tagged reverse transcription，STRT）技術(shù)，先將細(xì)胞分離到96孔板中，再利用鏈轉(zhuǎn)化原理給每孔中的細(xì)胞加入孔特異性條形碼，因此STRT技術(shù)可描繪上百個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜。

近年來，得益于微流控、隨機(jī)捕獲和原位標(biāo)記等技術(shù)的出現(xiàn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)得以自動(dòng)化和商業(yè)化。以集成射流回路（integrated fluidic circuit，IFC）芯片［8］為例，IFC芯片可以連續(xù)地、精準(zhǔn)地將極小體積的液體轉(zhuǎn)移至反應(yīng)室中。將細(xì)胞捕獲至IFC芯片各反應(yīng)室后，后續(xù)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)步驟都可以在IFC芯片中完成。聯(lián)合IFC芯片技術(shù)，CEL-seq、SMART-seq等單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)得以自動(dòng)化，并可檢測(cè)成百上千個(gè)細(xì)胞。Drop-seq技術(shù)［9-10］則是將細(xì)胞捕獲至油滴中，后續(xù)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)步驟則在各個(gè)油滴中完成。兩股液流，一股包含單細(xì)胞懸液，另一股包含細(xì)胞裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑和帶有poly(T)反轉(zhuǎn)錄引物的磁珠，匯聚后被油滴捕獲。

目前，完整的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)可分為單細(xì)胞捕獲、單細(xì)胞RNA測(cè)序、數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析4個(gè)部分［11］。首先，腫瘤組織等樣本被制備成單細(xì)胞懸液，并被捕獲到液滴或芯片反應(yīng)室中，細(xì)胞裂解并釋放RNA。其中，帶有poly(A)尾的mRNA會(huì)與帶有唯一分子標(biāo)識(shí)符和細(xì)胞特異性標(biāo)簽的poly(T)引物結(jié)合。在經(jīng)歷反轉(zhuǎn)錄、第二鏈合成、cDNA擴(kuò)增、片段化、加測(cè)序接頭后，得到可用于高通量測(cè)序的文庫。基于細(xì)胞特異性標(biāo)簽，測(cè)序數(shù)據(jù)被拆解，并被映射到相應(yīng)的基因組上，構(gòu)建單細(xì)胞基因表達(dá)矩陣，該矩陣可應(yīng)用于下游分析［12］。

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)下游分析可分為細(xì)胞水平分析和基因水平分析兩大部分。細(xì)胞水平分析集中于聚類分析和軌跡推斷，基因水平分析則集中于尋找差異表達(dá)基因、基因富集分析和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［13］。

2.1 聚類分析

聚類分析是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析的第一步，可用于區(qū)分細(xì)胞類別［14］。運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)中的聚類分析方法，將基因表達(dá)譜相似的細(xì)胞歸為一類，每個(gè)類別的標(biāo)記基因還可用于描述類別特征或推斷細(xì)胞類型。目前，K均值聚類算法等無監(jiān)督聚類分析是主流分析方法，數(shù)據(jù)經(jīng)t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）［15］、主成分分析（principle component analysis，PCA）［16］、統(tǒng)一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）［17］等算法降維和可視化后，得到的圖形中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，鄰近的細(xì)胞則可認(rèn)為是同一類細(xì)胞。Peng等［18］對(duì)腫瘤患者的57 350個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，后續(xù)的聚類分析將這些細(xì)胞分為10個(gè)類別，并結(jié)合常見的細(xì)胞類型標(biāo)記基因，將這些細(xì)胞注釋為巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。

2.2 軌跡推斷

組織異質(zhì)性的發(fā)生、發(fā)展過程是動(dòng)態(tài)的，而軌跡推斷則是通過尋找使相鄰細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組差異最小的路徑，重建這個(gè)動(dòng)態(tài)過程［19］。Chen等［20］對(duì)來自腫瘤患者的48 584個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用Monocle算法［21］，推斷腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的分化軌跡：CD4+T淋巴細(xì)胞始于CD4+初始T淋巴細(xì)胞并向CD4+活化T淋巴細(xì)胞或失能T淋巴細(xì)胞兩個(gè)方向分化；CD8+T淋巴細(xì)胞則始于CD8+T淋巴細(xì)胞并向CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞或失能T淋巴細(xì)胞兩個(gè)方向分化。雖然軌跡推斷在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析中廣泛應(yīng)用，但應(yīng)注意細(xì)胞軌跡推斷的結(jié)果并不一定能代表真實(shí)的生物學(xué)進(jìn)程［22］。

2.3 基因集分析

分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)，可以找到許多差異表達(dá)基因，但其數(shù)量過多，反而阻礙我們解讀測(cè)序數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義。因此，可以基于這些基因的共同特征，將多個(gè)差異表達(dá)基因以基因集為單位分析，如基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）、基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析、基因本體（gene ontology，GO）分析等［23］。Azizi等［24］對(duì)乳腺癌患者的47 016個(gè)免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)差異表達(dá)基因中的環(huán)境刺激應(yīng)答相關(guān)基因富集分析，結(jié)果顯示，不同類型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞對(duì)Ⅰ、Ⅱ型干擾素、缺氧、失能的應(yīng)答模式不同，而不同類型CD4+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞對(duì)抗炎、耗竭、缺氧的應(yīng)答模式相同。

2.4 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過識(shí)別基因共表達(dá)模式可推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如SCENIC算法通過識(shí)別與轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)的基因以推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［25］。Chen等［20］對(duì)來自鼻咽癌患者的40 000個(gè)免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析提示，EOMES、RUNX3、XBP1等轉(zhuǎn)錄因子在自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，提示這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞毒作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，下調(diào)NK細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞中EOMES、RUNX3、XBP1的表達(dá)會(huì)降低顆粒酶B和穿孔素等細(xì)胞毒作用效應(yīng)分子的表達(dá)。

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在乳腺癌中的應(yīng)用

乳腺癌是一類異質(zhì)性高的腫瘤，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌研究，可以從全新的角度揭示乳腺腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移播散及治療耐藥等問題。

3.1 腫瘤異質(zhì)性

盡管目前對(duì)乳腺腫瘤異質(zhì)性已有初步了解，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分子分型和基于基因組測(cè)序的基因檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于指導(dǎo)乳腺癌個(gè)體化治療［26-27］，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在腫瘤增殖過程中，腫瘤細(xì)胞可表現(xiàn)出不同表型：干性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、侵襲、遷移、免疫浸潤、凋亡及缺氧等，這些表型在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移播散、治療耐藥過程中發(fā)揮重要作用［28］。然而，傳統(tǒng)的高通量測(cè)序無法保留這些腫瘤內(nèi)異質(zhì)性信息，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序則可解決腫瘤異質(zhì)性這一難題。Chung等［29］對(duì)不同分子分型乳腺癌患者的共515個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，數(shù)據(jù)表明，同一患者的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜相似性很低，在不同患者間，腫瘤細(xì)胞在干性、EMT、血管形成等方面都表現(xiàn)出高度異質(zhì)性。

3.2 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境主要由基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成，研究［30-32］表明，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma associated fibroblast，CAF）、腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞（tumor endothelial cell，TEC）、腫瘤浸潤免疫細(xì)胞等微環(huán)境組分與腫瘤生長、血管形成及腫瘤免疫調(diào)節(jié)等生物過程有關(guān)，因此，精準(zhǔn)描繪腫瘤微環(huán)境可以幫助我們尋找治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。Azizi等［24］分析了8例乳腺癌患者的腫瘤組織、正常組織、淋巴結(jié)及血液中的免疫細(xì)胞，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，來自不同部位的免疫細(xì)胞表型有明顯差異，提示血液中免疫細(xì)胞的生物標(biāo)志物不一定能反映腫瘤浸潤免疫細(xì)胞表型；且大部分腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的活化、終末分化、缺氧相關(guān)的信號(hào)呈不斷變化的趨勢(shì)。Lu等［33］分析了新輔助化療前后患者的腫瘤浸潤B淋巴細(xì)胞，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，可誘導(dǎo)共刺激分子配體（inducible costimulator ligand，ICOSL）+B淋巴細(xì)胞在新輔助治療后明顯增多，臨床隊(duì)列的免疫組織化學(xué)和預(yù)后數(shù)據(jù)也證實(shí)，ICOSL+B淋巴細(xì)胞在化療后明顯增多，且ICOSL+B淋巴細(xì)胞數(shù)目與臨床療效呈正相關(guān)，后續(xù)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，ICOSL+B淋巴細(xì)胞可激發(fā)T淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫，增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療的敏感性，提示ICOSL+B淋巴細(xì)胞可作為預(yù)后標(biāo)志物。

3.3 腫瘤轉(zhuǎn)移

腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的首要原因，未轉(zhuǎn)移患者的5年生存率高達(dá)98%，而轉(zhuǎn)移患者的5年生存率僅為27%［34］，且約30%的初治未轉(zhuǎn)移乳腺癌最終進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性乳腺癌［35］。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可解析原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的腫瘤異質(zhì)性和免疫微環(huán)境，幫助我們研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制。目前腫瘤轉(zhuǎn)移的主流猜想是：少數(shù)有“干細(xì)胞”能力的腫瘤細(xì)胞播種到遠(yuǎn)處導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。Lawson等［36］對(duì)乳腺癌人源腫瘤異種移植模型的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，數(shù)據(jù)表明，低腫瘤負(fù)荷小鼠轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜和干細(xì)胞相似，高表達(dá)干性、EMT、促生存和休眠相關(guān)基因；而高腫瘤負(fù)荷小鼠轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜和原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞相似，異質(zhì)性高并高表達(dá)分化相關(guān)基因，提示少數(shù)干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移。

3.4 治療耐藥

化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療、免疫治療耐藥的出現(xiàn)是乳腺癌治療的難題，許多患者最初對(duì)藥物敏感但后續(xù)對(duì)藥物抵抗，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。聯(lián)合治療前后的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床預(yù)后數(shù)據(jù)，可以研究腫瘤耐藥機(jī)制，并尋找合適的預(yù)后標(biāo)志物。Kim等［37］對(duì)三陰性乳腺癌患者新輔助化療前后的腫瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，GSVA顯示，化療抵抗患者AKT1、CDH1、缺氧、EMT、血管形成等信號(hào)在化療后明顯上調(diào)，臨床隊(duì)列數(shù)據(jù)證實(shí)，化療后AKT1和缺氧信號(hào)上調(diào)患者預(yù)后更差，提示AKT1和缺氧信號(hào)可作為預(yù)后標(biāo)志物。

4 結(jié)語

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是一項(xiàng)有應(yīng)用前景的高通量、高分辨率測(cè)序技術(shù)，可以幫助我們探索乳腺癌的腫瘤異質(zhì)性、免疫微環(huán)境、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及治療耐藥等問題。雖然現(xiàn)在該技術(shù)仍有許多局限性：只能檢測(cè)活細(xì)胞樣本、細(xì)胞數(shù)目要求高、費(fèi)用較高，但是可以提高細(xì)胞捕獲效率以減少細(xì)胞投入量，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法以適用于多種樣本，研發(fā)分析方法以挖掘更多信息，甚至可以與單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，多角度揭示乳腺癌的生物學(xué)過程。